潘春暉，楊紅玉，張 煊，，任園琴，彭曉鳳，劉 濤，＊

（1.四川德成動物保健品有限公司，德陽618100；2.成都大學藥學與生物工程學院，成都610106）

清瘟敗毒散的質量標準提升研究

潘春暉1，楊紅玉1，張 煊1，2，任園琴2，彭曉鳳2，劉 濤1，2＊

（1.四川德成動物保健品有限公司，德陽618100；2.成都大學藥學與生物工程學院，成都610106）

摘 要：為完善清瘟敗毒散的質量標準，采用薄層色譜鑒別清瘟敗毒散中的黃連、地黃、梔子、連翹、知母、淡竹葉；采用HPLC法測定清瘟敗毒散中的梔子苷含量，色譜條件為：ODS C18色譜柱（4.6mm ID×250mm，5μm），乙腈－水（13∶87）為流動相，檢測波長為238nm。研究結果表明，在建立的薄層色譜鑒別結果中，在與對照藥材色譜相對應的位置上，供試品色譜顯示相同顏色的斑點，且陰性樣品無干擾；梔子苷在0.062～0.370μg范圍內(nèi)具有良好的線性關系，其回歸方程為y＝1 789.1x－14.296，R2＝0.99984，平均回收率為99.60%，RSD為0.76%。本方法簡單、準確、重復性好，能更好地控制清瘟敗毒散的質量，可作為清瘟敗毒散的質量標準。

關鍵詞：清瘟敗毒散；質量標準；薄層色譜；測定

清瘟敗毒飲是清代著名溫病學家余師愚所創(chuàng)制的名方［1］，治一切火熱，表里俱盛，狂躁煩心，口干咽痛，大熱干嘔，錯語不眠，吐血衄血，熱盛發(fā)斑［2］，載于其所著的《疫疹一得》一書中，現(xiàn)收錄于《中華人民共和國獸藥典》2010年版二部。本藥由石膏、地黃、水牛角、黃連等14味藥材組成，是“白虎湯”、“黃連解毒湯”和“犀角地黃湯”3方加減化裁而得［3］。清瘟敗毒散由清瘟敗毒飲改劑型而來，具有瀉火解毒，涼血的功效，在獸藥臨床上主要用于治療熱毒發(fā)斑，高熱神昏［4］，在臨床上有著較好的療效，被收載于2010年版《中華人民共和國獸藥典》二部，其現(xiàn)有法定質量標準簡單，僅有顯微鑒別和黃連的薄層鑒別，無含量測定項，該標準很難控制其產(chǎn)品質量，不能保證產(chǎn)品臨床療效。為了提升清瘟敗毒散的質量標準，保證產(chǎn)品的安全性、有效性與質量可控性，本試驗對其進行了研究。

1 材料與方法

1.1儀器與試劑

FA2004分析電子天平購自上海良平儀器儀表有限公司；DZF－6050型真空干燥箱購自北京中興偉業(yè)儀器有限公司；P230II型高效液相色譜儀測定系統(tǒng)購自大連伊力特分析儀器有限公司。正丁醇、冰乙酸、甲醇、乙酸乙酯、三氯甲烷、氨水、硫酸、香蘭素、丙酮、甲酸、二甲苯均為分析純均購自成都市科龍化工試劑廠；清瘟敗毒散購自四川德成動物保健品有限公司；石膏、地黃、水牛角、黃連、梔子、牡丹皮、黃芩、赤芍、玄參、知母、連翹、桔梗、甘草、淡竹葉對照藥材均購自中國食品藥品檢定研究院。

1.2薄層鑒別

1.2.1黃連的薄層鑒別 參照文獻［5－7］報道的方法，取清瘟敗毒散2g，加甲醇25mL，超聲30min，濾過，濾液蒸干，殘渣加甲醇2mL使其溶解，作為供試品溶液；取黃連對照藥材0.25g，按清瘟敗毒散處方（除去黃連藥材），同法制成對照藥材溶液和陰性樣品溶液。分別吸取供試品溶液、對照藥材溶液與陰性樣品溶液，點于同一硅膠G薄層板上，以正丁醇－冰醋酸－水（10∶1∶2）為展開劑，展開、取出、晾干，置紫外光燈（365.5nm）下檢視。

1.2.2地黃的薄層鑒別 參照文獻［8－10］報道的方法，取清瘟敗毒散2g，加甲醇25mL，超聲處理30min，濾過，濾液蒸干，殘渣加水10mL使其溶解，采用乙酸乙酯振搖提取2次，每次10mL，合并乙酸乙酯液，蒸干，殘渣加甲醇2mL溶解，作為供試品溶液；取地黃對照藥材1g，按清瘟敗毒散處方（除去地黃藥材），同法制成對照藥材溶液和陰性樣品溶液。分別吸取供試品溶液、對照藥材溶液與陰性樣品溶液，點于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷－甲醇－氨水（14∶1∶0.1）為展開劑，展開、取出、晾干，噴以5%香草醛硫酸溶液，在105℃下，加熱至斑點清晰。

1.2.3梔子的薄層鑒別 參照文獻［11－13］報道的方法，取本品粉末2g，加50%甲醇25mL，超聲處理40min，濾過，濾液蒸干，加甲醇2mL溶解，作為供試品溶液。另取梔子對照藥材0.5g、按清瘟敗毒散處方（除去梔子藥材），同法制成對照藥材溶液和陰性樣品溶液。再取梔子苷對照品，加甲醇制成每1mL含4mg的溶液，作為對照品溶液。照薄層色譜法（附錄ⅥB）試驗，吸取上述4種溶液，分別點于同一硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯－丙酮－甲酸－水（5∶5∶1∶1）為展開劑，展開、取出、晾干。供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應的位置上，顯相同顏色的黃色斑點；再噴以10%硫酸乙醇溶液，在110℃加熱至斑點顯色清晰。

1.2.4連翹的薄層鑒別 參照文獻［14－16］報道的方法，取清瘟敗毒散2g，加甲醇10mL，超聲處理30min，過濾，取濾液作為供試品溶液；取連翹對照藥材1g、按清瘟敗毒散處方（除去連翹藥材），同法制成對照藥材溶液和陰性樣品溶液。吸取供試品溶液、對照藥材溶液和陰性樣品溶液，點于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷－甲醇（5∶1）為展開劑，展開、取出、晾干，噴以10%的硫酸乙醇溶液，在105℃下加熱至斑點清晰。

1.2.5淡竹葉的薄層鑒別 參照文獻［17］報道的方法，取清瘟敗毒散2g，加甲醇10mL超聲處理30min，過濾，濾液蒸干，加甲醇2mL溶解，作為供試品溶液；取淡竹葉0.5g、按清瘟敗毒散處方（除去淡竹葉藥材），同法制成對照藥材溶液和陰性樣品溶液。分別吸取供試品溶液、對照藥材溶液、陰性樣品溶液，點于同一硅膠G薄層板上，以二甲苯－乙酸乙酯－丙酮－甲酸－水（2.2∶4.8∶2.5∶0.8∶1.5）為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈（365.5nm）下檢視。

1.2.6知母的薄層鑒別 參照文獻［18－19］報道的方法，取本品粉末2g，加30%丙酮10mL，超聲處理20min，取上清液作為供試品溶液。另取知母對照藥材0.2g、按清瘟敗毒散處方（除去知母藥材），同法制成對照藥材溶液和陰性樣品溶液。照薄層色譜法（附錄ⅥB）試驗，吸取上述3種溶液，分別點于同一硅膠G薄層板上，以正丁醇－冰醋酸－水（4∶1∶5）的上層溶液為展開劑，展開、取出、晾干，置紫外光燈（365.5nm）下視檢。

1.3清瘟敗毒散中梔子苷的含量測定

1.3.1色譜條件的篩選 參考2015版《中華人民共和國藥典》一部［11］梔子項下梔子苷含量測定方法，色譜柱為（C18 4.6mm ID×250mm，5μm）；流速為1.0mL／min；檢測波長為238nm；柱溫為室溫；進樣體積為10μL；以分離度R為指標，考察流動相。

1.3.2供試品溶液制備方法研究

1.3.2.1提取方式 取2份清瘟敗毒散各2.0g，精密稱定，精密移取25mL甲醇加入，稱定重量，分別超聲（功率100W，頻率40kHz）提取與加熱回流提取30min，放冷至室溫，補足減失重量，過濾，取續(xù)濾液作為供試品，按照2.2.1項下色譜條件測其含量。

1.3.2.2提取溶媒種類 取清瘟敗毒散2.0g、3份，精密稱定，置具塞錐形瓶中，分別精密移取25mL水、無水乙醇，甲醇加入，稱定重量，超聲處理30min，放冷至室溫，補足減失重量，過濾，取續(xù)濾液作為供試品，按照2.2.1項下色譜條件測其含量。

1.3.2.3溶媒濃度 取4份清瘟敗毒散各2.0g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，分別精密移取25mL 25%、50%、75%、100%的甲醇加入，稱定重量，超聲處理30min，放冷至室溫，補足減失重量，過濾，取續(xù)濾液作為供試品，按照2.2.1項下色譜條件測其含量。

1.3.2.4溶媒用量 取4份清瘟敗毒散各2.0g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，分別精密移取75%的甲醇10、25、50、100mL加入，稱定重量，超聲處理30min，放冷至室溫，補足減失重量，過濾，取續(xù)濾液作為供試品，按照2.2.1項下色譜條件測其含量。

1.3.2.5提取時間 取4份清瘟敗毒散各2.0g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密移取50mL 75%的甲醇加入，稱定重量，分別超聲處理15、30、45、60min，放冷至室溫，補足減失重量，過濾，取續(xù)濾液作為供試品，按照2.2.1項下色譜條件測其含量。

1.3.3對照品溶液、對照藥材溶液與陰性樣品溶液的制備 精密稱取梔子苷對照品適量，加甲醇制成每1mL含0.0309mg的溶液，作為對照品溶液；取梔子對照藥材0.1g、清瘟敗毒散處方（除梔子藥材），按供試品溶液的制備方法，同法制得對照藥材溶液與陰性樣品溶液。

1.3.4梔子苷的方法學研究

1.3.4.1專屬性 取對照品溶液、供試品溶液、陰性樣品溶液在2.2.1所確定的色譜條件下進樣分析。

1.3.4.2線性關系 使用自動進樣器分別吸取梔子苷對照品（0.0309mg／mL）2、4、6、8、10、12μL，按2.2.1的色譜條件進樣分析。

1.3.4.3精密度 使用自動進樣器吸取梔子苷對照品（0.0309mg／mL）10μL，按2.2.1的色譜條件連續(xù)進樣6次，根據(jù)峰面積計算RSD值。

1.3.4.4穩(wěn)定性 取清瘟敗毒散2.0g，精密稱定，精密移取50mL 75%的甲醇，超聲提取30min，放冷至室溫，補足減失重量，濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。按2.2.1的色譜條件于0、2、4、6、8、10h分別進樣。根據(jù)梔子苷的峰面積計算RSD值。

1.3.4.5重復性 取清瘟敗毒散2.0g、6份，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密移取50mL 75%的甲醇加入，稱定重量，超聲處理30min，放冷至室溫，補足減失重量，過濾，取續(xù)濾液作為供試品。按2.2.1的色譜條件分別進樣，根據(jù)梔子苷的含量計算RSD值。

1.3.4.6加樣回收率試驗 取已知含量的清瘟敗毒散1.0g、6份，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密移取50mL 75%的甲醇和2.6mL梔子苷對照品（0.2732mg／mL），稱定重量，超聲處理30min，放冷至室溫，補足減失重量，過濾，取續(xù)濾液作為供試品。按2.2.1的色譜條件分別進樣，根據(jù)峰面積測定梔子苷含量，計算回收率、平均加樣回收率及RSD值。

2 結果與分析

2.1薄層鑒別

清瘟敗毒散組方中黃連、地黃、梔子、連翹、淡竹葉及知母的薄層鑒別，與對照藥材色譜相對應的位置，供試品色譜顯示相同顏色的斑點，且陰性樣品無干擾結果（圖1～6）。

2.2清瘟敗毒散中梔子苷的含量測定

2.2.1色譜條件的篩選 以乙腈－水（15∶85）為流動相，結果顯示供試品色譜中梔子苷與后一峰的分離度R＝0.86＜1.5，達不到分離要求；以乙腈－水（13∶87）為流動相，結果顯示供試品色譜中梔子苷與后一峰的分離度R＝1.61＞1.5，滿足分離要求。故后續(xù)試驗梔子色譜條件：苷色譜柱為（C18 4.6mm ID×250mm，5μm）；流速為1.0mL／min；檢測波長為238nm；柱溫為室溫；進樣體積為10μL；流動相為乙腈－水（13∶87）。

2.2.2供試品溶液制備方法研究

2.2.2.1提取方式 超聲與加熱回流提取兩種提取方式所得梔子苷含量均為0.070%。超聲簡便，且節(jié)約時間。

2.2.2.2提取溶媒種類 25mL水、無水乙醇，甲醇超聲提取30min，所得梔子苷含量分別為0.032%、0.047%、0.061%。

圖1　黃連的薄層鑒別Fig.1 The TLC identification ofCoptis

圖2　地黃的薄層鑒別Fig.2 The TLC identification ofRadixRehmanniae

圖3　梔子的薄層鑒別Fig.3 The TLC identification ofGardenia

圖4　連翹的薄層鑒別Fig.4 The TLC identification ofForsythia

圖5　淡竹葉的薄層鑒別Fig.5 The TLC identification ofLophatherumgracileBrongn

圖6　知母的薄層鑒別Fig.6 The TLC identification ofRhizomaanemarrhenae

2.2.2.3溶媒濃度 25mL 25%、50%、75%、100%的甲醇超聲提取30min，所得梔子苷含量分別為0.060%、0.063%、0.066%、0.063%。

2.2.2.4溶媒用量 10、25、50、100mL 75%的甲醇超聲提取30min，所得梔子苷含量分別為0.0586%、0.0537%、0.0625%、0.0590%。

2.2.2.5提取時間 50mL 75%的甲醇超聲處理15、30、45、60min，所得梔子苷含量分別為0.0606%、0.0628%、0.0629%、0.0633%，當提取時間達到30min后，梔子苷含量基本不再增加。

2.2.3供試品溶液的制備 經(jīng)上述考察，供試品溶液的制備方法為：取清瘟敗毒散2.0g，精密稱定，精密移取50mL 75%的甲醇，超聲提取30min，放冷至室溫，補足減失重量，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.4梔子苷的方法學研究

2.2.4.1專屬性 供試品色譜圖在與梔子苷對照品色譜圖主峰相應的保留時間處有峰，且陰性樣品色譜圖在與梔子苷對照品色譜圖主峰相應的保留時間處無峰，即陰性無干擾（圖7～9）。

圖7　梔子苷對照品色譜Fig.7 The control chromatogram ofGardenin

圖8　供試品色譜圖Fig.8 The chromatography of samples

圖9　陰性樣品色譜圖Fig.9 The chromatography of negative samples

2.2.4.2線性關系 以梔子苷進樣量（μg）為橫坐標，峰面積（mAU）為縱坐標，計算回歸方程為y＝1789.1x－14.296，R2＝0.99984，表明梔子苷在0.062～0.370μg范圍內(nèi)具有良好的線性關系。

2.2.4.3精密度 按2.2.1的色譜條件連續(xù)進樣6次，峰面積分別為596.262、593.426、592.462、591.343、588.809、591.483mAU，根據(jù)峰面積計算RSD值為0.292%。

2.2.4.4穩(wěn)定性 按2.2.1的色譜條件于0、2、4、6、8、10h進樣，峰面積分別為920.199、923.574、925.085、920.760、925.430、918.162。根據(jù)梔子苷的峰面積計算RSD值為0.335%。

2.2.4.5重復性 按2.2.1的色譜條件測定6份樣品的梔子苷含量分別為0.0711%、0.0716%、0.0715%、0.0706%、0.0620%、0.0613%，根據(jù)梔子苷的含量計算RSD值為1.098%。

2.2.4.6加樣回收率試驗 按2.2.1的色譜條件進樣，根據(jù)峰面積測定梔子苷含量，計算回收率分別為98.42%、99.11%、100.52%、100.12%、99.92%、99.51%，平均加樣回收率為99.60%，RSD值為0.76%。

3 討 論

清瘟敗毒散中梔子的薄層鑒別，供試品的點樣量較少時，供試品色譜與梔子對照藥材色譜在相同位置上有一個草綠色斑點，但供試品色譜與梔子苷對照品色譜在相應的位置上無斑點；供試品點樣量增加后，草綠色斑點消失，梔子苷對應的斑點顯現(xiàn)，這可能是因為清瘟敗毒散中梔子苷含量低，隨著點樣量的增加，梔子苷對應的斑點顯現(xiàn)出來，草綠色斑點卻被其他成分的斑點覆蓋。

清瘟敗毒散作為中獸藥大復方制劑，組成成分復雜，本試驗曾對清瘟敗毒散組方中的牡丹皮、玄參、桔梗等進行薄層定性鑒別，都因陰性干擾嚴重，專屬不強等原因無法建立其鑒別方法。

黃有霖等［5］研究表明黃連鑒別的展開劑正丁醇－冰醋酸－水（7∶1∶2），發(fā)現(xiàn)亮黃色斑點相互重疊，分離度不好；曾試驗2015版《中國藥典》一部連翹項下薄層鑒別的展開劑三氯甲烷－甲醇（8∶1），發(fā)現(xiàn)展開速度太慢，展開效果不理想；照2015版《中國藥典》一部項下梔子苷的含量測定方法，也不能直接用于清瘟敗毒散中梔子苷的含量測定。不能直接將已有法定標準或文獻報道的單味藥材鑒別與含量測定方法，照搬作為中藥復方中藥材的鑒別方法。復方中藥的的成分更加復雜，成分之間的相互干擾更加嚴重。

清瘟敗毒散現(xiàn)有法定標準雖有性狀及顯微鑒別，但缺乏專屬性；僅有黃連的薄層鑒別，但處方中有14味藥材，遠遠不能控制產(chǎn)品質量；缺乏定量指標，不符合現(xiàn)代復方中藥的質量控制模式。本研究有利于提升清瘟敗毒散的質量標準。

4 結 論

本試驗采用薄層色譜鑒別清瘟敗毒散中的黃連、地黃、梔子、連翹、知母、淡竹葉；采用HPLC法測定清瘟敗毒散中的梔子苷含量。薄層色譜鑒別中，在與對照藥材色譜相對應的位置上，供試品色譜顯示相同顏色的斑點，且陰性樣品無干擾；梔子苷在0.062～0.370μg范圍內(nèi)具有良好的線性關系，其回歸方程為y＝1789.1x－14.296，R2＝0.99984，平均回收率為99.60%，RSD為0.76%。本方法簡單、準確、重復性好，能更好地控制清瘟敗毒散的質量，可作為清瘟敗毒散的質量標準。

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（責任編輯 秦 彤）

中圖分類號：S854.5

文獻標識碼：A

文章編號：1671－7236（2016）12－3170－07

doi：10.16431／j.cnki.1671－7236.2016.12.013

收稿日期：2016－03－10

基金項目：四川省千人計劃支持項目（川特聘第332號）

作者簡介：潘春暉（1974－），男，四川達州人，學士，高級獸醫(yī)師，主要從事獸藥研究開發(fā)，E－mail：892086915＠qq.com

通信作者：＊劉 濤（1976－），男，四川南充人，博士，研究員級高級工程師，主要從事中藥新藥研究及成藥質量再評價研究工作，E－mail：liutao0578＠sina.com

Research on the Promotion of Qingwenbaidu Powder Quality Standard

PAN Chun－h(huán)ui1，YANG Hong－yu1，ZHANG Xuan1，2，REN Yuan－qin2，PENG Xiao－feng2，LIU Tao1，2＊
（1.SichuanDechengAnimalHealthProductsCo.，Ltd.，Deyang618100，China；2.PharmaceuticalandBiologicalEngineeringCollege，ChengduUniversity，Chengdu610106，China）

Abstract：To improve the quality standard of Qingwenbaidu powder，TLC was used to qualitative identity ofCoptis，RadixRehmanniae，Gardenia，F(xiàn)orsythia，RhizomaAnemarrhenaandLophatherumgracileBrongn in Qingwenbaidu powder.The content of gardenin was determined by HPLC.Stationary phase were performed on ODS C18column（4.6mm ID×250mm，5μm）and the mobile phase was acetonitrile and water（13∶87），the detection wavelength was 238nm.The results showed that in the relative position of the chromatography of the control medicinal material，the chromatogram of the test sample showed the same color spots，and the negative sample had no interference.There was a good linear relationship（R2＝0.9999）when the garden in range of 0.062to 0.370μg.Its regression equation was y＝1 789.1x－14.296and R2＝0.99984.The average recovery was 99.60%and RSD was 0.76%.This method was simple，accurate and reproducible，which could better control the quality of the Qingwenbaidu powder，and could be used as the quality standard of Qingwenbaidu powder.

Key words：Qingwenbaidu powder；quality standard；TLC；determination