譚帥， 彭銳， 彭確昆， 鄒方東

(生物資源與生態(tài)環(huán)境教育部重點實驗室，四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，成都610064)

基于DNA條形碼和微衛(wèi)星標(biāo)記分析矮巖羊的進化地位

譚帥， 彭銳， 彭確昆， 鄒方東*

(生物資源與生態(tài)環(huán)境教育部重點實驗室，四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，成都610064)

巖羊Pseudoisnayaur是目前巖羊?qū)貾seudois中承認(rèn)的唯一物種，主要分布在青藏高原及其周邊山脈地區(qū)，是該地區(qū)代表性的大型有蹄類動物。巖羊種內(nèi)存在矮巖羊這一個形態(tài)特異的種群，其分類地位一直處在爭議當(dāng)中。本次研究從巖羊分布區(qū)域內(nèi)搜集到26個巖羊樣品，其中包括5個矮巖羊樣品，選取了COⅠ基因DNA條形碼標(biāo)準(zhǔn)區(qū)域和8個微衛(wèi)星標(biāo)記位點探討了矮巖羊與巖羊不同地理種群的系統(tǒng)進化關(guān)系，同時分析了矮巖羊的進化地位。結(jié)果表明矮巖羊和巖羊間目前處于基因交流半隔離狀態(tài)，不應(yīng)該被分為2個不同的物種或者亞種，而矮巖羊應(yīng)該被作為巖羊四川亞種P.n.szechuanensis中一個形態(tài)變異的特殊分類群。另外，結(jié)合生境選擇和生態(tài)觀察的結(jié)果推測矮巖羊目前可能已經(jīng)處于單獨進化的早期階段。

巖羊；矮巖羊；遺傳分化；DNA條形碼；微衛(wèi)星分子標(biāo)記

巖羊Pseudoisnayaur是目前巖羊?qū)貾seudois公認(rèn)的唯一物種，分類學(xué)上屬于鯨偶蹄目Cetartiodactyla牛科Bovidae羊亞科Caprinae，國家Ⅱ級重點保護野生動物，主要分布在青藏高原及其周邊山脈地區(qū)，是該地區(qū)代表性的大型有蹄類食草動物。巖羊最早被發(fā)現(xiàn)命名時，曾一度被歸類在盤羊?qū)貽vis內(nèi)(Wang & Hoffman，1987)，此后在生態(tài)習(xí)性和種群生理結(jié)構(gòu)的研究中，發(fā)現(xiàn)巖羊與山羊和盤羊都有相似之處，認(rèn)為巖羊是介于這兩者間的一個物種，而不是最初被認(rèn)為的屬于盤羊?qū)俚奈锓N，因此后來該物種被獨立為巖羊?qū)伲浯硪馑紴椤凹傺?fake sheep)”，并建議其中存在2個亞種，分別為四川亞種P.nayaurszechuanensis(Rothschild，1922)和西藏亞種P.nayaurnayaur(Wang & Hoffman，1987)，另外還有一個未定的矮巖羊P.nayaurschaeferi種群(Haltenhorth，1963)。

矮巖羊的最大特征是體型僅有普通巖羊的一半大小，目前確定的分布范圍局限于四川省西部的巴塘縣、白玉縣和云南省的德欽縣等地區(qū)(吳毅等，1990)，而最近調(diào)查認(rèn)定其數(shù)量已不足500只(Wangetal.，2000)，被世界自然保護聯(lián)盟(IUCN)列入瀕危物種紅色名錄(Huffman & Harris, 2014)，也是我國特有的珍稀保護動物。矮巖羊自1937年被發(fā)現(xiàn)以來，對于其物種分類地位和體型矮化原因展開了大量的研究，該物種屬于一個單獨物種或巖羊的亞種(Haltenhorth，1963；Wang & Hoffman，1987)，或營養(yǎng)原因?qū)е掳扔^點都曾被提出(Allen，1938)，但至今仍沒有達成共識。從早年傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)方法產(chǎn)生巨大爭議之后，近年來利用分子生物學(xué)的方法仍然沒有解決矮巖羊的分類地位問題，其中有研究認(rèn)為矮巖羊應(yīng)該是巖羊的一個亞種(Fengetal.，2001；曹麗榮等，2003)，也有研究發(fā)現(xiàn)矮巖羊不應(yīng)該被作為任何獨立的種或亞種(周材權(quán)等，2003；Zengetal.，2008)。但是，這些研究或多或少存在一些缺陷，如研究中的樣品全部來自四川西部地區(qū)(周材權(quán)等，2003)，或僅僅使用單一的分子標(biāo)記(曹麗榮等，2003；周材權(quán)等，2003)，因此矮巖羊的分類地位仍然處于爭議當(dāng)中。這一現(xiàn)狀也導(dǎo)致了矮巖羊目前在保護遺傳學(xué)中的尷尬地位，即是應(yīng)該被歸為巖羊而作為國家Ⅱ級重點保護野生動物，還是作為稀有物種重點保護。

本次研究采集了來自巖羊不同地理種群的21個巖羊樣品和5個矮巖羊樣品，其中包括了來自青藏高原和寧夏賀蘭山的樣品?；诰€粒體細(xì)胞色素c氧化酶亞基Ⅰ(COⅠ)5’端一段648 bp被稱為DNA條形碼的序列，構(gòu)建Neighbor-Joining(NJ)系統(tǒng)進化樹，計算不同種群間的Kimura 2-parameters(K2P)遺傳距離，闡述了這些種群相互間的系統(tǒng)進化關(guān)系和遺傳分化情況，同時結(jié)合8個微衛(wèi)星位點進一步探討矮巖羊的進化地位，為其保護提出建議。

1 材料和方法

1.1 樣品來源

本次研究使用的巖羊樣品共21個，分別是：來自西藏乃東縣、昌都縣和芒康縣的樣品各1個，來自寧夏賀蘭山的6個樣品和來自青海省都蘭縣、海北自治州和海南自治州的樣品各1個，剩下的9個樣品全部來自四川西部地區(qū)，其中包括理縣的3個樣品、康定縣的2個樣品和分別來自白玉縣、丹巴縣、雅江縣和甘孜縣的樣品各1個。5個矮巖羊樣品來自四川省巴塘縣。由于采集到的肌肉較少，沒有使用賀蘭山種群的6個樣品進行微衛(wèi)星分析，剩下一共20個樣品。具體采樣地見圖1。

圖1 采樣點示意圖Fig.1 The sampling localities

BT. 巴塘縣, DB. 丹巴縣, CD. 昌都縣, YJ. 雅江縣, ND. 乃東縣, LX. 理縣, MK. 芒康縣, KD. 康定縣, BY. 白玉縣, GZ. 甘孜縣, DL. 都蘭縣, HB. 海北自治州, HN. 海南自治州, HL. 賀蘭山。

BT. Batang county, DB. Danba county, CD. Changdu county, YJ. Yajiang county, ND. Naidong county, LX. Li county, MK. Mangkang county, KD. Kangding county, BY. Baiyu county, GZ. Ganzi county, DL. Dulan county, HB. Haibei Autonomous Prefecture, HN. Hainan Autonomous Prefecture, HL. Helan Mountain.

1.2 肌肉DNA的提取

肌肉樣本儲存在95%乙醇中室溫運輸，之后在-80 ℃保存。實驗時剪取20 mg左右的肌肉組織放入1.5 mL EP管內(nèi)，加入試劑盒中的GA緩沖液200 μL和蛋白酶K 20 μL，在56 ℃恒溫?fù)u床中消化3 h，每隔30 min輕輕顛倒混勻內(nèi)容物。待樣本消化完全后，按照TIANamp Genimic DNA Kit說明書的步驟依次進行，最終提取的DNA在-20 ℃保存。

1.3 PCR擴增和測序

擴增DNA條形碼序列的引物參考Cai等(2011)。另外，由于目前還未見巖羊微衛(wèi)星位點的報道，所以本研究從已有的文獻中選取了一些擴增山羊效果很好的位點(表1)，用于擴增巖羊基因組微衛(wèi)星(儲明星等，2002；賈斌等，2003；劉全德等，2007；李利等，2009；郭丹等，2010；李國紅等，2010；王杰等，2010；許麗梅等，2010)。DNA條形碼序列和微衛(wèi)星的PCR反應(yīng)體系相同，16.3 μL超純水，2.5 μL 10×PCR Buffer，2.0 μL dNTP混合液(2.5 mM)，2.0 μL MgCl2(25 mM)，上、下游引物(10 μM)各1.0 μL，1.0 μL模板DNA(約200 ng)，0.2 μL Taq DNA聚合酶(5 U·μL-1，TaKaRa)，總體積25 μL。PCR反應(yīng)程序如下：95 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性40 s，55 ℃退火40 s，DNA條形碼序列72 ℃延伸2 min(微衛(wèi)星72 ℃延伸1 min)，共35個循環(huán)；72 ℃最終延伸10 min，最后4 ℃保存。

DNA條形碼序列PCR擴增后的產(chǎn)物首先通過1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測確定其片段大小，證明已獲得正確的擴增條帶后，將PCR產(chǎn)物全部加入到一塊新的1.5%瓊脂糖凝膠的膠孔中進行電泳，切取目的DNA片段的膠塊，使用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(OMEGA公司，美國)進行回收，純化后送深圳華大基因科技服務(wù)有限公司測序。微衛(wèi)星標(biāo)記的PCR產(chǎn)物每3對為1組，共分成4組，每組里面的3對引物分別標(biāo)記不同染料(TAMAR、HEX和FAM)，標(biāo)記情況如表1所示。實時熒光定量PCR產(chǎn)物送北京鼎盛生物科技有限公司分型。

1.4 數(shù)據(jù)計算

所有序列在MEGA v.6.06(Tamuraetal.，2013)中運行，之后使用DnaSP v.5.10.01(Librado & Rozas，2009)檢查并排除重復(fù)的單倍型序列。獲得了9個DNA條形碼單倍型(GenBank序列號：JX120615～JX120623)，另外從GenBank上篩選并下載了1個DNA條形碼單倍型BT4(GenBank序列號：HQ269424，來自四川省巴塘縣)，一共10個單倍型選擇了K2P模型構(gòu)建鄰接(NJ)樹，自展檢驗(Bootstrap)1 000次。而遺傳距離的計算全部使用K2P距離，遺傳代碼選擇為脊椎動物線粒體，分別設(shè)定為西藏巖羊、青海巖羊、四川巖羊、寧夏巖羊和矮巖羊這5個種群，加上外群山羊計算相互間的遺傳距離。

微衛(wèi)星熒光標(biāo)記引物使用ABI PRISM 377 sequ-encer (Applied Biosystems，美國)進行基因分型，另外使用GeneMapper V3.2(SoftGenetics，美國)決定各樣本等位基因數(shù)，而等位基因大小相對分子內(nèi)標(biāo)由人類基因組中ROX-50基因決定，從而獲得等位基因長度。最后數(shù)據(jù)采用人工讀取后并手動校正，使用Excel保存。Micro-Checker v.2.2.3(van Oosterhoutetal.，2004)在微衛(wèi)星分析中被用來檢測無效等位基因頻率和大片段等位基因丟失情況。每一個群體的Hardy-Weinberg平衡和等位基因連鎖用GenePop v.4.0(Raymond & Rousset，1995)檢測。等位基因數(shù)量(N)、觀察雜合度(HO)、期望雜合度(HE)、近交系數(shù)(FIS)和F-statistic值(FST)用FSTAT v.2.9.3.2(Goudet，1995)計算。同時用Structure v.2.3.1(Pritchardetal.，2000)評估15個巖羊和5個矮巖羊之間的遺傳結(jié)構(gòu)。在貝葉斯的遺傳結(jié)構(gòu)分析中，選擇了等位基因混合模型?？紤]到樣品數(shù)量有限，聚類參數(shù)K值設(shè)為1～5。每個K值重復(fù)運算10次確保結(jié)果的穩(wěn)定性。每次運算中300 000 MCMC被執(zhí)行，其中25%作為burn-in被去除，最后通過DeltaK方法來確定最佳的K值。

表1 擴增巖羊和矮巖羊的8個微衛(wèi)星標(biāo)記位點Table 1 Characteristics of eight microsatellite loci utilized for Pseudois nayaur and dwarf blue sheep

注：*熒光標(biāo)記引物。

Note:*fluorescent-labeled primers.

2 結(jié)果

2.1 DNA條形碼序列分析

基于DNA條形碼序列的10個單倍型，以山羊為外群(GenBank序列號：AB736134)，NJ法構(gòu)建系統(tǒng)進化樹(圖2)。寧夏種群的單倍型和西藏種群的單倍型與四川、青海種群的巖羊和矮巖羊的單倍型在進化樹中相互交錯，而矮巖羊的單倍型在其中單獨形成了一個進化單元，同時也表現(xiàn)為最晚分化的一個單元。在遺傳距離的計算中，除了寧夏種群和矮巖羊之間的遺傳距離為0.024外，其他種群相互間的遺傳距離都在0.01～0.02，而與外群山羊的遺傳距離都較遠，數(shù)值為0.087～0.100(表2)。

2.2 微衛(wèi)星位點數(shù)據(jù)

15個巖羊和5個矮巖羊樣品的8個微衛(wèi)星位點都被成功擴增，無效等位基因、大片段丟失、等位基因連鎖都沒有在這8個位點中被發(fā)現(xiàn)。群體分析中涉及到的遺傳參數(shù)值見表3。在每個位點中，幾乎所有的FIS值都是正值，這意味著純合子過剩。而純合子過剩也間接地導(dǎo)致了期望雜合度值遠高于觀察雜合度。群體結(jié)構(gòu)分析結(jié)果并沒有在這20個個體中顯示出跨越亞種間的遺傳差異，這也意味著20個個體來自同一個群體。最終計算所得矮巖羊和巖羊間的FST是0.051，而根據(jù)基因流(Nm)=0.25(1/FST-1)計算得到的巖羊和矮巖羊之間的基因流是4.65，該值遠遠大于1。

圖2 巖羊和矮巖羊的10個COⅠ基因DNA條形碼標(biāo)準(zhǔn)區(qū)域 單倍型構(gòu)建的NJ樹Fig.2 Neighbor-joining tree of 10 COⅠ DNA barcording haplotyes of Pseudois nayaur and dwarf blue sheep

BT. 巴塘縣 Batang county, DL. 都蘭縣 Dulan county, GZ. 甘孜縣 Ganzi county, ND. 乃東縣 Naidong county, HL. 賀蘭山 Helan Mountain, KD. 康定縣 Kangding county, LX. Li county.

表2 通過MEGA K2P模型計算巖羊不同種群和矮巖羊 DNA條形碼單倍型間的遺傳距離Table 2 The genetic distances of DNA barcording between the haplotypes of the different populations of Pseudois nayaur and dwarf blue sheep by using K2P model of MEGA

表3 8個微衛(wèi)星位點的遺傳參數(shù)值Table 3 Genetic variability of 8 microsatellite loci

3 討論

在DNA條形碼序列構(gòu)建的進化樹中，寧夏種群和西藏種群的單倍型與四川、青海種群的單倍型相互交錯，并沒有像細(xì)胞色素b和線粒體控制區(qū)域構(gòu)建的進化樹中一樣單獨形成分支(Zengetal.，2008)。而在遺傳距離的計算結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，矮巖羊與巖羊不同地理種群的單倍型并沒有產(chǎn)生明顯的遺傳分化，結(jié)合這些巖羊種群與外群山羊較大的遺傳距離數(shù)值，說明了DNA條形碼序列在種內(nèi)有較高的保守性。而巖羊各種群間的遺傳距離都遠遠低于?？浦蠨NA條形碼序列在種內(nèi)的平均距離(0.063)，說明了各種群間的遺傳分化仍然屬于種內(nèi)水平。但是，矮巖羊的3個單倍型在系統(tǒng)進化樹中單獨形成了1個單元，同時與巖羊各不同地理種群間的遺傳距離都大于0.01，特別是與四川亞種種群的遺傳距離達到了0.014，說明矮巖羊存在單獨進化趨勢的可能性。

研究曾發(fā)現(xiàn)矮巖羊與四川西部地區(qū)的巖羊樣品在細(xì)胞色素b和線粒體控制區(qū)域這2個分子標(biāo)記所構(gòu)建的系統(tǒng)進化樹中相互交錯，沒有形成一個單獨的進化單元(Zengetal.，2008)。同時還發(fā)現(xiàn)矮巖羊與巖羊出現(xiàn)了共享同一個細(xì)胞色素b基因序列單倍型的情況，所以認(rèn)為矮巖羊不應(yīng)該被歸為一個種或亞種(周材權(quán)等，2003)。而本次研究通過5個矮巖羊樣品和15個巖羊樣品的微衛(wèi)星分子標(biāo)記分析，最終計算所得矮巖羊和巖羊間的FST是0.051。而根據(jù)Wright(1978)的標(biāo)準(zhǔn)，當(dāng)FST<0.05時，說明群體間分化很??；當(dāng)0.05≤FST≤0.15時，說明群體間的分化處于中等程度；而當(dāng)FST>0.15時，說明群體間產(chǎn)生了高度分化。本次微衛(wèi)星標(biāo)記結(jié)果所顯示的巖羊與矮巖羊之間的遺傳分化剛剛達到了中等程度，并沒有產(chǎn)生高度的遺傳分化。除此之外，利用微衛(wèi)星計算所得的基因流(Nm=4.65)遠大于1，這也表明巖羊和矮巖羊之間曾經(jīng)存在頻繁的基因交流，這也能從微衛(wèi)星的共享等位基因和私有等位基因的比率得出該結(jié)論。

雖然目前認(rèn)為巖羊和矮巖羊的分布范圍重復(fù)，但是申定健等(2007)長期在四川竹巴籠自然保護區(qū)的生態(tài)觀察發(fā)現(xiàn)矮巖羊和巖羊的微生境并不重疊。矮巖羊生活在金沙江河谷的灌木叢中，而巖羊主要生活在山脈的上部，基本沒有發(fā)現(xiàn)在河谷地區(qū)活動。Wang和Hoffman(1987)也發(fā)現(xiàn)巖羊和矮巖羊棲息地之間存在1 000多米的海拔差異，同時被一條狹窄的林帶隔離，并且肯定了矮巖羊種群僅包括矮巖羊個體。因此我們認(rèn)為矮巖羊和巴塘縣地區(qū)的巖羊很可能滿足同域物種形成的概念，即在同一地理位置從1個祖先物種形成2個或更多后代物種的現(xiàn)象(Pennisi，2006)?？梢约僭O(shè)矮巖羊的體型矮化是由基因突變造成，而這種突變可能以隱性等位基因的方式在個體中存在，當(dāng)該等位基因的頻率達到一定程度之后，群體中就會不斷產(chǎn)生該等位基因純合的突變個體，最終表現(xiàn)出體型矮小的表型并穩(wěn)定遺傳?？梢酝茰y這種純合突變巖羊因為體型矮小，所以在與普通巖羊的生殖競爭中可能長期處于劣勢，只能選擇與類似個體進行交配，而逐漸聚集成一個新的群體。這一結(jié)果也會導(dǎo)致巖羊群體發(fā)生衰退的現(xiàn)象，隱性突變的個體也許會繼續(xù)傳播這一突變，進一步導(dǎo)致矮巖羊這一形態(tài)特異群體的產(chǎn)生。

我們推斷基因交流或許只發(fā)生在矮巖羊與巖羊種群分化的早期階段，但是近期二者之間因為棲息地的不同很可能已經(jīng)存在生殖隔離，沒有發(fā)生基因的交流。因此我們認(rèn)為矮巖羊和巖羊間目前處于基因交流半隔離狀態(tài)，遺傳分化沒有達到種或者亞種水平。本次研究結(jié)合線粒體基因和微衛(wèi)星分子標(biāo)記的數(shù)據(jù)，支持矮巖羊目前不應(yīng)該被歸為一個單獨的種或者亞種，但可以作為一個形態(tài)變異的特殊種群來對待。對于這一結(jié)果，同時也需要更多的樣品數(shù)量和分子標(biāo)記來進一步支持。

曹麗榮, 王小明, 方盛國, 等. 2003. 從細(xì)胞色素b基因全序列差異分析巖羊和矮巖羊的系統(tǒng)進化關(guān)系[J]. 動物學(xué)報, 49: 198-204.

儲明星, 王吉振, 王愛國, 等. 2002. 小尾寒羊五個微衛(wèi)星基因座遺傳多態(tài)性研究[J]. 遺傳學(xué)報, 6(29): 502-506.

郭丹, 王婕, 姜懷志. 2010. 遼寧絨山羊微衛(wèi)星多態(tài)性及其與經(jīng)濟性狀相關(guān)性研究[J]. 中國草食動物, 230(6): 5-8.

賈斌, 陳杰, 趙茹茜, 等. 2002. 新疆8個綿羊品種遺傳多樣性和系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系的微衛(wèi)星分析[J]. 遺傳學(xué)報, 30(9): 847-854.

李國紅, 陳祥, 簡承松, 等. 2010. 利用微衛(wèi)星標(biāo)記對7個山羊品種的遺傳多樣性研究[J]. 中國畜牧獸醫(yī), 37(3): 127-130.

李利, 劉成建, 張國俊, 等. 2009. 用5個微衛(wèi)星標(biāo)記分析四川7個地方山羊品種的遺傳關(guān)系[J]. 遺傳育種, 45(3): 8-11.

劉全德, 楊博輝, 郭健, 等. 2008. 柴達木絨山羊八個微衛(wèi)星位點遺傳多樣性分析[J]. 中國草食動物, 28(3): 3-6.

申定健, 王淯, 澤仁居勉, 等. 2007. 矮巖羊行為生態(tài)的初步研究[J]. 四川動物, 26(4): 774-777.

王杰, 王永, 許期樹, 等. 2010. 微衛(wèi)星DNA在高原型藏山羊親子鑒定中的應(yīng)用研究[J]. 西南民族大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版), 36(1): 74-79.

吳毅, 袁重桂, 胡錦矗, 等. 1990. 矮巖羊生物學(xué)的研究[J]. 獸類學(xué)報, 10(3): 185-188.

許麗梅, 劉丑生, 張利平, 等. 2010. 山羊群體遺傳多樣性的微衛(wèi)星分析[J]. 生物工程學(xué)報, 26(5): 588-594.

周材權(quán), 周開亞, 胡錦矗. 2003. 從線粒體細(xì)胞色素b基因探討矮巖羊物種地位的有效性[J]. 動物學(xué)報, 49(5): 578-584.

Allen GM. 1938. Zoological results of the second Dolan expedition to western China and eastern Tibet, 1934-1936[J]. Proceedings of the Academy of Natural Sciences of Philadelphia, 90: 261-293.

Cai YS, Zhang L, Shen FJ,etal. 2011. DNA barcoding of 18 species of Bovidae[J]. Chinese Science Bulletin, 56(2): 164-168.

Feng J, Lajia C, Taylor D,etal. 2001. Genetic distinctiveness of endangered dwarf blue sheep (Pseudoisnayaurschaeferi): evidence from mitochondrial control region and Y-linked ZFY intron sequences[J]. Journal of Heredity, 92: 9-15.

Goudet J. 1995. FSTAT (version 1.2): a computer program to calculate F-statistics[J]. Journal of Heredity, 86: 485-486.

Huffman B, Harris R. 2014.Pseudoisnayaurssp.schaeferi[EB/OL].[2016-05-01]. The IUCN Red List of Threatened Species 2014: e. T18535A64313668.

Haltenorth T. 1963. Klassofikation der Saugetiere: Artiodactyla[J]. Handbuch der Zoologie, 32: 1-167.

Librado P, Rozas J. 2009. DnaSP v5: a software for comprehensive analysis of DNA polymorphism data[J]. Bioinformatics, 25: 1451-1452.

Pennisi E. 2006. Speciation standing in place[J]. Science, 311: 1372-1374.Pritchard JK, Stephens M, Donnelly P. 2000. Inference of population structure using multilocus genotype data[J]. Genetics, 155: 945-959.

Raymond M, Rousset F. 1995. GENEPOP (version 1.2): population genetics software for exact tests and ecumenicism[J]. Journal of Heredity, 86: 248-249.

Rothschild L. 1922. On a new race of bharal[J]. Annals & Magazine of Natural History, 10: 231.

Tamura K, Stecher G, Peterson D,etal. 2013. MEGA6: molecular evolutionary genetics analysis version 6.0[J]. Molecular Biology and Evolution, 30: 2725-2729.

van Oosterhout C, Hutchinson WF, Wills DPM,etal. 2004. Software for identifying and correcting genotype errors in microsatellite data[J]. Molecular Ecology Notes, 4: 535-538.

Wang X, Hoffmann RS. 1987.PseudoisnayaurandPseudoisschaeferi[J]. Mammalian Species, 278: 1-6.

Wang XM, Peng JT, Zhou HM. 2000. Preliminary observations on the distribution and status of dwarf blue sheepPseudoisschaeferi[J]. Oryx, 34: 21-26.

Wright S. 1978. Evolution and the genetics of populations: variability within and among natural populations[M]. Chicago: University of Chicago Press: 4.

Zeng B, Xu L, Yue B,etal. 2008. Molecular phylogeography and genetic differentiation of blue sheepPseudoisnayaurszechuanensisandPseudoisschaeferiin China[J]. Molecular Phylogenetics and Evolution, 48: 387-395.

The Evolutionary Status Analysis of Dwarf Blue Sheep Based on DNA Barcording and Microsatellite Markers

TAN Shuai, PENG Rui, PENG Quekun, ZOU Fangdong*

(Sichuan Key Laboratory of Conservation Biology on Endangered Wildlife, Key Laboratory of Bio-resources and Eco-environment, College of Life Sciences, Sichuan University, Chengdu 610064, China)

As a unique species in genusPseudois,Pseudoisnayauris endemic to the Tibetan Plateau and surrounding mountains, and this species is also the representative ungulate herbivore in this area. The taxonomic status of a specific population named dwarf blue sheep has been widely debated. In this study, 26 samples including 5 dwarf blue sheep were collected from the distribution area. The DNA barcording and 8 nuclear microsatellite markers were chosen to discuss the phylogenetic relationships among dwarf blue sheep and different geographic populations ofP.nayaur, and to study the evolutionary status of dwarf blue sheep in genusPseudois. The results showed that gene flow occurred between dwarf blue sheep andP.nayaur, and dwarf blue sheep should be classified as a specific population of Sichuan subspecies rather than a new species or a new subspecies. In addition, based on the results of the habitat selection and the ecological data, we speculated that the present dwarf blue sheep was probably in the early stage of separate evolution.

Pseudoisnayaur; dwarf blue sheep; genetic differentiation; DNA barcording; microsatellite markers

2016-05-03 接受日期：2016-07-20

教育部科學(xué)技術(shù)研究項目(113054A)

譚帥(1986—), 男, 博士研究生, 從事分子生物學(xué)研究, E-mail:christan1@163.com

*通信作者Corresponding author, E-mail:fundzou@scu.edu.cn

10.11984/j.issn.1000-7083.20160110

Q959.8

A

1000-7083(2016)05-0654-06