符卓韜，孟聰，王志剛，丘勇超

1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院泌尿外科，廣東 廣州 510405 2.廣州市中醫(yī)醫(yī)院婦科，廣東 廣州 510140

喘可治治療腎陽虛型少精癥實(shí)驗(yàn)研究

符卓韜1，孟聰2，王志剛1，丘勇超1

1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院泌尿外科，廣東 廣州 510405 2.廣州市中醫(yī)醫(yī)院婦科，廣東 廣州 510140

目的：觀察喘可治注射液對(duì)腎陽虛型少精癥雄性大鼠的精子數(shù)量及致雌性大鼠受孕情況的影響。方法：將24只造模成功的腎陽虛雄性大鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組、喘可治低劑量組［2.5 mL/(kg·d）］、喘可治高劑量組［10 mL/（kg·d）］；每天上午9：00左右大鼠行游泳實(shí)驗(yàn)；下午3：00左右對(duì)照組大鼠腹腔內(nèi)注射生理鹽水2.5 mL/（kg·d）；喘可治低劑量組大鼠腹腔內(nèi)注射喘可治注射液2.5 mL/（kg·d）；喘可治高劑量組腹腔內(nèi)注射喘可治注射液10 mL/(kg·d)；晚上8：00左右雄性大鼠與雌性大鼠按1∶2同籠，第2天上午8：00觀察雌性大鼠陰道涂片。連續(xù)7天。同時(shí)觀察各組雄鼠的精子密度和睪丸組織學(xué)。結(jié)果：致雌鼠受孕數(shù)：對(duì)照組（0.63±0.71），喘可治低劑量組（1.11±0.93），喘可治高劑量組（1.67±0.97），喘可治高劑量組、低劑量組雌鼠懷孕數(shù)均高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；喘可治高劑量組懷孕數(shù)高于低劑量組，但組間比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。精子密度與造模前比較：對(duì)照組明顯減少，喘可治低劑量組略有減少，喘可治高劑量組無明顯改變；睪丸組織學(xué)評(píng)價(jià)：對(duì)照組曲精細(xì)管較空虛，其內(nèi)生精細(xì)胞排列不均，生精細(xì)胞明顯減少，部分缺失，精子細(xì)胞數(shù)顯著減少，有的甚至出現(xiàn)鈣鹽沉積；而喘可治低、高劑量組均可見精子細(xì)胞密集，且呈劑量依賴關(guān)系。結(jié)論：喘可治注射液對(duì)腎陽虛型少精癥大鼠具有較好的治療效果，可以改善睪丸功能，提高受孕率，且呈量效關(guān)系。

喘可治；腎陽虛型；少精癥；睪丸生精功能；懷孕；動(dòng)物實(shí)驗(yàn)；大鼠

男性不育癥是一項(xiàng)世界性的醫(yī)學(xué)和社會(huì)學(xué)問題，亦是21世紀(jì)危害人類生殖健康的重要疾病之一。據(jù)世界衛(wèi)生組織估計(jì)，全球約有6～8千萬對(duì)不育夫婦[1]。目前，藥物治療或體外人工受精、單精子卵泡內(nèi)注射治療，供精人工授精成功率都偏低。通過開發(fā)中醫(yī)藥技術(shù)，提高受孕率是值得探索的科學(xué)課題。喘可治注射液是一種上市多年的中藥制劑，主要用于治療哮喘癥。由于該藥的組成淫羊藿和巴戟天具有溫補(bǔ)腎陽的作用。筆者進(jìn)行了該藥對(duì)腎陽虛型少精癥雄性大鼠的精子數(shù)量及致雌性大鼠受孕率的實(shí)驗(yàn)研究。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 SPF級(jí)雄性SD大鼠24只，體重(324.20±21.30) g；雌性52只，體重(207.14±17.92)g。均購自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物許可證號(hào)：0116331。飼養(yǎng)于廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)室，檢疫合格后于標(biāo)準(zhǔn)條件(22～25℃，14 h照明)下，食物和水自由獲取。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組 將雄性大鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組、喘可治低劑量組、喘可治高劑量組，每組8只大鼠。

1.3 藥物 喘可治注射液由廣州萬正藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，批號(hào)：13121201。

1.4 喘可治注射液劑量 確定采用費(fèi)辛等[2]換算喘可治注射液大鼠劑量：①對(duì)照組，腹腔內(nèi)注射生理鹽水2.5 mL/(kg·d)；②喘可治低劑量組，腹腔內(nèi)注射喘可治注射液2.5 mL/(kg·d)；③喘可治高劑量組，腹腔內(nèi)注射喘可治注射液10 mL/(kg·d)。

1.5 實(shí)驗(yàn)儀器 顯微鏡：Olympus IX71型倒置顯微鏡；BSA 1245電子天平：Sartorius賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司；自制大鼠游泳箱(容積0.6 m×0.6 m×1 m的長(zhǎng)方形塑料箱)；動(dòng)物手術(shù)臺(tái)；水溫計(jì)。

1.6 造模方法 按照謝玲玲和曹繼剛等[3～4]“房事不節(jié)加游泳”所致房事不節(jié)、勞倦過度的腎陽虛模型造模。本實(shí)驗(yàn)造模分2個(gè)階段：第1階段：共14天。每天上午9：00左右將大鼠體重10%的保險(xiǎn)絲纏繞于大鼠尾根部，造成大鼠負(fù)重狀態(tài)，然后將其放入水深約50 cm，容積為0.6 m×0.6 m×1 m的長(zhǎng)方形塑料箱，水溫(15±1)℃的水槽中游泳，以力竭為度(大鼠鼻尖沒入水面10 s，每天1次)，以造腎陽虛模型雄性大鼠。第2階段：共7天。每天上午9：00左右大鼠行游泳實(shí)驗(yàn)；下午3：00左右對(duì)照組大鼠腹腔內(nèi)注射生理鹽水2.5 mL/(kg·d)；喘可治低劑量組大鼠腹腔內(nèi)注射喘可治注射液2.5 mL/(kg·d)；喘可治高劑量組腹腔內(nèi)注射喘可治注射液10 mL/(kg·d)；晚上8：00左右雄性大鼠與雌性大鼠按1∶2同籠，第2天上午8：00觀察雌性大鼠陰道涂片。完成兩階段造模后處死雄性大鼠。雄鼠處死前一天自晚上8：00開始禁食禁飲，次日麻醉成功后，摘取雄鼠的睪丸，固定于固定液中。

病理標(biāo)本在10%中性緩沖福爾馬林室溫下固定24 h，梯度酒精脫水，TO生物透明劑透明，石蠟包埋，切成4 mm厚的組織片(于標(biāo)本最大徑線處取材兩張)，待用于HE染色。

1.7 HE染色 將睪丸組織切片分別于TO生物透明劑脫蠟5 min，無水乙醇洗脫TO生物透明劑1 min，共2次，梯度酒精水化，自來水洗2 min，蒸餾水浸洗1 min，蘇木素染色3 min，自來水洗1 min，1%鹽酸酒精分化10 s，自來水洗1 min，1%稀氨水返藍(lán)30 s，脫水、透明、封片。用Olympus IX71型倒置顯微鏡拍照，進(jìn)行睪丸組織學(xué)評(píng)價(jià)。

2 觀察指標(biāo)

2.1 陰道涂片 ①確定妊娠：將雌鼠與雄鼠按2∶1的比例于每晚8：00同籠，第2天上午8：00左右行陰道涂片檢查，以涂片中發(fā)現(xiàn)精子確立為妊娠標(biāo)準(zhǔn)。②雌鼠懷孕情況比較分別與3組雄性大鼠同籠后雌鼠懷孕情況。以雌鼠陰道涂片發(fā)現(xiàn)精子確定妊娠，計(jì)算各不同處理組別7天懷孕情況。

2.2 雄鼠睪丸組織學(xué)評(píng)估 參照蘇寧《新藥毒理實(shí)驗(yàn)動(dòng)物組織病理學(xué)圖譜》[5]。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用EXCEL軟件建立數(shù)據(jù)庫，對(duì)收集的資料及結(jié)果直接錄入，采用SPSS15.0軟件包運(yùn)用相關(guān)統(tǒng)計(jì)學(xué)方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料均以()表示。

4 結(jié)果

4.1 造模后雄鼠一般情況 實(shí)驗(yàn)前各組雄鼠反應(yīng)靈敏，動(dòng)作靈活，活動(dòng)自如，狀態(tài)良好，毛色新鮮富有光澤；造模第2天開始，部分腹瀉，便溏；一周后雄鼠明顯成群縮，扎堆，活動(dòng)數(shù)量減少，部分老鼠毛發(fā)枯黃，脫落。2周后老鼠體重明顯下降、被毛脫落、瞇眼懶動(dòng)，對(duì)外界刺激敏感，與謝玲玲和曹繼剛等所造腎陽虛模型所出現(xiàn)的一般情況相似，可判定腎陽虛雄鼠模型造模成功。

4.2 3組雌鼠懷孕情況 見表1。喘可治高劑量組、低劑量組雌鼠懷孕數(shù)高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；喘可治高劑量組懷孕數(shù)高于低劑量組，但組間比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

表1 3組雌鼠懷孕情況比較()

表1 3組雌鼠懷孕情況比較()

與對(duì)照組比較，①P＜0.05

組別對(duì)照組喘可治低劑量組喘可治高劑量組n 1 6 1 6 1 6平均懷孕數(shù)0 . 6 3 ± 0 . 7 1 1 . 1 1 ± 0 . 9 3①1 . 6 7 ± 0 . 9 7①

4.3 顯微鏡下精子密度比較 雌雄鼠同籠后的第2天，觀察雌鼠陰道涂片精子數(shù)量情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：對(duì)照組精子密度明顯減少，喘可治低劑量組精子密度較前亦有減少，高劑量組則較前無明顯改變。見圖1～3。

圖1 高劑量組×40倍

圖2 低劑量組×40倍

圖3 對(duì)照組×40倍

4.4 睪丸組織學(xué)評(píng)價(jià) 喘可治高劑量組和低劑量組的睪丸組織中可見曲精細(xì)管內(nèi)不同發(fā)育階段的生精細(xì)胞分層排列，各級(jí)生精細(xì)胞分化程度不等，高劑量組中可見精子細(xì)胞密集，低劑量組精子細(xì)胞較高劑量組減少。對(duì)照組睪丸組織可見曲精細(xì)管較空虛，其內(nèi)生精細(xì)胞排列不均，生精細(xì)胞減少，部分缺失，精子細(xì)胞數(shù)明顯少于高劑量組及低劑量組，有的甚至出現(xiàn)鈣鹽沉積，見圖4。

圖4 3組睪丸組織評(píng)價(jià)（HE=100）

5 討論

男子不育癥是男科常見疾病，按照世界衛(wèi)生組織最新的標(biāo)準(zhǔn)：夫妻雙方在未采取任何避孕方式的前提下，同居一年以上，由于男性因素造成女性無法受孕的稱為男性不育。影響男子不育的因素很多，但是精子的質(zhì)量和數(shù)量是最重要的因素之一。睪丸是男子的生殖腺，睪丸曲細(xì)精管是精子產(chǎn)生的基地，因此，睪丸性病因是引起男子不育癥的最常見因素。本實(shí)驗(yàn)選擇精子密度、睪丸生精細(xì)胞的數(shù)量及形態(tài)、致雌鼠受孕率作為指標(biāo)，評(píng)價(jià)喘可治對(duì)男子不育癥的作用。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，腎與生育關(guān)系至關(guān)重要，腎氣的盛衰，天睽的有無，臟腑功能的協(xié)調(diào)與否，直接決定著男子的生殖能力?！蹲C治準(zhǔn)繩》指出：“醫(yī)之上工，因人無子，語男則主于精，男從補(bǔ)腎為要……”喘可治注射液的組成為淫羊藿和巴戟天，這二味藥均具有補(bǔ)腎壯陽的功效?！渡褶r(nóng)本草經(jīng)》曰：“淫羊藿，味甘，氣辛，性溫……主陽虛、陽痿……艱于子嗣者，皆宜服之?！爆F(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)，淫羊藿主要化學(xué)成分為淫羊藿苷、淫羊藿多糖等具提高生殖功能之功效[6]。淫羊藿苷通過miRNA-21抗細(xì)胞凋亡從而促進(jìn)胚胎發(fā)育[7]；用于治療性功能障礙[8]?！吨腥A人民共和國(guó)藥典》載：巴戟天味甘、辛、微溫，具有補(bǔ)腎陽、強(qiáng)筋骨之作用，可用于治療陽痿遺精、宮冷不孕等癥。巴戟天醇提取物能增加衰老雄性大鼠附睪精子總數(shù)，活精子率，降低畸形精子率[9]。水提取物對(duì)活性氧所致的人精子過氧損傷有明顯干預(yù)作用，對(duì)精子運(yùn)動(dòng)功能具有保護(hù)作用[10]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，喘可治注射液可提高腎陽虛證雄性大鼠精子密度；睪丸病理學(xué)提示喘可治組雄性大鼠睪丸的生精細(xì)胞數(shù)量及形態(tài)均優(yōu)于對(duì)照組；雌鼠懷孕率得到顯著提升，且呈劑量依賴關(guān)系。因此認(rèn)為，喘可治對(duì)腎陽虛少精癥引起的男子不育癥可能具有一定的治療作用。

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[2]費(fèi)辛，蔡宇波，曹蘭芳.喘可治注射液對(duì)大鼠抗炎和免疫調(diào)節(jié)機(jī)制的研究[J].藥學(xué)服務(wù)與研究，2011，11(5)：333-336.

[3]謝玲玲，王蕭，張永斌.“房室不節(jié)”所致腎虛證動(dòng)物模型造模方法探討[J].山西中醫(yī)，2010，26(2)：46-48.

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（責(zé)任編輯：劉淑婷）

Experimental Study of Chuankezhi on Oligospermia in Sprague-Dawley Rats with Kidney-Yang Deficiency

FU Zhuotao，MENG Cong，WANG Zhigang，QIU Yongchao

Objective：To investigate the effect of Chuankezhi Injection on the number of sperm in oligospermic male SD rats with Kidney-Yang deficiency and on fertility of these oligospermic rats.Methods：Twenty-four SD rats with Kidney-Yang deficiency were randomly divided into blank control group，Chuankezhi low-dose group[2.5mL/(kg·d)]，Chuankezhi high-dose group[10 mL/(kg·d)].SD rats were in the swimming test at about 9：00 am every morning.2.5 mL/(kg·d)normal saline was intraperitoneally injected in the rats of the blank control group at about 3：00 pm，and 2.5 mL/(kg·d)Chuankezhi was intraperitoneally injected in the Chuankezhi low-dose group，10 mL/(kg·d)in the Chuankezhi high-dose group.Then the male rats caged with female rats(1：2 per cage)at about 8：00 pm.Vaginal smears in female rats were monitored at 8：00 am the next day.Treatment lasted for 7 days.Sperm density as well as testis histology in male rats were investigated.Results：The numbers of pregnant female rats caused by each group of male rats were 0.63±0.71 in the blank control group，and 1.11± 0.93 in Chuankezhi low-dose group and 1.67±0.97 in Chuankezhi high-dose group.The numbers of pregnant female rats in low-dose group and high-dose group were higher than those in the blank control group，the difference being significant(P＜0.05).The numbers of pregnant female rats in high-dose group were higher than those in low-dose group，but there being no significant difference(P＞0.05).Sperm density of male rat was obviously low in the blank control group，slightly decreased in low-dose group，and no significant different in high-dose group.Testis of male rat in the blank control group exhibited as relatively empty seminiferous tubules，in which were sparse and unevenly arranged spermatogenic cells，partially missing，with very small number of sperms.Calcium depositions were observed on some of the sperms.But dense sperm cells were observed in the testis of rat of high or low dose of Chuankezhi group， with cell density dose-dependently increased. Conclusion：Chuankezhi Injection shows therapeutic effect on oligospermia in rats with Kidney-Yang deficiency.It can dose-dependently improve the testicular function in oligospermic male SD rats with Kidney-Yang deficiency，thus increase the chance of conceiving in female rats.

Chuankezhi；Kidney-Yang deficiency；Oligospermia；Testicular spermatogenic function；Pregnancy；Animal experiment；Rats

R285.5

A

0256-7415（2016）02-0243-04

10.13457/j.cnki.jncm.2016.02.094

2015-10-20

符卓韜（1986-），男，醫(yī)學(xué)碩士，住院醫(yī)師，主要從事泌尿外科、男科臨床工作。