張亞宏，甘 瑩，齊建國，王建紅

（河南大學，天然藥物與免疫工程重點實驗室，開封475004）

米托蒽醌通過活性氧誘導大鼠肝癌RH35細胞凋亡的研究

張亞宏，甘 瑩，齊建國＊，王建紅＊

（河南大學，天然藥物與免疫工程重點實驗室，開封475004）

摘 要：試驗旨在探討米托蒽醌（mitoxantrone，MTN）對大鼠肝癌RH35細胞毒性及其作用機制。以MTT法檢測MTN的細胞毒性，顯微鏡觀察細胞形態(tài)變化，流式細胞儀檢測細胞凋亡率及細胞中活性氧（reactive oxygen species，ROS）的產(chǎn)生，Western blotting檢測相關蛋白的表達。結果顯示，MTN時間和劑量依賴性地抑制RH35細胞的生長；15μmol／L MTN作用于細胞24、48h后可使細胞皺縮、變圓，并出芽形成明顯的凋亡小體，且其可時間依賴性地誘導凋亡細胞比率的增加及ROS的產(chǎn)生；ROS清除劑NAC可以極顯著降低MTN誘導的RH35細胞的ROS的產(chǎn)生和凋亡率（P＜0.01）；15mmol／L NAC可以下調MTN誘導的caspase－3、Bax及CytC表達增加，上調MTN誘導的Bcl－2表達降低。結果提示，MTN通過增加細胞內ROS而誘導RH35細胞發(fā)生凋亡。

關鍵詞：米托蒽醌；凋亡；RH35細胞；活性氧

肝癌是中國僅次于胃癌、食道癌的第三大常見惡性腫瘤，其惡性程度高，發(fā)展迅速，早期癥狀不明顯，往往造成根治性手術治療困難［1－2］。藥物治療仍是目前肝癌治療的重要方法，但是肝癌細胞對化療藥物具有不敏感性［3］，因此，闡明藥物的抗肝癌機制對肝癌的治療至關重要。米托蒽醌（mitoxantrone，MTN）是蒽醌類細胞周期非特異性廣譜抗腫瘤藥物，心臟毒性較小，臨床上主要用于治療惡性淋巴瘤、乳腺癌和急性白血病，對肺癌、黑色素瘤、卵巢癌等也有一定的療效［4－5］。臨床研究表明，MTN對肝癌具有良好的療效，但是其具體機制還不甚明了［6－7］。凋亡是很多化療藥物殺傷腫瘤細胞的有效機制［8］，研究表明，MTN可以誘導多種腫瘤細胞發(fā)生凋亡，進而達到殺傷腫瘤細胞的效果。齊美穎等［9］發(fā)現(xiàn)MTN可以激活內、外源性凋亡通路誘導人骨髓瘤細胞RPMI8226凋亡；王煒等［10］闡明MTN通過抑制PI3K／Akt信號通路誘導人鼻咽癌CNE－2細胞發(fā)生凋亡；魏建勛等［11］發(fā)現(xiàn)MTN通過抑制Mcl－1再抑制人卵巢癌COC1細胞增殖誘導其凋亡；Kostrzewa－Nowak等［12］發(fā)現(xiàn)MTN可以誘導人白血病HL60細胞及其耐藥細胞HL60／DOX發(fā)生凋亡。本研究選用大鼠肝癌RH35細胞為研究對象，研究MTN對該腫瘤細胞凋亡誘導作用并探討其機制，為其在抗肝癌中的應用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料

大鼠肝癌RH35細胞系購自武漢博士德生物工程有限公司。MTN購自中國藥品生物制品檢定所；甲基噻唑藍（MTT）、二甲基亞砜（DMSO）、N－乙酰半胱氨酸（N－acetylcysteine，NAC）和2，7－二氯熒光黃雙乙酸鹽（DCF－DA）均購自美國Sigma公司；caspase－3、Bax、Bcl－2、CytC及β－actin的單克隆抗體均購自Santa Cruz Biotechnology公司；辣根過氧化酶標記的羊抗兔、羊抗鼠二抗均購自武漢博士德生物工程有限公司；RPMI 1640培養(yǎng)基和胰蛋白酶均購自美國Gibco公司；胎牛血清購自北京元亨圣馬生物試劑公司；Annexin V－FITC／PI凋亡檢測試劑盒購自碧云天生物技術研究所。

1.2細胞培養(yǎng)

大鼠肝癌RH35細胞單層接種在含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液中，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2～3d傳代一次。

1.3MTT檢測細胞生長抑制

取對數(shù)生長期的RH35細胞，以每孔1.0×104個細胞接種于96孔板，每孔100μL，培養(yǎng)24h后，加入不同濃度（1、5、10、30、50μmol／L）的MTN。每組設置3個重復，同時設置陰性對照。置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)12、24及48h后，每孔加入MTT（5g／L）10μL再培養(yǎng)3h后，棄上清液，每孔加入150μL DMSO溶解，于酶標儀下測定各孔吸光值（A492nm值），根據(jù)以下公式計算抑制率：

抑制率（%）＝［A492nm（陰性）－A492nm（給藥）］／［A492nm（陰性）－A492nm（空白）］×100%

1.4細胞形態(tài)學觀察

取對數(shù)生長期的RH35細胞，以每孔5.0×105個細胞接種于6孔板中，培養(yǎng)24h后加入15μmol／L MTN，置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24、48h后，用倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài)并拍照。

1.5流式細胞儀檢測細胞凋亡率和細胞內活性氧

取對數(shù)生長期的RH35細胞，以每瓶1×106個細胞分瓶，培養(yǎng)24h后，加入15μmol／L MTN，置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)12、24、36及48h；或加入5mmol／L NAC作用1h后加入15μmol／L MTN，繼續(xù)培養(yǎng)24h。收集細胞，用PBS清洗1次，根據(jù)Annexin V－FITC／PI染色試劑盒說明操作后，流式細胞儀分析，計算細胞凋亡率；或加入5μmol／L DCF－DA染液，37℃孵育30min，于激發(fā)波長513nm、發(fā)射波長530nm下用流式細胞儀檢測細胞內活性氧（ROS）水平。

1.6Western blotting分析

取對數(shù)生長期的RH35細胞，以每瓶1×106個細胞分瓶，培養(yǎng)24h后，加入5mmol／L NAC作用1h后加入15μmol／L MTN，繼續(xù)培養(yǎng)24h。收集細胞，用100μL細胞裂解液冰浴裂解1h，15 000r／min離心5min，收集上清。加入5×上樣緩沖液，沸水中煮沸3min，使蛋白質變性。Bio－Rad法進行蛋白定量后以12%SDS－PAGE凝膠電泳分離蛋白質。電泳后將蛋白轉印至硝酸纖維素膜上，5%脫脂奶粉封閉后，一抗封閉過夜，再以辣根過氧化酶標記的二抗封閉液封閉2h，以二氨基聯(lián)苯胺溶液顯色，掃描記錄。

1.7統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)用平均值±標準差表示。用SPSS 13.0軟件中的One－Way ANOVA進行統(tǒng)計比較，P＜0.05為差異顯著性判斷標準。

2 結果與分析

2.1MTN對RH35細胞的細胞毒性

MTN可時間和劑量依賴性地抑制RH35細胞生長。由圖1可知，1～50μmol／L MTN對RH35細胞生長具有不同程度的抑制作用，且隨著MTN濃度增強，作用時間延長，其對RH35的毒性也在增強。其在12、24和48h的IC50值分別為22.46、14.92和10.1μmol／L。在24h時，15μmol／L MTN可誘導明顯的生長抑制，因此，選用其為以下研究的濃度。

圖1　MTN對RH35細胞的細胞毒性Fig.1 Cytotoxic effects of MTN on RH35cells

2.2MTN誘導RH35細胞凋亡

顯微鏡下發(fā)現(xiàn)，正常對照組細胞形態(tài)完整，細胞連接緊密，無死亡細胞（圖2A），而15μmol／L MTN作用于細胞24、48h后，細胞發(fā)生明顯的形態(tài)學變化，細胞皺縮、變圓，并出芽形成明顯的凋亡小體（圖2B、2C）。此外，流式細胞術結果提示，15μmol／L MTN作用于細胞12、24、36及48h后，凋亡細胞比率（早期凋亡細胞＋晚期凋亡細胞）呈時間依賴性增加，表明MTN可以時間依賴性地誘導RH35細胞發(fā)生凋亡（圖3）。

圖2　MTN誘導RH35細胞形態(tài)學變化（200×）Fig.2 MTN induced morphologic changes in RH35cells（200×）

圖3　MTN時間依賴性誘導RH35細胞凋亡Fig.3 MTN time－dependently induced apoptosis in RH35cells

2.3MTN誘導RH35細胞內ROS的產(chǎn)生

由圖4可知，15μmol／L MTN作用于細胞0h細胞ROS水平為1.53%，而作用12、24、36及48h后ROS水平分別為16.69%、25.25%、38.03%、48.17%。結果表明，MTN可時間依賴性的增加細胞內ROS的水平。

圖4　MTN時間依賴性誘導RH35細胞內ROS的產(chǎn)生Fig.4 MTN time－dependently induced intracellular ROS generation in RH35cells

2.4NAC對MTN誘導的RH35細胞內ROS的影響

由圖5可知，NAC為ROS清除劑，加入5mmol／L NAC后，15μmol／L MTN作用細胞24h ROS水平由26.57%下降為10.60%，表明NAC可以極顯著降低ROS的水平（P＜0.01）。

圖5　NAC對MTN誘導的RH35細胞內ROS的影響Fig.5 Effect of NAC on MTN－induced ROS in RH35cells

2.5NAC對MTN誘導的RH35細胞凋亡的影響

由圖6可知，15μmol／L MTN作用細胞24h凋亡率為33.56%，加入NAC后，其細胞凋亡率降為17.10%，表明NAC可以極顯著降低MTN誘導的細胞凋亡（P＜0.01）。

2.6NAC對MTN誘導的RH35細胞凋亡相關蛋白表達的影響

由圖7可知，15μmol／L MTN作用細胞24h后，caspase－3前體表達下降而活性形式表達增加，促凋亡蛋白Bax及CytC表達增加，抑凋亡蛋白Bcl－2表達下降；加入NAC后，可以明顯逆轉上述蛋白的變化，即MTN誘導的caspase－3的活化明顯下調，促凋亡蛋白Bax的增加及抑凋亡蛋白Bcl－2的下降均被抑制，進一步表明NAC可以抑制MTN誘導的細胞凋亡。

圖6　NAC對MTN誘導的RH35細胞凋亡的影響Fig.6 Effect of NAC on MTN－induced apoptosis in RH35cells

圖7　NAC對MTN誘導的RH35細胞凋亡相關蛋白表達的影響Fig.7 Effect of NAC on MTN－induced expressions of apoptosis related proteins in RH35cells

3 討 論

蒽環(huán)類藥物是最有效的抗腫瘤藥物，臨床上常用的阿霉素、多柔比星、MTN均是以蒽環(huán)結構為母環(huán)的，具有良好的療效。臨床研究表明，MTN對肝癌具有良好的療效［6－7］，但是其作用機制尚不明確，研究其抗肝癌機制，有利于該類化合物的結構優(yōu)化，為開發(fā)新藥奠定基礎，并有利于指導MTN的臨床用藥。

細胞凋亡又稱細胞程序性死亡，是在特定基因調控下細胞主動的死亡過程，其受細胞內外多種信號刺激的調控，是維持細胞內環(huán)境穩(wěn)定的重要機制［13－14］。MTN時間、劑量依賴性地抑制RH35細胞生長，倒置顯微鏡下觀察到其可以使細胞浮起、變圓，并出芽形成凋亡小體。Annexin V－FITC／PI雙染陽性細胞與Annexin V－FITC陽性細胞相加所成的細胞凋亡率也隨著MTN加入時間的延長而增加，提示MTN誘導RH35細胞發(fā)生了凋亡。細胞凋亡的過程中，很多蛋白家族參與了凋亡的調控，其中caspase家族為一類與凋亡密切相關的酶類，其在凋亡過程中發(fā)揮著重要的作用，而caspase－3則被認為是凋亡的標志之一［15－16］；Bcl－2家族蛋白及CytC是線粒體途徑凋亡的重要參與因子，Bcl－2家族促／抗凋亡蛋白的平衡決定著細胞凋亡的進程［17］。加入MTN后，caspase－3被激活而其前體procaspase－3表達量減少。MTN可以誘導促凋亡蛋白Bax表達增加，抑凋亡蛋白Bcl－2表達下降，并可以促進CytC的釋放。這些凋亡相關蛋白的變化進一步證明MTN誘導RH35細胞發(fā)生了凋亡。

ROS在細胞的各種生命進程中都發(fā)揮著重要的作用，其可作為第二信使調節(jié)與細胞增殖、分化、凋亡等相關的信號轉導通路［18－20］。研究表明，蒽環(huán)類藥物阿霉素誘導腫瘤細胞死亡的主要機制是誘導ROS的產(chǎn)生進而損壞線粒體而誘導腫瘤細胞凋亡［21］。Xie等［22］發(fā)現(xiàn)黃連素可以通過誘導ROS的產(chǎn)生調節(jié)Bcl－2家族促／抗凋亡蛋白的比率進而誘導人乳腺癌MCF－7及MDA－MB－231細胞凋亡。此外，Arnold等［23］亦證實MTN可以通過增加ROS的水平誘導人紅細胞程序性死亡（eryptosis，紅細胞凋亡）。本研究結果發(fā)現(xiàn)，MTN可以誘導ROS的產(chǎn)生，清除了ROS后，MTN所引起的凋亡被抑制，而由MTN引起的凋亡相關蛋白表達的變化均被逆轉，證明ROS在MTN誘導凋亡中發(fā)揮著重要的作用，其介導了MTN誘導的凋亡，即MTN通過誘導RH35細胞ROS的產(chǎn)生而誘導凋亡。而在此過程中MTN如何誘導ROS的產(chǎn)生及其他信號轉導通路是否參與凋亡的調控還需進一步研究。

4 結 論

本研究結果表明，MTN對大鼠RH35細胞具有較強的細胞毒性，其是通過誘導RH35細胞內ROS的產(chǎn)生，進而誘導細胞凋亡來實現(xiàn)的。

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（責任編輯 晉大鵬）

中圖分類號：Q813.5

文獻標識碼：A

文章編號：1671－7236（2016）12－3245－06

doi：10.16431／j.cnki.1671－7236.2016.12.024

收稿日期：2016－08－26

基金項目：國家自然科學基金（U1404819）；河南省自然科學基金（132300410228）

作者簡介：張亞宏（1982－），女，山東濟寧人，博士，副教授，研究方向：毒理學與腫瘤藥理學，E－mail：zhangyahong＿131＠163.com

通信作者：＊齊建國（1985－），男，遼寧沈陽人，博士，副教授，研究方向：毒理學與藥物化學，E－mail：qijianguo＠henu.edu.cn王建紅（1971－），男，河南許昌人，博士，教授，研究方向：毒理學與藥物化學，E－mail：jhworg＠126.com

Mitoxantrone Induced Apoptosis through ROS in Rat Hepatama RH35Cell Line

ZHANG Ya－h(huán)ong，GAN Ying，QI Jian－guo＊，WANG Jian－h(huán)ong＊
（KeyLaboratoryofNaturalMedicineandImmuno－engineering，HenanUniversity，Kaifeng475004，China）

Abstract：The assay was aimed to study the cytotoxicity and mechanisms of mitoxantrone（MTN）in rat hepatama cell line RH35.MTT assay was performed to assess the cytotoxicity of MTN，and microscope was used to observe cellular morphologic changes.Apoptotic ratio and intracellular ROS generation were measured by flow cytometric analysis.The protein expression was examined by Western blotting analysis.The results showed that MTN inhibited RH35cell growth in a timeand concentration－dependent manner.The morphologic changes were observed in the cells，including cell shrinkage，membrane blebbing and apoptotic bodies when treated with 15μmol／L MTN for 24and 48h.And MTN also induced the increase of apoptotic ratio and generation of ROS in a time dependent manner.In addition，the intracellular ROS generation ratio and the apoptotic ratio of MTN treated group were extremely decreased by the ROS scavenger NAC（P＜0.01）.The pretreatment of RH35cells with 15mmol／L NAC thoroughly reversed the MTN－induced enhancement of caspase－3，Bax and CytC level and attenuation of Bcl－2level.In conclusion，MTN induced apoptosis in RH35cells through increasing the generation of ROS.

Key words：mitoxantrone；apoptosis；RH35cell；ROS