馬 茜 王 辛 朱 潔 王愛紅

(南京中醫(yī)藥大學護理學院，南京市 210023，E-mail：15298384973@163.com)

不同劑量特制牛肉湯對腦缺血大鼠神經(jīng)保護作用及其外周血T淋巴細胞亞群的影響▲

馬 茜 王 辛 朱 潔 王愛紅

(南京中醫(yī)藥大學護理學院，南京市 210023，E-mail：15298384973@163.com)

目的 探討不同劑量特制牛肉湯對局灶性腦缺血大鼠外周血T淋巴細胞亞群免疫活性的影響。方法 將48只雄性SD大鼠分成假手術(shù)組 Ⅰ、假手術(shù)組 Ⅱ、模型組及低、中、高劑量特制牛肉湯組各8只。模型組和各劑量特制牛肉湯組以線栓法建立永久性右側(cè)大腦中動脈缺血模型。低、中、高劑量特制牛肉湯組于造模后分別予200、400、600 mg/(kg·d)特制牛肉湯灌胃，假手術(shù)組Ⅱ予600 mg/(kg·d)特制牛肉湯，其余兩組予等量生理鹽水。分別于術(shù)后2 h及7 d采用Longa評分法進行神經(jīng)功能缺損評分，并檢測外周血T淋巴細胞亞群(CD3+、CD4+、CD8+)水平，計算CD4+/CD8+值；于術(shù)后7 d采用2，3，5-三苯基氯化四氮唑染色法測定腦梗死體積分數(shù)。結(jié)果 術(shù)后2 h和7 d，6組神經(jīng)功能缺損評分，差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。術(shù)后7 d，假手術(shù)組Ⅰ和假手術(shù)組Ⅱ大鼠腦組織均未見梗死灶，模型組和各劑量特制牛肉湯組均可見梗死灶，中、高劑量特制牛肉湯組的腦梗死體積分數(shù)較模型組明顯降低(P<0.05)。模型組外周血CD3+、CD4+水平及CD4+/CD8+值明顯低于假手術(shù)組Ⅰ(P<0.05)；與模型組相比，高劑量特制牛肉湯組外周血CD3+水平升高(P<0.05)，低、中、高劑量特制牛肉湯組外周血CD4+水平升高(P均<0.05)。兩組假手術(shù)組在腦梗死體積和外周血T淋巴細胞亞群水平方面比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。結(jié)論 特制牛肉湯可改善腦缺血大鼠的神經(jīng)功能，對外周免疫抑制有調(diào)節(jié)作用，其機制可能與其升高外周血CD3+、CD4+水平有關(guān)。

腦缺血；特制牛肉湯；T淋巴細胞亞群；腦梗死體積；神經(jīng)功能評分；大鼠

卒中后感染是腦卒中患者急性期和后遺癥期最常見的并發(fā)癥[1]，是導致卒中患者預后不良和死亡的主要原因[2-3]。卒中誘發(fā)的免疫抑制綜合征(stroke-induced immunodepression syndrome，SIDS)在卒中后感染的發(fā)生中發(fā)揮重要作用[4]，而T淋巴細胞免疫功能下降是其主要表現(xiàn)之一[5]。肌肽是一種有效的免疫調(diào)節(jié)劑，可提高T淋巴細胞亞群表達，改善腦缺血后免疫抑制狀態(tài)[6]。本課題組前期在朱丹溪“倒倉法”的基礎(chǔ)上，開發(fā)簡易食療方—特制牛肉湯，經(jīng)游離氨基酸含量檢測，其中富含肌肽，動物實驗顯示，特制牛肉湯可減輕腦缺血后免疫炎癥反應[7]。本研究觀察富含肌肽的特制牛肉湯對腦缺血大鼠的神經(jīng)保護作用及對外周血T淋巴細胞亞群的影響，擬進一步探討其對腦缺血大鼠的免疫調(diào)節(jié)作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康雄性SD大鼠48只，SPF級，體質(zhì)量(300±20)g，由南京中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供，合格證號：SCXK(京)2012-0001。實驗前適應性飼養(yǎng)1周，溫度控制在19℃～26℃，12 h明暗循環(huán)，自由飲水和進食，造模前禁食12 h。

1.2 特制牛肉湯的制備 參照前期方法制備特制牛肉湯[7]：將2 L室溫水和絞好的1 kg牛肉糜加入鍋中，利用功率轉(zhuǎn)換器使牛肉湯在2 h時沸騰，然后繼續(xù)熬制10 h，后撇去浮油，用紗布過濾渣滓，得到約1 500 ml特制牛肉湯，再用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮25倍，最終得到濃縮特制牛肉湯約60 ml。經(jīng)S-433D氨基酸分析儀分析，濃縮特制牛肉湯中肌肽含量為36.34 mg/ml。

1.3 主要試劑 2，3，5-三苯基氯化四氮唑(2，3，5-triphenyltetrazolium chloride，TTC)由美國Sigma公司生產(chǎn)(批號：101328055)，Anti-rat CD3(別藻藍蛋白，allophycocyanin，APC)抗體由美國Bioscience公司生產(chǎn)(批號：17-0030-82)，Anti-rat CD4(異硫氰酸熒光素，fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC)抗體由美國Biolegend公司生產(chǎn)(批號：201505)，Anti-rat CD8(藻紅蛋白，phycoerythrin，PE)抗體由美國Biolegend公司生產(chǎn)(批號：201705)。

1.4 主要儀器 FC500MPL流式細胞儀(美國Beckman公司)，Allegra 64R高速冷凍離心機(美國Beckman公司)，RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮儀器公司)，CNP-9050恒溫隔水培養(yǎng)箱(上海精宏儀器公司)。

1.5 腦缺血模型制備及術(shù)后給藥 應用隨機數(shù)字表法將大鼠分為假手術(shù)組Ⅰ，假手術(shù)組Ⅱ，模型組及低、中、高劑量特制牛肉湯組，每組8只。采用Longa等[8]的線栓法制作大鼠永久性右側(cè)大腦中動脈閉塞(permanent middle cerebral artery occlusion，pMCAO)模型，大鼠術(shù)后單籠飼養(yǎng)，自由進食和飲水。假手術(shù)組只分離血管，不插入線栓，其余步驟同模型組。特制牛肉湯劑量的確定以湯中肌肽含量為標準，根據(jù)《保健食品學功能評價方法》[9]及動物與人劑量換算方法[10]，低、中、高劑量分別為200、400、600 mg/(kg·d)，相當于人體推薦攝入量的10倍、20倍和30倍。假手術(shù)組Ⅰ和模型組給予等容積生理鹽水，假手術(shù)組Ⅱ給予高劑量特制牛肉湯。首次灌胃時間為術(shù)后2 h，之后每天上午9 ∶00和下午15 ∶00各灌胃1次，持續(xù)7 d。

1.6 檢測指標及方法

1.6.1 神經(jīng)功能缺損評分：采用Longa等[8]的評分方法，于大鼠pMCAO術(shù)后2 h和7 d進行神經(jīng)功能缺損評分。評分標準為：0分，無神經(jīng)功能缺失，活動正常；1分，提尾倒懸時不能完全伸展左側(cè)前爪；2分，爬行時向左側(cè)轉(zhuǎn)圈；3分，爬行時向左側(cè)傾倒；4分，不能自發(fā)行走，出現(xiàn)意識障礙。得分越高表明神經(jīng)功能缺損程度越重，相反損害較輕。術(shù)后2 h大鼠清醒后評分1～3分者為pMCAO模型制作成功，0分、4分者均視為造模失敗，剔除。

1.6.2 TTC染色測量腦梗死體積分數(shù)：術(shù)后7 d，將每組6只大鼠用10%水合氯醛腹腔注射麻醉，在冰皿上斷頭取腦，放入-20℃冰箱冰凍20 min，后放入專用腦切片模具中，去除嗅球和低位腦干，間隔2 mm連續(xù)冠狀切片5片，將腦片置入2% TTC溶液中，在37℃條件下避光孵育30 min，每隔10 min翻片1次，以保證染色均勻。再將染好的腦片置于4%多聚甲醛中固定24 h，用數(shù)碼相機拍照，Image Pro-Plus 6.0 圖像處理軟件分析圖像。腦梗死體積分數(shù)(%)=患側(cè)梗死面積/對側(cè)半腦面積×100%。

1.6.3 外周血T淋巴細胞亞群(CD3+、CD4+、CD8+)檢測：術(shù)后7 d，將每組8只大鼠用10 %水合氯醛腹腔注射麻醉，仰臥位固定，左心室取血至抗凝管中，再吸取100 μl到流式管中，向每個流式管中分別加入CD3抗體1.25 μl，CD4抗體0.5 μl及CD8抗體1.25 μl，室溫避光孵育20 min。再加2 ml 1×紅細胞裂解液，室溫避光孵育10 min。后以1 500 r/min 離心3 min后棄去上清，加入2 ml磷酸鹽緩沖液，輕輕吹打渦旋，再次以1 500 r/min離心3 min后棄去上清，最后加入200 μl 磷酸鹽緩沖液，采用流式細胞儀檢測T淋巴細胞亞群(CD3+、CD4+、CD8+)水平，并計算CD4+/CD8+值。

1.7 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計學分析，符合正態(tài)分布的計量資料用(x±s)表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t檢驗；非正態(tài)分布的計量資料以中位數(shù)(P25～P75)表示，組間比較采用Kruskal-Wallis檢驗。以P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠神經(jīng)功能缺損評分比較 假手術(shù)組Ⅰ和假手術(shù)組Ⅱ未見神經(jīng)功能缺損表現(xiàn)，模型組與各劑量特制牛肉湯組均出現(xiàn)不同程度的肢體癱瘓；術(shù)后2 h，6組的神經(jīng)功能評分比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；缺血后7 d，各劑量特制牛肉湯組神經(jīng)功能評分均較前下降，但6組的神經(jīng)功能評分比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1。

2.2 各組大鼠腦梗死體積分數(shù)比較 TTC染色顯示，正常腦組織為深紅色，梗死區(qū)為灰白色。缺血后7 d，假手術(shù)組Ⅰ和假手術(shù)組Ⅱ均未見梗死灶，模型組和各劑量特制牛肉湯組右側(cè)大腦中動脈供血區(qū)的大腦皮質(zhì)、紋狀體等處可見明顯梗死灶，見圖1。模型組及低、中、高劑量湯組腦梗死體積分數(shù)分別為(40.82±10.87)%、(33.95±8.09)%、(21.76±8.68)%、(21.19±13.46)%，與模型組相比，低、中、高劑量湯組腦梗死體積分數(shù)下降16.83%、46.69%和48.09%。模型組、低、中、高劑量湯組的腦梗死體積分數(shù)比較，差異有統(tǒng)計學意義(F=4.463，P=0.016)，其中中、高劑量特制牛肉湯組的腦梗死體積分數(shù)明顯低于模型組(t=3.634，P=0.008；t=3.743，P=0.007)。2.3 各組大鼠外周血T淋巴細胞亞群(CD3+、CD4+、CD8+)及CD4+/CD8+值比較 腦缺血后7 d，與假手術(shù)組Ⅰ相比，假手術(shù)組Ⅱ外周血CD3+、CD4+、CD8+水平及CD4+/CD8+值差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，模型組外周血的CD3+、CD4+水平及CD4+/CD8+值明顯下降(P<0.05)，CD8+水平有下降趨勢，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。與模型組相比，高劑量特制牛肉湯組CD3+水平顯著升高(P<0.05)，低、中、高劑量特制牛肉湯組CD4+水平顯著上升(P<0.05)，各劑量特制牛肉湯組的CD8+水平及CD4+/CD8+值有上升趨勢，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表2。

表1 各組大鼠神經(jīng)功能缺損評分比較[中位數(shù)(P25～P75)，分]

a b c d e f

a為假手術(shù)組Ⅰ，b為假手術(shù)組Ⅱ，c為模型組，d為低劑量特制牛肉湯組，e為中劑量特制牛肉湯組，f為高劑量特制牛肉湯組

圖1 各組大鼠腦組織TTC染色結(jié)果

注：與假手術(shù)組Ⅰ相比，*P<0.05，**P<0.01；與模型組相比，#P<0.05。

3 討 論

肌肽是有效的免疫調(diào)節(jié)劑[11]，且具有腦保護作用[12-13]。本課題組前期研究表明，肌肽可減輕神經(jīng)功能缺損，減小腦梗死體積，升高外周血CD3+、CD4+水平及CD4+/CD8+值，改善腦缺血造成的外周免疫抑制狀態(tài)，是腦缺血后免疫調(diào)節(jié)的有效藥物[6]。但目前肌肽多為化學合成，反應步驟多、收率低、成本高，且存在有害物質(zhì)殘留的風險。本課題組前期根據(jù)“藥食同源”理念，在朱丹溪“倒倉法”基礎(chǔ)上，采用簡單工藝制作食療方—特制牛肉湯，經(jīng)檢測發(fā)現(xiàn)其中肌肽含量豐富，占氨基酸總量的63.05%，是人類獲取肌肽較為合適的方式。

特制牛肉湯的主要原料為牛肉。牛肉自古即為補益佳品，朱丹溪《格致余論·倒倉論》首次將牛肉湯入藥，可“治癱、癆、蠱、癩諸證”，且具有寓攻于補，攻邪而不傷正，扶正而不助邪的特點?，F(xiàn)代營養(yǎng)學研究也表明，牛肉，尤其是瘦牛肉，富含大量優(yōu)質(zhì)蛋白、不飽和脂肪酸、B族維生素及礦物質(zhì)[14]，具有抗氧化、增強免疫力、促進新陳代謝、增強肌力等作用。牛肉中的蛋白質(zhì)由人體必需的8種氨基酸組成，且比例均衡，熬制成湯后，水溶性氨基酸溶解到湯中，湯刺激胃酸分泌，更利于營養(yǎng)吸收。腦卒中患者由于多種原因，易出現(xiàn)不同程度的蛋白質(zhì)-熱量缺乏性營養(yǎng)不良和免疫功能低下，增加感染等并發(fā)癥的發(fā)生率，影響腦卒中預后，牛肉及牛肉湯可為腦卒中患者補充充足的蛋白質(zhì)和熱量，對改善腦卒中患者免疫功能低下狀態(tài)有良好效果。另外，本研究顯示，與假手術(shù)組Ⅰ相比，給予高劑量特制牛肉湯治療的假手術(shù)組Ⅱ在神經(jīng)功能評分、腦梗死體積、T淋巴細胞亞群表達方面均無顯著差異(P>0.05)，說明特制牛肉湯對正常大鼠無不良生理影響，這體現(xiàn)了特制牛肉湯作為常見食療方安全無毒的優(yōu)勢。

腦缺血主要由腦供血區(qū)的血栓或栓塞造成。腦組織缺血缺氧，啟動一系列生理、病理變化過程，最終導致神經(jīng)元死亡和神經(jīng)功能受損。本研究結(jié)果顯示，假手術(shù)Ⅰ組及Ⅱ組的大鼠均無神經(jīng)功能缺損及腦梗死灶，而模型組和各劑量特制牛肉湯組均出現(xiàn)不同程度的肢體功能障礙和白色梗死灶，說明腦缺血可造成腦組織及神經(jīng)功能損傷。 結(jié)果顯示，給予特制牛肉湯灌胃治療7 d后，腦缺血大鼠神經(jīng)功能缺損情況改善，但與模型組相比，3個劑量組的作用均不明顯(P>0.05)。分析其原因可能有以下幾方面：(1)實驗樣本量較?。?2)本實驗的神經(jīng)功能評分方法采用Longa的五級四分評分法，排除無腦損傷(0分)及損傷過重(4分)的大鼠，腦缺血大鼠的神經(jīng)功能缺損評分的差異性過小；(3)特制牛肉湯屬于食療方，作用效果比藥物弱，難以在短時間內(nèi)對神經(jīng)癥狀起到明顯的改善作用。但與模型組相比，各劑量特制牛肉湯不同程度地減小了腦缺血大鼠的梗死灶，其中中、高劑量效果明顯(P<0.05)，提示中、高劑量特制牛肉湯具有顯著的神經(jīng)保護作用。

卒中不僅改變中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能，也同時影響免疫系統(tǒng)功能，在外周主要表現(xiàn)為腦缺血后數(shù)小時至數(shù)周的免疫抑制[15]，這是腦卒中后感染的主要原因[16]。嚴重、持久的淋巴細胞數(shù)量減少和功能改變是其主要表現(xiàn)之一。淋巴細胞主要指B淋巴細胞和T淋巴細胞，T淋巴細胞亞群的數(shù)量和活性直接反映細胞免疫功能，其主要標志有兩大類，一類是T淋巴細胞所共有的CD3標志，反映T淋巴細胞的總體水平，另一類為亞群特有標志，成熟T淋巴細胞可分為功能相異的兩大亞群：CD4+T淋巴細胞(輔助性T淋巴細胞)和CD8+T淋巴細胞(抑制性T淋巴細胞)，CD4+輔助細胞及體液免疫功能，相反，CD8+抑制細胞及體液免疫功能，故CD4+/CD8+值能初步評估機體免疫狀態(tài)，比值下降提示免疫功能受損，是機體病變程度和預后不良的重要標志之一，而比值增加提示免疫應答的正調(diào)節(jié)占優(yōu)勢[17-18]。本課題組前期研究顯示，腦缺血后24 h和72 h，大鼠外周血CD3+、CD4+水平及CD4+/CD8+值明顯下降(P<0.05)，CD8+水平則顯著上升(P<0.05)，說明卒中后1～3 d，機體T淋巴細胞亞群免疫活性降低，呈現(xiàn)外周免疫抑制狀態(tài)[6]。本研究結(jié)果顯示，腦缺血后7 d，和假手術(shù)組Ⅰ相比，模型組外周血CD3+、CD4+水平及CD4+/CD8+值明顯降低(P<0.05)，CD8+水平雖有下降趨勢，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，說明腦缺血后外周免疫抑制狀態(tài)可持續(xù)至腦缺血后7 d。這與既往研究結(jié)果一致[19-20]。與模型組相比，高劑量特制牛肉湯組大鼠腦缺血后7 d，外周血CD3+水平顯著上升(P<0.05)，而3個劑量特制牛肉湯均能顯著提高外周血CD4+水平(P<0.05)，但外周血CD8+水平和CD4+/CD8+值雖有上升趨勢，但差異無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)，考慮特制牛肉湯可能主要通過調(diào)節(jié)CD4+T淋巴細胞，而非CD8+T淋巴細胞，以改善免疫抑制狀態(tài)，而在3個劑量中，高劑量特制牛肉湯作用效果最佳。由于前期研究顯示肌肽具有明顯的免疫調(diào)節(jié)作用，而特制牛肉湯中富含肌肽，故推測特制牛肉湯中的肌肽在其免疫調(diào)節(jié)作用中發(fā)揮主要作用[6]。

綜上所述，特制牛肉湯可減小腦缺血大鼠梗死灶，改善肢體功能障礙，調(diào)節(jié)外周血T淋巴細胞亞群免疫活性以改善免疫功能，這可能與其富含肌肽有關(guān)。特制牛肉湯取材方便，制作工藝簡單，作為一種簡單食療方可納入臨床腦卒中患者的飲食方案，幫助改善免疫功能，防止感染等并發(fā)癥的發(fā)生。但特制牛肉湯的最佳干預時間及除肌肽以外的其他成分是否也在其腦保護及免疫調(diào)節(jié)功能中發(fā)揮作用還需進一步探討。

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Effects of different doses of special beef decoction on protecting neurologic function and peripheral blood T-lymphocyte subsets in rats with cerebral ischemia

MAQian,WANGXin,ZHUJie,WANGAi-hong

(SchoolofNursing,NanjingUniversityofChineseMedicine,Nanjing210023,China)

Objective To explore the effects of different doses of special beef decoction(BD) on protecting the neurologic function and the levels of peripheral blood T lymphocyte subsets in rats with cerebral ischemic injury.Methods Forty-eight male SD rats were divided into sham Ⅰ group,sham Ⅱ group,model group,low-dose BD group,moderate-dose BD group and high-dose BD group,with 8 rats in each group.The permanent right middle cerebral artery occlusion model was established by suture method in the model group and each BD group.After modeling,the rats in the low-,moderate- and high-dose BD groups were lavaged with BD at the dose of 200,400,600 mg/(kg·d),respectively,in the sham Ⅱ group were lavaged with BD of 600 mg/(kg·d),and in the sham Ⅰ group and model group were lavaged with the same volume of normal saline.At 2 hours and 7 days after operation,the neurologic impairment was assessed with Longa Scale,the levels of peripheral blood T-lymphocyte subsets(CD3+,CD4+and CD8+) were detected by flow cytometry,and ratio of CD4+/CD8+was calculated.The infarct volume fractions were measured by 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride staining at 7 days after operation.Results At 2 hours and 7 days after operation,there was no significant difference in the neurologic impairment score among 6 groups(P>0.05).At 7 days after operation,infarction was not observed in the brain tissues of rats in the sham Ⅰ group and sham Ⅱ group,but was observed in the model group and each BD group,and moderate- and high-dose BD groups had significantly lower infarct volume fractions compared to model group(P<0.05).The peripheral blood CD3+and CD4+levels and CD3+/CD8+ratio in the model group were significantly lower than those in the sham Ⅰ group(P<0.05).Compared to model group,high-dose BD group obtained higher level of peripheral blood CD3+(P<0.05),and low-,moderate- and high-dose BD groups obtained higher levels of peripheral blood CD4+(P<0.05).There was no significant difference in the infarct volume or the levels of peripheral blood T-lymphocyte subsets between two sham groups(P>0.05).Conclusion BD could improve the neurologic function and regulate the peripheral immune suppression in rats with cerebral ischemia,and the mechanism may be related with peripheral blood CD3+and CD4+elevation.

Cerebral ischemia,Special beef decoction,T-lymphocyte subsets,Infarct volume,Neurologic impairment score,Rat

教育部人文社會科學一般項目(10YJCZH145)

馬茜(1990～)，女，在讀碩士研究生，研究方向：心腦血管疾病基礎(chǔ)與臨床研究。

王愛紅(1971～)，女，博士，副教授，研究方向：心腦血管疾病基礎(chǔ)與臨床研究，E-mail：370010@njucm.edu.cn。

R 743.3

A

0253-4304(2016)02-0152-05

10.11675/j.issn.0253-4304.2016.02.02

2015-10-29

2016-01-04)