安禎祥 何遠利 王敏

(貴陽中醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院，貴州 貴陽 550001)

四氯化碳不同給藥途徑復合乙醇誘導大鼠肝纖維化模型的研究

安禎祥 何遠利 王敏△

(貴陽中醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院，貴州 貴陽 550001)

目的 比較四氯化碳(CCL4)腹腔注射、皮下注射復合乙醇灌胃SD大鼠制備肝纖維化動物模型，為研究肝纖維化病理機制、治療提供質量穩(wěn)定可靠的動物模型。方法 SD大鼠40只隨機分為四組，每組10只，腹腔注射造模組用50% CCL4橄欖油溶液腹腔注射(體積比：四氯化碳：橄欖油=1∶1)，劑量0.15 mL/100 g， 2次/周； 皮下注射造模組用50% CCL4橄欖油溶液背部皮下注射，劑量0.3 mL/100g， 2次/周，兩組均在實驗第2周開始給大鼠用30%乙醇灌胃，劑量1 mL/100g，隔天1次造模。腹腔注射對照組、皮下注射對照組，只采用等量橄欖油腹腔注射、皮下注射，生理鹽水灌胃。對比研究CCL4不同給藥途徑復合乙醇灌胃建立大鼠肝纖維化模型的效果。結果 腹腔注射造模組第8周造模成功，造模結束時死亡3只，死亡率30%，皮下注射造模組第10周造模成功，造模結束時大鼠無死亡，兩造模組比較，造模時間比較有顯著性差異(P<0.01)，肝組織纖維化病理分級無顯著性差異(P>0.05)。結論 兩種方法均可成功建立肝纖維化模型，且各有優(yōu)勢，腹腔注射造模組成模時間短，有時間優(yōu)勢，但是死亡率高，皮下注射造模組成模時間長，死亡率低，有成活優(yōu)勢，可根據(jù)實驗需求選擇應用不同的方法構建動物模型。

肝纖維化； 四氯化碳； 乙醇； 復合法； 模型

肝纖維化動物模型的建立是開展肝纖維化防治研究的重要手段，也是進行人體研究的前提[1]。因此建立高效、質量穩(wěn)定的肝纖維化動物模型顯得尤為重要。CCL4作為一種典型的肝毒物質，可強烈地引起肝細胞壞死，一直被研究者用來誘發(fā)各種肝損傷模型以闡明化合物肝毒性機制或肝損傷保護機制[2]。CCL4可通過腹腔注射、皮下注射、灌胃、吸入等途徑造模，單純CCL4造模方法簡單、價格低廉、病變典型，但是肝纖維化形成時間比較長，死亡率高。本實驗擬就CCL4腹腔注射、皮下注射復合乙醇灌胃進行比較研究，探討這兩種復合方法各自的優(yōu)劣，為肝纖維化動物實驗選擇造模方法提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SD大鼠40只，SPF級，雌雄各半，體質量160～200 g，動物及飼料均由重慶騰鑫比爾實驗動物銷售有限公司提供，實驗動物許可證號: SCXK(渝)2012-005。實驗場所由貴陽中醫(yī)學院實驗動物中心提供。房間通風良好，保持清潔，溫度20～25 ℃，空氣濕度50%～70%，用標準大鼠箱飼養(yǎng)，每箱5只，水料充足。

1.2 主要試劑 四氯化碳 (天津市光復科技發(fā)展有限公司，批號20120506)；橄欖油為國產分析純試劑；75%醫(yī)用酒精；4%甲醛；生理鹽水。丙氨酸氨基轉移酶(ALT)測定試劑盒，貝克曼庫爾特實驗系統(tǒng)有限公司，批號2001-0367；天門冬氨酸氨基轉移酶(AST)測定試劑盒，貝克曼庫爾特實驗系統(tǒng)有限公司，批號2001-0367。透明質酸(HA)，批號：20140709；層粘連蛋白(LN)，批號：20140720；IV型膠原(IV-C)，批號：20140816；Ⅲ型前膠原N端肽(PⅢP)，批號：20140702，鄭州安圖生物技術有限公司。

1.3 主要儀器 肝纖四項儀器為艾德康ADC CLIA 400，生化儀為德國西門子ADVIA 2400全自動生化分析儀，顯微鏡(奧林巴斯 BX51)，萊卡切片機RM2235。

1.4 方法

1.4.1 造模方法 本實驗分兩種方法造模，腹腔注射造模組：CCL4腹腔注射+酒精灌胃，皮下注射造模組：CCL4皮下注射+酒精灌胃。將SD大鼠40只適應性喂養(yǎng)1周后，隨機分為四組:腹腔注射造模組10只、腹腔注射對照組10只、皮下注射造模組10只、皮下注射對照組10只，腹腔注射造模組用50% CCL4橄欖油溶液腹腔注射(體積比=四氯化碳：橄欖油=1∶1)，劑量0.15 mL/100 g，2次/周，皮下注射組用50% CCL4橄欖油溶液背部皮下注射，劑量0.3 mL/100g，2次/周，并從實驗第2周開始給大鼠用30%酒精灌胃，劑量1 mL/100g，隔天1次造模。大鼠每周稱體質量1次，并按體質量增長而相應調整造模藥物劑量。實驗第8周，從兩造模動物中各隨機抽取1只大鼠處死，作肝纖維化病理學檢查，按照《病毒性肝炎防治方案》[3]肝纖維化分期標準來判斷肝纖維化程度，直到有2期以上肝纖維化形成，即確定肝纖維化模型復制成功，腹腔注射造模第8周即成功，皮下注射組造模第10周成功。

1.4.2 樣品采集 各組大鼠每周稱量體質量1次，觀察每組體質量變化有無差異、進食量、毛色、活動狀況等情況。各組于實驗第8周各隨機處死1只大鼠，行肝纖維化組織病理學檢測。腹腔注射造模組第8周確定造模成功，皮下注射造模組第10周造模成功，各于造模結束后，禁食12 h，測體質量，腹主動脈采血，離心取血清，檢測谷丙轉氨酶、谷草轉氨酶及肝纖維化指標血清中HA、LN、IV-C、PⅢP含量。脫頸處死大鼠，剖取肝臟，提取肝組織做病理學檢查。取各組肝臟右葉相同部位組織1塊置入10%福爾馬林固定，作常規(guī)石蠟切片，HE染色，按照《病毒性肝炎防治方案》[3]肝纖維化分期標準來判斷肝纖維化程度，在光鏡下觀察肝內部結構、肝細胞炎癥程度以及肝纖維化組織增生情況，每張切片隨機選取5個視野，分別記錄病理分級，并取其平均值作為該動物肝臟的病理分級。

2 結 果

第8周末隨機處死各組大鼠1只，HE染色發(fā)現(xiàn)腹腔注射造模組纖維化已經形成，處死全部腹腔注射造模組大鼠及腹腔注射對照組大鼠，至第10周隨機處死剩余各組大鼠各1只，HE染色發(fā)現(xiàn)肝纖維化形成，處死剩余兩組大鼠。造模過程中皮下注射造模組大鼠無死亡，腹腔注射造模組共死亡大鼠3只，死亡率約30%，其余兩組大鼠無死亡。

2.1 各組大鼠一般情況比較 各組大鼠入場時體質量差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，具有可比性。復合因素造模兩組大鼠一般情況差，皮毛干澀無光澤，精神萎靡，行為遲鈍，活動和飲食減少，有扎堆現(xiàn)象，體質量增長緩慢，兩組相比無顯著性差異。兩組對照組大鼠一般情況良好，體質量增長差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。造模過程中，腹腔注射造模組大鼠體質量增長緩慢，前兩次造模中體質量呈負增長，在前6周，與腹腔對照組比較明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，皮下注射造模組體質量普遍有緩慢增長，低于對照組，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，與腹腔注射造模組比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表1。

表1 各組大鼠體質量的變化(g，±s)

注：與腹腔注射對照組比較，*P<0.05。

2.2 各組大鼠血清纖維化指標、ALT、AST的比較 實驗結束后，腹腔注射造模組、皮下注射造模組大鼠血清HA、LN均較各相應對照組升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，而腹腔注射造模組、皮下注射造模組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，IV-C、PⅢP實驗各組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；谷丙轉氨酶在腹腔注射造模組、皮下注射造模組較對照組有升高，差異無統(tǒng)計學意義，谷草轉氨酶在腹腔注射造模組較其余各組有明顯升高，差異無統(tǒng)計學意義，見表2。

表2 實驗各組大鼠血清肝纖維化指標、ALT、AST檢測結果(±s)

注：與腹腔注射對照組比較，*P<0.01，與皮下注射對照組比較，**P<0.01。

2.3 兩造模組大鼠肝纖維化時間比較 腹腔注射造模組第8周造模成功，皮下注射造模組第10周造模成功，兩組造模組比較，造模時間有顯著性差異(P<0.01)。

2.4 各組大鼠肝組織纖維化病理學比較 兩組對照組肝細胞結構正常，以中央靜脈為中心放射狀排列，無假小葉形成。造模兩組肝小葉結構破壞，肝細胞明顯壞死，纖維組織增生，多數(shù)形成假小葉，伴炎性細胞浸潤，部分肝小葉中有壞死S2、S3、S4期情況：腹腔造模組分別為1、4、2，皮下造模組分別為3、5、1，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

3 討 論

肝纖維化模型主要有CCL4、二甲基亞硝胺、硫代乙酰胺、異種血清、乙醇、膽總管結扎等單因素造模和復合因素造模。單因素造模時間長，死亡率高，形成率低，病理分期不明顯。復合因素造?？煽s短造模時間，復合造模因素可產生協(xié)同作用，減少單一因素的強度，降低死亡率，增加成功率。CCL4是一種選擇性的肝毒性物質，本研究使用橄欖油作為溶劑，按1/1體積比例能很好地溶解，方便、易于獲得，是一種好的實驗方法。CCL4誘導的肝纖維化動物模型在病理機制的某些方面與人肝纖維化相似，如肝細胞壞死后的再生、中央靜脈周圍肝細胞壞死及纖維組織增生，與人慢性肝病進展為肝硬化相似，但是CCL4的肝毒性作用劇烈，如劑量掌握不當，死亡率較高，且停止給藥后有一定自然恢復趨勢的缺點。CCL4給藥方式國內外存在差異，國外主要采用腹腔注射， 國內主要采用皮下注射， 兩種給藥方式造模動物的死亡率均較高[4]。CCL4經門靜脈到達肝臟，在肝細胞內經細胞色素氧化酶P450代謝生成大量的自由基，攻擊肝細胞，使肝細胞發(fā)生凋亡或壞死，CCL4反復破壞肝細胞， 結果造成肝臟的炎癥遷延，不斷形成纖維化。乙醇在肝臟通過乙醇脫氫酶( ADH) 和微粒體乙醇氧化酶系統(tǒng)( MEOS) 進行氧化代謝產生毒性代謝產物乙醛，通過肝細胞損害、誘導免疫反應、抑制三羧酸循環(huán)等多種途徑損害肝臟的結構和功能，刺激膠原蛋白的合成，從而促進肝纖維化的發(fā)生[5]。乙醇能誘導P450活性從而增加CCL4的肝毒性，在乙醇致肝脂肪變作用下用CCL4能加速肝細胞壞死，縮短造模時間[6]。本實驗結果顯示，腹腔注射、皮下注射復合乙醇造模均可誘發(fā)大鼠肝纖維化的形成，腹腔注射復合乙醇灌胃成模時間為第8周，較皮下注射復合乙醇造模提前兩周，有時間優(yōu)勢，雖然腹腔注射CCL4劑量小，但死亡率高(30%)，考慮原因系腹腔注射后腹膜吸收面積大，CCL4一次性進入血液循環(huán)量大，導致肝細胞嚴重壞死，發(fā)生急性肝衰竭而死亡，更多的顯示為急性肝功能損傷，大鼠只要能耐受前期實驗，后期就可發(fā)生肝纖維化，皮下注射雖然劑量偏大，但是吸收慢，對肝臟毒性相對偏小，大鼠能耐受，表現(xiàn)慢性肝功能損害，所以形成肝纖維化時間相對偏長，死亡率低是其優(yōu)勢。從對轉氨酶、HA、LN的檢測結果可以發(fā)現(xiàn)，腹腔注射復合乙醇造模組均較對其余各組有升高，亦支持上述結論。本實驗研究結果顯示：造模兩組大鼠肝內結構紊亂，均形成肝纖維化，兩種方法均能成功建立肝纖維化動物模型。腹腔注射復合法造模時間為第8周，較皮下注射造模組縮短時間兩周，有時間優(yōu)勢，但死亡率高達30%，皮下注射復合法造模時間長，死亡率低是其優(yōu)勢。復合因素中的CCL4可模擬氧化損傷，乙醇模擬酒精中毒，均能損傷肝細胞，損傷的肝臟可進一步發(fā)生纖維化，較單因素模型具普遍性和現(xiàn)實意義，與肝纖維化的形成機制貼近，能更準確模擬自然生活環(huán)境，適用于抗肝纖維化的作用機制研究，在實驗中可根據(jù)實驗需求選擇應用。

[1] 劉平，高云華．肝纖維化動物模型的建立[J]．世界華人消化雜志，2002，10(6)：693-695．

[2] 王晶，朱清仙，李新榮，等． 四氯化碳誘導性肝纖維化大鼠肝組織白細胞介素4 表達的研究[J]． 實用臨床醫(yī)學， 2008，9(11) : 3-5．

[3] 中華醫(yī)學會傳染病與寄生蟲病學分會、肝病學分會.病毒性肝炎防治方案[J].中華肝臟病雜志 2000，8(6):324-329.

[4] Jang JH， Kang KJ， K im YH， et al. Reevaluat ion of experim en talm od el of hepat ic fib rosis induced by hepatotox ic d rugs: an easy，appl icable， and reprodu cib lem odel [J]. Transplant Proc， 2008，40(8) : 2700-2703.

[5] 華忠，薛博瑜． 四氯化碳致大鼠肝纖維化模型的研究進展[J]．國際流行病學傳染病學雜志， 2009， 36(1) : 71-72．

[6] 明盛金，尹彬彬，李俊，等.復合因素法致大鼠肝纖維化模型的建立[J].吉林醫(yī)藥學院學報，2012:33(6)：360.

Preparation of hepatic fibrosis rat models induced by carbon tetrachloride administration in different ways combined with ethanol lavage

AnZhenxiang,HeYuanli,WangMin.

FirstAffiliatedHospitalofGuiyangCollegeofTraditionalChineseMedicine,Guiyang550001,China

Objective To provide reliable hepatic fibrosis rat models for the research on the pathologic mechanism and the treatment of hepatic fibrosis through the comparison of the models induced by gastric administration of ethanol combined with different CCL4 injection ways (intraperitoneally and subcutaneously respectively). Methods 40 SD rats were randomly divided into 4 groups (10 rats in each group): intraperitoneally-injected group, injection of 50% of CCL4and olive oil (volume ratio, CCL4∶ Olive Oil = 1∶1 ) at the dosage of 0.15 mL/100g, twice per week; subcutaneously-injected group, injection of 50% of CCL4and olive oil under the dorsal tissue at the dosage of 0.3 mL/100g, twice per week. Both of the two groups were gastrically administrated with 30% of ethanol every two days at the dosage of 1 mL/100g in the second week of the experiment; the other two control groups were only injected the same amount of olive oil intraperitoneally and subutaneously respectively with gastric administration of normal saline. Then the models prepared by different administration of CCL4with ethanol were compared. Results Intraperitoneally-injected group was successfully modeled in 8 weeks with the death of three rats (the mortality rate was 30%), while subcutaneously-injected group was modeled in 10 weeks without the death of any rat. There was significant difference in modeling time (P<0.01) but no significant difference in pathological grading on hepatic fibrosis(P>0.05) between the two groups.Conclusion Both the two different administration ways of CCL4could successfully create hepatic fibrosis rat models. Intraperitoneal injection has an advantage in modeling time but its mortality rate is a bit high. However, subcutaneous injection has the advantage in mortality rate but its modeling time is longer. Thus, we could select different CCL4administration ways according to different experimental purpose.

Hepatic fibrosis; Carbon tetrachloride (CCL4); Ethanol; Composite method; Model

國家自然科學基金資助項目(81460726)；貴州省教育廳自然科學研究招標資助項目(合同編號： 黔教合KY字(2012)(41)號)；貴州省科技廳社會發(fā)展資助項目(合同編號： 黔科合SY字(2012)3146)

R-332,R575

A

1000-744X(2016)01-0006-03

2015-10-02)

△通信作者