劉坤友 周 艷 陳桂生 劉鳳玲 李 明

(1 廣西柳江縣人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，柳江縣 545100，E-mail：Ljrylky@163.com；2 廣西壯族自治區(qū)疾病預(yù)防控制中心，南寧市 530028)

苦丁茶和小飛揚(yáng)草對多重耐藥性大腸桿菌外排泵acrA基因表達(dá)的影響▲

劉坤友1周 艷2陳桂生1劉鳳玲1李 明1

(1 廣西柳江縣人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，柳江縣 545100，E-mail：Ljrylky@163.com；2 廣西壯族自治區(qū)疾病預(yù)防控制中心，南寧市 530028)

目的 探討苦丁茶、小飛揚(yáng)草水提物對多重耐藥性大腸桿菌外排泵acrA基因表達(dá)的影響。方法 用紙片擴(kuò)散法篩選多重耐藥性大腸桿菌，試管二倍稀釋法檢測苦丁茶、小飛揚(yáng)草水提物和阿莫西林對多重耐藥菌株的最低抑菌濃度(MIC)，用1/2 MIC濃度的苦丁茶、小飛揚(yáng)草水提物干預(yù)多重耐藥菌株，72 h后檢測阿莫西林的MIC；選取苦丁茶和小飛揚(yáng)草干預(yù)前后的耐藥菌株進(jìn)行熒光實(shí)時(shí)定量PCR檢測外排泵基因acrA mRNA的表達(dá)。結(jié)果 篩選出3株多重耐藥性大腸桿菌，苦丁茶或小飛揚(yáng)草干預(yù)后阿莫西林對多重耐藥株的MIC明顯低于干預(yù)前(P<0.05)；苦丁茶或小飛揚(yáng)草干預(yù)后acrA mRNA的表達(dá)量均較干預(yù)前明顯降低(P<0.05)。結(jié)論 苦丁茶和小飛揚(yáng)草對多重耐藥性大腸桿菌有明顯抑制作用，其機(jī)制可能是與通過降低多重耐藥性大腸桿菌外排泵acrA基因mRNA的表達(dá)量有關(guān)。

大腸桿菌；多重耐藥；苦丁茶；小飛揚(yáng)草；外排泵；acrA基因

大腸桿菌廣泛分布于自然界，其大部分血清型是腸道正常菌群，但一些特殊血清型的大腸桿菌對人和動物有致病性，常引起嬰兒和幼畜(禽)嚴(yán)重腹瀉和敗血癥。近年來，由于抗生素的不合理使用，大腸桿菌對抗生素耐藥的問題越來越突出，多重耐藥率越來越高，這降低治療效果，增加治療成本，已成為全球的公共衛(wèi)生問題之一。致病性大腸桿菌感染在社區(qū)及醫(yī)院中多為散發(fā)病例，治療較為困難，如有交叉感染可造成暴發(fā)流行，對嬰幼兒、免疫缺陷者和老年人造成嚴(yán)重威脅[1]。因此，大腸桿菌的多重耐藥機(jī)制已成為一個研究熱點(diǎn)。細(xì)菌外排泵在多重耐藥中起重要作用。本研究旨在探討苦丁茶、小飛揚(yáng)草對多重耐藥大腸桿菌株外排泵基因的作用，從而為逆轉(zhuǎn)耐藥、降低多重耐藥率提供參考?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源及實(shí)驗(yàn)材料 2014年1月至2015年5月廣西柳江縣人民醫(yī)院、柳州市疾病預(yù)防控制中心門診部初診、未使用抗生素治療的腹瀉、腹痛患者385例，收集其糞便，按常規(guī)分離、培養(yǎng)大腸植菌，經(jīng)生物梅里埃公司-梅里埃中國VITEK AMS 60系統(tǒng)鑒定為大腸埃希菌。本實(shí)驗(yàn)所用的氧氟沙星、紅霉素、四環(huán)素、青霉素、阿莫西林的標(biāo)準(zhǔn)藥敏紙片均由杭州天和微生物試劑有限公司提供?？喽〔韬托★w揚(yáng)草、阿莫西林分散片(規(guī)格0.25 g/片，批號20130171)購自石藥集團(tuán)中諾藥業(yè)有限公司。以大腸埃希菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC25922作質(zhì)量控制菌株，由廣東省微生物種質(zhì)資源庫提供。Trizol試劑盒購自上海Invitrogen公司；RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit和DNase I購自Fermentas公司；2×SYBR Green qPCR Mix購自北京莊盟有限公司。PCR上游引物為5′-GTTCGTCCTCAAGTTAGCG-3′，下游引物為5′-GTCACCAGCCACTTATCG-3′；內(nèi)參上游引物為5′-ATCAACGACCTGTTAGACG-3′，下游引物為5′-ACAGACCAGTTGCTTCAG-3′，由上海生物工程技術(shù)服務(wù)公司合成。

1.2 多重耐藥株的篩選 (1)稱取Mueller-Hinton(M-H)瓊脂38 g、蒸餾水1 L，高壓滅菌后按25 ml/平皿(直徑約9 mm)進(jìn)行分裝。(2)菌種孵育16～24 h后，分別接種于生理鹽水試管中，校正濃度至0.5麥?zhǔn)蠘?biāo)準(zhǔn)(相當(dāng)于1.0×108CFU/ml)。(3)用無菌棉簽蘸取菌液，在試管內(nèi)壁旋轉(zhuǎn)擠去多余菌液，然后在M-H瓊脂表面均勻涂布3次接種，每次旋轉(zhuǎn)平板60°，最后沿平板內(nèi)緣涂抹1圈。(4)將M-H瓊脂平板在室溫下干燥3～5 min，再用無菌鑷子將藥物紙片緊貼于瓊脂表面，置于35℃恒溫箱內(nèi)孵育16～18 h，觀察并記錄抑菌圈的直徑。(5)藥敏試驗(yàn)用紙片擴(kuò)散法，按照美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)委員會制訂的操作步驟[2]，重復(fù)操作3次，取3次的平均值為該藥敏紙片的抑菌直徑，青霉素、紅霉素藥敏紙片抑菌直徑<13 mm為耐藥，氧氟沙星、四環(huán)素藥敏紙片抑菌直徑≥12 mm為耐藥，阿莫西林紙片抑菌直徑<10 mm為耐藥，3種或3種以上抗生素耐藥的菌株，確定為多重耐藥株。

1.3 苦丁茶、小飛揚(yáng)草水提物制備 采用煮沸法提取藥液[3-4]，稱取干燥的苦丁茶50 g，加水過藥面浸泡30 min，武火煮沸后用文火煎煮，文火煎煮時(shí)間第1次為1.5 h，第2次為40 min，第3次為30 min，分別濾取煮液，將3次藥液合并后濃縮至100 ml(相當(dāng)于0.5 g/ml生藥)；再取濃縮液40 ml，文火將其濃縮為5 ml濃縮液(相當(dāng)于4.0 g/ml生藥)，滅菌備用。小飛揚(yáng)草水提物制備方法同苦丁茶。

1.4 最低抑菌濃度檢測 采用二倍稀釋法[2]測定苦丁茶、小飛揚(yáng)草水提物和阿莫西林對大腸桿菌的最低抑菌濃度(minimum inhibitory concentration，MIC)。用肉湯培養(yǎng)基和苦丁茶、小飛揚(yáng)草水提液混合配置濃度分別為2.0 g/ml、1.0 g/ml、0.5 g/ml、0.25 g/ml，肉湯培養(yǎng)基和阿莫西林混合配置濃度分別為16 μg/ml、32 μg/ml、64 μg/ml、128 μg/ml，從篩選出來的多重耐藥菌中選取3株，校正濃度至 0.5麥?zhǔn)蠘?biāo)準(zhǔn)(相當(dāng)于1.0×108CFU/ml)，取多重耐藥菌株菌液1 μl(相當(dāng)于1.0×105CFU/ml)和含藥液的培養(yǎng)基混合培養(yǎng)24 h，用棉簽取培養(yǎng)液涂布于M-H瓊脂平板，觀察菌落生長情況，根據(jù)是否有生長判斷MIC。

1.5 苦丁茶和小飛揚(yáng)草水提物作用前、后對多重耐藥株的藥敏試驗(yàn) 上述檢測阿莫西林對多重耐藥的MIC即苦丁茶和小飛揚(yáng)草水提物作用前阿莫西林對多重耐藥菌株的MIC；將篩選的3株多重耐藥菌株分別經(jīng)1/2 MIC濃度的苦丁茶和小飛揚(yáng)草水提物干預(yù)72 h，方法同“1.4”。取誘導(dǎo)培養(yǎng)后的耐藥菌株檢測阿莫西林的MIC即苦丁茶和小飛揚(yáng)草水提物作用后阿莫西林對多重耐藥菌株和標(biāo)準(zhǔn)菌株的MIC。同時(shí)設(shè)立陰性對照組，該組是用培養(yǎng)液誘導(dǎo)標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC25922，測定阿莫西林對多重耐藥菌株和標(biāo)準(zhǔn)菌株的MIC。

1.6 熒光實(shí)時(shí)定量PCR檢測

1.6.1 RNA抽提：按照RNA按照試劑盒說明書進(jìn)行提取苦丁茶和小飛揚(yáng)草水提取物干預(yù)前、后耐藥菌株總RNA。

1.6.2 反轉(zhuǎn)錄：20.0 ml反應(yīng)體系，在0.2 ml PCR管中加入5 ml總RNA、1 ml引物(0.2 mg/ml)、5 ml雙蒸水，70℃溫浴5 min，冰浴10 s，10 000 r/min離心1 min，加入4.0 ml緩沖液、2.0 ml三磷酸脫氧核苷(10 mmol/L)、1.0 ml RNA酶抑制劑(20 U/ml)、2.0 ml反轉(zhuǎn)錄酶(10 U/ml)，37℃溫浴5 min，42℃溫浴60 min，70℃溫浴10 min，終止反應(yīng)，將上述溶液-20℃保存。

1.6.3 熒光定量PCR檢測：cDNA樣品稀釋到1/6，反應(yīng)體系20 ml，把10 ml SYBRGreen qPCR Master Mix、1 ml上游引物(10 μM)、1 ml下游引物(10 μM)、7 ml ddH2O、1 ml cDNA混合配制反應(yīng)混合液；熱循環(huán)反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性2 min，95℃變性10 s，60℃退火40 s，共40個循環(huán)。

1.6.4 計(jì)算目的基因的相對表達(dá)量：采用2-△△CT法[5]對熒光實(shí)時(shí)定量PCR的數(shù)據(jù)進(jìn)行相對定量分析，計(jì)算公式為：△CT=CT目的基因-CT內(nèi)參基因；△△CT=△CT目的基因-對照組目的基因△CT平均值；采用2-△△CT表示目的基因的相對表達(dá)量。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPASS 11.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以(x±s)表示，兩組均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 多重耐藥篩選結(jié)果 篩選出3株多重耐藥，均表現(xiàn)為對青霉素、紅霉素、四環(huán)素和阿莫西林耐藥，分別命名為多重耐藥菌株1、2、3。

2.2 苦丁茶對、小飛揚(yáng)草水提物對多重耐藥的MIC 苦丁茶、小飛揚(yáng)草水提物對多重耐藥菌株1、2的MIC均高于誘導(dǎo)標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC25922的MIC，對多重耐藥菌株3的MIC和標(biāo)準(zhǔn)菌株一致。見表1。

表1 苦丁茶和小飛揚(yáng)草水提物對多重耐藥菌株的MIC(g/ml)

2.3 苦丁茶、小飛揚(yáng)草水提物干預(yù)前后阿莫西林對多重耐藥菌株的MIC 苦丁茶、小飛揚(yáng)草水提物干預(yù)前，以及陰性對照組阿莫西林對多重耐藥菌株的MIC均為64 μg/ml；苦丁茶、小飛揚(yáng)草水提物干預(yù)后，對阿莫西林多重耐藥株的MIC明顯低于干預(yù)前(苦丁茶t=8.582，P<0.001；小飛揚(yáng)草t=9.376，P<0.001)，見表2。

表2 苦丁茶和小飛揚(yáng)草水提物干預(yù)前后阿莫西林對多重耐藥株的MIC(μg/ml)

2.4 苦丁茶和小飛揚(yáng)草水提物干預(yù)前后多重耐藥菌株acrA mRNA的表達(dá) 苦丁茶和小飛揚(yáng)草干預(yù)后acrA mRNA的表達(dá)量均較干預(yù)前明顯降低(苦丁茶t=3.545，P=0.024；水飛揚(yáng)草t=3.102，P=0.038)，見表3。

表3 苦丁茶和小飛揚(yáng)草水提物干預(yù)前后多重耐藥菌株acrA基因mRNA的表達(dá)(2-△△CT)

3 討 論

由于抗生素不合理使用引起的細(xì)菌耐藥，已成為21世紀(jì)威脅人類生命健康的最重要元兇之一。實(shí)驗(yàn)證實(shí)，清熱解毒類中藥的抗菌作用較強(qiáng)，被稱為植物性抗生素，如黃連、黃芩、黃柏、板藍(lán)根、夏枯草、連翹、丹皮、虎杖、貫眾等[4]。我國的中草藥資源豐富，細(xì)菌、病毒等病原體不容易對其產(chǎn)生耐藥性，具有良好的臨床應(yīng)用前景。有學(xué)者認(rèn)為從天然藥物中尋找高效低毒的抗菌成分，研發(fā)新的抗菌藥物，這可能是解決細(xì)菌多重耐藥的新途徑[6]。

苦丁茶性味苦甘，具有清熱涼血、驅(qū)散風(fēng)熱、消除煩渴、滋養(yǎng)肝腎之功效，臨床上可用于治療痢疾、腹瀉、熱病煩渴、牙痛目赤等病癥。藥物化學(xué)分析表明，苦丁茶的抗菌成分主要為咖啡酸甲酯、香草醛、沒食子酸、咖啡酸、β-谷甾醇、對羥基苯甲醛、阿魏酸等[7]。有實(shí)驗(yàn)證明，苦丁茶對甲鏈球菌、肺炎球菌、乙型鏈球菌、白喉?xiàng)U菌、痢疾桿菌、金黃色葡萄球菌、銅綠色假單胞菌、大腸桿菌、卡他球菌等有抑制作用，灌服苦丁茶水提物能明顯提高大腸桿菌、痢疾桿菌、肺炎桿菌及乙鏈球菌感染小鼠的存活率[8]。

小飛揚(yáng)草味辛、酸，性涼，有小毒。有清熱解毒、利濕止癢、通乳之功效，臨床常用于肺癰、乳癰、疔瘡腫毒、痢疾、泄瀉、熱淋等病證。實(shí)驗(yàn)證明，小飛揚(yáng)草對大腸桿菌、枯草桿菌、抗幽門螺桿菌等有較強(qiáng)的抑制作用[9-10]。

本課題組在前期研究中發(fā)現(xiàn)苦丁茶和小飛揚(yáng)草對多重耐藥大腸桿菌有明顯的抑制作用[11]。目前尚無關(guān)于苦丁茶和小飛揚(yáng)草通過調(diào)控外排泵基因抑制或殺滅大腸桿菌的報(bào)告。細(xì)菌外排泵是病原微生物將體內(nèi)的有毒物質(zhì)運(yùn)到細(xì)胞外環(huán)境的一種跨膜蛋白質(zhì)，抗生素很容易誘導(dǎo)細(xì)菌外排泵超表達(dá)，使細(xì)菌在不利環(huán)境中生存繁殖[12]。具有超表達(dá)外排泵的菌株還可導(dǎo)致其他抗菌藥物作用靶點(diǎn)的變異，使細(xì)菌發(fā)生多重耐藥，可見細(xì)菌外排泵超表達(dá)是形成細(xì)菌多重耐藥的重要機(jī)制之一。大腸桿菌藥物外排泵較多達(dá)37種[13]，其中AcrAB-TolC外排泵是在大腸埃希菌中占絕對優(yōu)勢的外排泵，在大腸桿菌中廣泛存在，其能將抗菌藥物、有機(jī)溶劑、染料等排出細(xì)菌體外[14]。有實(shí)驗(yàn)表明，外排泵被抑制后，細(xì)菌可重新恢復(fù)對抗菌藥物的敏感性，這為研制抗耐藥菌藥物提供了新的思路。排泵抑制劑的作用機(jī)制可能有3條途徑,一是干擾外排泵組裝，二是阻斷外排泵能量來源，三是阻礙底物通過外排通道[15]。本文結(jié)果顯示，苦丁茶或小飛揚(yáng)草干預(yù)后阿莫西林對多重耐藥株的MIC明顯低于干預(yù)前(P<0.05)；苦丁茶和小飛揚(yáng)草干預(yù)后acrA mRNA的表達(dá)量均較干預(yù)前明顯降低(P<0.05)，說明苦丁茶和小飛揚(yáng)草對多重耐藥性大腸桿菌具有較好的抑菌作用，其機(jī)制可能是下調(diào)外排泵acrA mRNA表達(dá)，促使菌體內(nèi)藥物外排量減少、儲存量增加，從而提高大腸桿菌對藥物的敏感性。這與Xu等[13-14]的報(bào)告結(jié)果相符。不同菌株acrA mRNA的表達(dá)量不盡相同，這可能與菌株的差異有關(guān)，也可能還與外排泵的其他調(diào)控基因有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)沒有檢測大腸桿菌的全部外排泵基因，今后將進(jìn)一步增加外排泵基因的研究，為解決大腸桿菌多重耐藥性問題提供更加充實(shí)的參考。

[1] 李 耘,呂 媛,薛 峰,等.衛(wèi)生部全國細(xì)菌耐藥監(jiān)測網(wǎng)(Mohnarin)2011-2012年革蘭陰性菌耐藥監(jiān)測報(bào)告[J].中國臨床藥理學(xué)雜志,2014,30(3):260-277.

[2] 馬 越,李景云,金少鴻.美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)委員會推薦藥敏試驗(yàn)操作方法和判斷標(biāo)準(zhǔn)(2005年修訂版)[J].中華醫(yī)學(xué)雜志,2005,85(17):1 182-1 184.

[3] 徐叔云,卞如濂,陳 修.藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)方法[M].北京:人民衛(wèi)生出版,2002:911.

[4] 黃衍強(qiáng),黃宏思,張 蓮,等.6種中草藥抗耐藥性大腸桿菌的抑菌效果[J].右江民族醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2009,31(3):368-369.

[5] 宋國華,高繼萍,王春芳,等.相對定量2-△△CT法分析Caspase-3和Caspase-9在氟誘導(dǎo)大鼠腎臟中的表達(dá)[J].毒理學(xué)雜志,2014,28(4):274-278.

[6] 張 民.細(xì)菌耐藥背景下的中藥抗菌作用探析[J].西部中醫(yī)藥,2013,26(6):122-124.

[7] 左文健,陳惠琴,李曉東,等.苦丁茶葉的化學(xué)成分研究[J].中草藥,2011,42(1):18-20.

[8] 蔡 鵑,黃敏桃,黃云峰,等.廣西苦丁茶不同活性部位抑菌活性研究[J].中成藥,2014,36(1):198-201.

[9] 張 煜,王彥峰,王江濤.五十種廣西常用壯藥抗幽門螺桿菌感染的篩選研究[J].江西中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2009,21(5):66-68.

[10]黃衍強(qiáng),黃干榮,李曉華,等.中藥提取物對耐藥幽門螺桿菌生物膜形成的影響[J].醫(yī)藥導(dǎo)報(bào),2013,32(11):1 407-1 409.

[11]劉坤友.7種壯藥抗耐藥性大腸桿菌的抑菌效果[J].廣西醫(yī)學(xué),2012,34(11):1 556,1 563.

[12]Schlisselberg DB,Kler E,Kisluk G,et al.Biofilm formation ability of Salmonella enterica serovar Typhimurium acrAB mutants[J].Int J Antimicrob Agents,2015,46(4):456-459.

[13]Xu B,Li C,Zheng Y,et al.Simulated microgravity affects ciprofloxacin susceptibility and expression of acrAB-tolC genes in E.coli ATCC25922[J].Int J Clin Exp Pathol,2015,8(7):7 945-7 952.

[14]朱莉麗.大腸埃希菌多重耐藥外排泵AcrAB-Tolc主動外排機(jī)制的研究[D].天津:天津醫(yī)科大學(xué),2013.

[15]劉憶霜,肖春玲.細(xì)菌多重耐藥外排泵抑制劑研究進(jìn)展[J].中國抗生素雜志,2007,32(4):211-216,244.

Effect of broadleaf holly leaf and thymifolious euphorbia herb on efflux pumps acrA gene expression of multidrug-resistantEscherichiacoli

LIUKun-you1,ZHOUYan2,CHENGui-sheng1,LIUFeng-ling1,LIMing1

(1Departmentof,thePeople′sHospitalofLiujiangCounty,Liujiang545100,China; 2Departmentof,GuangxiCenterforDiseasePreventionandControl,Nanning530028,China)

Objective To explore the effect of broadleaf holly leaf and thymifolious euphorbia herb extracts on efflux pumps acrA gene expression of multidrug-resistantEscherichiacoli.Methods The multidrug-resistantEscherichiacoliwas screened using disk diffusion test.The minimal inhibitory concentrations(MIC) of broadleaf holly leaf extracts,thymifolious euphorbia herb extracts and amoxicillin for multidrug-resistant bacterial strains were detected by tube double dilution method.The multidrug-resistant bacterial strains were treated by the extracts of broadleaf holly leaf or thymifolious euphorbia herb with the concentration of 1/2 MIC,and then the MIC of amoxicillin was detected 72 hours later.The expression of efflux pumps gene acrA mRNA was detected in multidrug-resistant bacterial strains before and after being treated with broadleaf holly leaf or thymifolious euphorbia herb using quantitative real-time PCR.Results Three strains of multidrug-resistantEscherichiacoliwere screened.MIC of amoxicillin for multidrug-resistant bacterial strains was significantly lower after intervention with broadleaf holly leaf or thymifolious euphorbia herb compared to that before intervention(P<0.05).The expression of acrA mRNA after intervention with broadleaf holly leaf or thymifolious euphorbia herb was significantly lower than that before intervention(P<0.05).Conclusion Broadleaf holly leaf and thymifolious euphorbia herb can obviously inhibit multidrug-resistantEscherichiacoli.And the mechanism may be related to the inhibition on the expression of efflux pumps acrA gene in multidrug-resistantEscherichiacoli.

Escherichiacoli,Multidrug-resistance,Broadleaf holly leaf,Thymifolious euphorbia herb,Efflux pumps,acrA gene

廣西醫(yī)藥衛(wèi)生科研課題(Z2010047)

劉坤友(1973～)，男，本科，副主任技師，研究方向：醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)。

周艷(1969～)，研究生，副主任技師，研究方向：微生物檢驗(yàn)與質(zhì)量控制、公共衛(wèi)生管理與人力資源管理，E-mail：149024033@qq.com。

R 284

A

0253-4304(2016)02-0207-04

10.11675/j.issn.0253-4304.2016.02.17

2015-10-18

2016-01-20)