張帆，武創(chuàng)新，齊帥英，曾靈，易華婭

1.貴陽中醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院，貴州 貴陽 550003 2.貴陽中醫(yī)學(xué)院，貴州 貴陽 550002

更年湯對腎陽虛型圍絕經(jīng)期模型大鼠IL-6及骨密度影響的實(shí)驗(yàn)研究

張帆1，武創(chuàng)新2，齊帥英2，曾靈1，易華婭2

1.貴陽中醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院，貴州 貴陽 550003 2.貴陽中醫(yī)學(xué)院，貴州 貴陽 550002

目的：觀察更年湯對腎陽虛型圍絕經(jīng)期模型大鼠白細(xì)胞介素（IL）-6及骨密度的影響，探討其機(jī)制。方法：80只11～12月齡自然圍絕經(jīng)期SD大鼠為研究對象，隨機(jī)分為更年湯組、教材方組、利維愛組、模型組，每組20只；4月齡、18月齡雌性大鼠分別作為對照組，每組各20只。結(jié)果：與青年組比較，模型組、老年組、更年湯組、教材方組、利維愛組的血清IL-6含量較高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與模型組比較，更年湯組、教材方組、利維愛組的血清IL-6含量較低（P＜0.05），老年組的血清IL-6含量較高（P＜0.05）。各組大鼠骨密度比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），模型組較青年組骨密度有下降（P＜0.05），模型組與更年湯組、教材方組、利維愛組比較，差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。利維愛組與教材湯組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），與更年湯組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。更年湯組與教材湯比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論：更年湯能降低腎陽虛型模型大鼠血清IL-6含量，提高骨密度水平。

圍絕經(jīng)期；腎陽虛；更年湯；白細(xì)胞介素（IL）-6；骨密度；大鼠

圍絕經(jīng)期是婦女絕經(jīng)前后，由于腎氣、天癸、沖任二脈、精血、臟腑等逐漸虛衰、將竭、虛損、不足、失于濡養(yǎng)，使機(jī)體陰陽平衡失調(diào)而出現(xiàn)的生理時(shí)期。如若婦女體質(zhì)較弱，以及受多種因素的影響，可使臟腑功能失于調(diào)節(jié)，涉及心、肝、脾等多臟腑而發(fā)生病理改變。其病位在腎，治療主要以滋陰補(bǔ)腎為主。這段時(shí)期發(fā)生的相關(guān)臨床癥狀被稱為絕經(jīng)綜合征又名絕經(jīng)前后諸證，它是圍絕經(jīng)期婦女的常見和好發(fā)疾病。更年湯是治療該病的復(fù)方合劑，臨床療效顯著，前期初步研究證實(shí)對人體骨密度的變化有影響[1]，故進(jìn)一步探討其對血清白細(xì)胞介素-6(IL-6)和骨密度的影響。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物分組及處理 選用雌性SD大鼠：11～12月齡80只，體重280～300 g；4月齡20只，體重180～200 g，作為青年組；18月齡20只，體重420～450 g，作為老年組。以上動(dòng)物均由重慶市中藥研究院動(dòng)物室提供[許可證號(hào)：scxk(渝) 2012-0003]，微生物控制等級(jí)為I級(jí)。選用11～12月齡大鼠建立圍絕經(jīng)期大鼠模型。采用自然老化型圍絕經(jīng)期模型。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，選取11～12月齡大鼠逐只進(jìn)行陰道脫落細(xì)胞涂片、蘇木精-伊紅染色(HE染色)。每天于09：30由專人取片1次，連續(xù)觀察3個(gè)動(dòng)情期(15天)，觀察到底層細(xì)胞均在50%以上，涂片呈現(xiàn)為動(dòng)情周期紊亂、動(dòng)情間期延長為圍絕經(jīng)期模型成功[2]。圍絕經(jīng)期模型成功后，每天常規(guī)消毒后左右交替于模型大鼠臀部肌肉豐厚的部位注射氫化可的松0.5 mL/100 g(相當(dāng)于氫化可的松25 mg/kg)，連續(xù)肌注9天。見動(dòng)物出現(xiàn)持續(xù)性萎靡不振，反應(yīng)遲鈍、扎堆，拱背少動(dòng)，毛不光潔，豎毛時(shí)則認(rèn)為腎陽虛型模型造模成功。根據(jù)臟腑辨證的標(biāo)準(zhǔn)，肌注氫化可的松所造成實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的反應(yīng)與中醫(yī)腎陽虛證的臨床表現(xiàn)相符合。提示成功造模腎陽虛圍絕經(jīng)期大鼠[3]。并每天同時(shí)予青年組和老年組肌注等量生理鹽水；造模成功的大鼠分為更年湯組、教材方組、利維愛組及模型組4組，每組20只。給藥15天，更年湯組給予更年湯溶液4 mL(含生藥量1.8 g/mL，約每天18 g/kg生藥量)灌胃。教材方組給予教材方溶液4 mL(含生藥量1.6 g/mL，約每天16 g/kg生藥量)灌胃。利維愛組給予利維愛溶液4 mL(含藥量0.0294 mg/mL，約每天0.294 mg/kg藥量)灌胃。生理鹽水組、青年組、老年組：用生理鹽水4 mL灌胃。

1.2 試劑與藥品 注射用氫化可的松：規(guī)格：50 mg/支，湖北人民制藥有限公司，批準(zhǔn)文號(hào)：國藥準(zhǔn)字號(hào)：H20058653。更年湯(來源于筆者臨床經(jīng)驗(yàn)方)：熟地黃、山藥、山茱萸、仙茅、淫羊藿、巴戟天、女貞子、旱蓮草、桑寄生、當(dāng)歸、桂枝、獨(dú)活、防風(fēng)、細(xì)辛、炙甘草。教材方(來源于全國高等中醫(yī)藥院校教材：歐陽惠卿主編《中醫(yī)婦科學(xué)》)：熟地黃、仙茅、淫羊藿、山藥、杜仲、山茱萸、菟絲子、知母、黃柏、當(dāng)歸、炙甘草、肉桂。生藥均由北京同仁堂大藥房提供。于貴陽中醫(yī)學(xué)院中心實(shí)驗(yàn)室煎制，藥液在4℃冰箱保存?zhèn)溆谩＠S愛：規(guī)格：2.5 mg/片，南京歐加農(nóng)制藥有限公司生產(chǎn)，批準(zhǔn)文號(hào)：國藥準(zhǔn)字號(hào)：H20051085。0.9%氯化鈉注射液(生理鹽水)：規(guī)格：250 mL/2.25 g，貴州省科倫藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，批準(zhǔn)文號(hào)：國藥準(zhǔn)字號(hào)：H20033939。

1.3 儀器與設(shè)備 生物顯微圖像分析儀(5.30-06064)，攝影生物顯微鏡(XSZ-HS3)，電熱鼓風(fēng)干燥箱(GZX-9030)，4℃冰箱(Sc-Z19A)(青島海爾集團(tuán))，AnkeTGL-16G高速離心機(jī)(北京時(shí)代北利公司)，L600臺(tái)式低速自動(dòng)離心機(jī)(湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司)；由貴陽中醫(yī)學(xué)院中心實(shí)驗(yàn)室提供。美國Hologic QDR2000plus型雙能X線骨密度儀，貴陽醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院提供。

1.4 陰道脫落細(xì)胞圖片檢查 于末次給藥24 h后，先用20%烏拉坦按0.5 mL/100 g給藥麻醉，確認(rèn)麻醉生效后，取陰道脫落細(xì)胞。一人左手背位固定大鼠，另一人右手持提前消毒好的無菌棉簽，將棉簽沾適量生理鹽水(0.9%氯化鈉注射液)，輕輕插入大鼠陰道內(nèi)，在陰道側(cè)壁上1/3處輕輕旋轉(zhuǎn)2～3圈后取出，將棉簽上的標(biāo)本均勻地涂在標(biāo)記好的載玻玻片上，放入玻片架備用。逐只進(jìn)行陰道涂片檢查。自然風(fēng)干后，將標(biāo)本放入95%乙醇固定液內(nèi)固定15 min。將固定好的標(biāo)本送入貴陽中醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院病理科檢查。

1.5 IL-6檢測 大鼠采用股動(dòng)脈放血收集血清，血清IL-6采用酶聯(lián)免疫測定法測定，由貴陽中醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科根據(jù)試劑盒的說明書嚴(yán)格進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作并完成。

1.6 骨密度 大鼠輕度麻醉后，固定于鼠板上，采用雙能X線骨密度儀檢測全身及腰椎骨密度。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以()表示，各組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠血清IL-6比較 見表1。與青年組比較，模型組、老年組、更年湯組、教材方組、利維愛組的血清IL-6含量較高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；與模型組比較，更年湯組、教材方組、利維愛組的血清IL-6含量較低(P＜0.05)，老年組的血清IL-6含量較高(P＜0.05)。

表1 各組大鼠血清IL-6比較() pg/mL

表1 各組大鼠血清IL-6比較() pg/mL

與青年組比較，①P＜0.05；與模型組比較，②P＜0.05

組別更年湯組教材方組利維愛組模型組老年組青年組n 1 6 1 5 1 4 1 3 1 3 1 3 I L -6 7 9 . 6 2 ± 1 4 . 0 6 6①②7 9 . 7 3 ± 1 4 . 2 8 0①②7 9 . 5 7 ± 1 9 . 0 0 1①②9 8 . 7 7 ± 1 8 . 9 1 3①1 1 1 . 8 5 ± 1 3 . 6 8 6①②4 1 . 9 2 ± 1 3 . 2 3 2②

2.2 各組大鼠骨密度比較 見表2。各組大鼠骨密度比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，模型組較青年組骨密度有下降(P＜0.05)，模型組與更年湯組、教材方組、利維愛組比較，差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。利維愛組與教材湯組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，與更年湯組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。更年湯組與教材湯比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

表2 各組大鼠骨密度比較() g/cm2

表2 各組大鼠骨密度比較() g/cm2

與模型組比較，①P＜0.05；與利維愛組比較，②P＜0.05；與更年湯組比較，③P＜0.05

組別更年湯組教材方組利維愛組n 1 6 1 5 1 4全身0 . 1 9 8 ± 0 . 0 1 2①0 . 1 7 1 ± 0 . 0 1 3①②③0 . 1 9 9 ± 0 . 0 1 4①腰部0 . 1 9 8 ± 0 . 0 1 6①0 . 1 8 0 ± 0 . 0 2 6①②③0 . 2 0 7 ± 0 . 0 2 4①模型組老年組青年組1 3 1 3 1 3 0 . 1 4 3 ± 0 . 0 1 1 0 . 1 4 2 ± 0 . 0 1 3 0 . 1 9 3 ± 0 . 0 8 2①0 . 1 3 9 ± 0 . 0 1 0 0 . 1 4 2 ± 0 . 0 1 2 0 . 1 9 4 ± 0 . 0 1 3①

3 討論

婦女從圍絕經(jīng)期開始，骨質(zhì)吸收速度大于骨質(zhì)的生成速度，促使骨質(zhì)丟失而成骨質(zhì)疏松。絕經(jīng)早期的骨量丟失和關(guān)節(jié)的退行性變化均可導(dǎo)致婦女四肢關(guān)節(jié)不適，甚至疼痛，或腰背酸痛。更年湯組方以“補(bǔ)腎溫陽、祛風(fēng)散寒”為特點(diǎn)[4]，由二仙湯、二至丸和獨(dú)活寄生湯化裁而成，在治療絕經(jīng)前后諸癥中繼承傳統(tǒng)補(bǔ)腎之法，結(jié)合通絡(luò)祛邪的長處，秉持因地制宜的理念。全方用藥滋補(bǔ)腎陽，溫通經(jīng)脈，祛風(fēng)勝濕散寒，緩解圍絕經(jīng)期癥狀，有效預(yù)防圍絕經(jīng)期患者骨質(zhì)疏松的發(fā)生。

IL-6是骨吸收促進(jìn)因子，為由活化的T細(xì)胞和成纖維細(xì)胞產(chǎn)生的促進(jìn)原始骨髓源細(xì)胞生長和分化的淋巴因子，破骨、成骨、骨基質(zhì)、單核巨噬等細(xì)胞不僅可分泌IL-6，其表面均有IL-6受體的表達(dá)，通過其受體作用于成骨細(xì)胞骨髓基質(zhì)細(xì)胞，從而形成單位。它的主要作用是在骨質(zhì)疏松中對破骨細(xì)胞及其前體產(chǎn)生數(shù)量及其功能的影響。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果示，更年湯可以降低腎陽虛型圍絕經(jīng)期大鼠的IL-6，優(yōu)于教材方組。

正常骨量的核心是保持破骨過程與成骨過程的相對平衡，如果破骨功能旺盛，成骨功能減退，這種平衡被打破，則誘發(fā)骨質(zhì)疏松。目前骨質(zhì)測量的“金標(biāo)準(zhǔn)”是測定骨密度，它被認(rèn)為是研究骨質(zhì)疏松和評(píng)價(jià)藥效的有效手段[5]，骨密度改變是評(píng)價(jià)骨強(qiáng)度變化的指標(biāo)[6]，尤冬春等[7]研究表明，補(bǔ)腎經(jīng)典方虎潛丸和雌激素對去卵巢大鼠骨量的丟失，有一定的預(yù)防效果。對骨組織的影響方面，虎潛丸與雌激素組作用幾乎一樣，都能夠提高去勢大鼠的骨密度。獨(dú)活寄生湯可緩解骨壞死，同時(shí)參與軟骨下骨骨代謝[8]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果示，更年湯可以提高腎陽虛型圍絕經(jīng)期大鼠的骨密度，優(yōu)于教材方組，與利維愛組相當(dāng)。

[1]張帆，馬衛(wèi)東.自擬更年湯治療腎陽虛型絕經(jīng)前后諸證35例[J].遼寧中醫(yī)雜志，2008，35(9)：1360.

[2]張帆，候聰.更年湯對圍絕經(jīng)期模型大鼠E2，LH，F(xiàn)SH，GnRH的干預(yù)作用研究[J].遼寧中醫(yī)雜志，2012，39(9)：1850-1854.

[3]曾靈，張帆.自擬更年湯對圍絕經(jīng)期模型大鼠雌激素受體及細(xì)胞凋亡相關(guān)因子的影響和作用機(jī)理研究[D].貴陽：貴陽中醫(yī)學(xué)院，2013：5-7.

[4]侯聰，張帆.張帆治療腎陽虛型圍絕經(jīng)期綜合征經(jīng)驗(yàn)[J].遼寧中醫(yī)雜志，2011，38(8)：1504-1505.

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（責(zé)任編輯：駱歡歡）

R711.75

A

0256-7415（2016）02-0239-03

10.13457/j.cnki.jncm.2016.02.092

2015-06-23

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（81160491）

張帆（1960-），女，主任醫(yī)師，研究方向：中醫(yī)藥對圍絕經(jīng)期綜合征的防治。