黃荷，曾意榮，簡(jiǎn)林養(yǎng)

1.廣州市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，廣東 廣州 510800；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣東 廣州 510405

◆實(shí)驗(yàn)研究論著◆

淫羊藿甙誘導(dǎo)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向軟骨細(xì)胞分化實(shí)驗(yàn)研究

黃荷1，曾意榮2，簡(jiǎn)林養(yǎng)1

1.廣州市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，廣東 廣州 510800；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣東 廣州 510405

目的：觀察淫羊藿甙對(duì)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（hMSCs）向軟骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化的作用。方法：骨髓樣本取自廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院關(guān)節(jié)一科因骨關(guān)節(jié)炎行全髖關(guān)節(jié)置換手術(shù)的病人，用含有1mL肝素（100 U/mL）的注射器抽取骨髓5 mL，并立即送入實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行體外培養(yǎng)。收集體外增殖培養(yǎng)第3代的細(xì)胞，分5組：未誘導(dǎo)組、對(duì)照組、淫羊藿甙低劑量組、淫羊藿甙中劑量組、淫羊藿甙高劑量組。置于細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)，隔天換液1次，培養(yǎng)21天。甲苯胺藍(lán)染色及SABC免疫組化法檢測(cè)軟骨細(xì)胞，并定量測(cè)定膠原α1mRNA表達(dá)水平。結(jié)果：甲苯胺藍(lán)染色鑒定：淫羊藿甙高劑量組和對(duì)照組染色均可見(jiàn)胞漿成紫紅色質(zhì)，表明糖氨聚糖含量豐富，hMSCs向軟骨細(xì)胞分化；淫羊藿甙低、中劑量組及未誘導(dǎo)組染色未見(jiàn)特征性紫紅色異染，表明hMSCs未見(jiàn)明顯軟骨分化。Ⅱ型膠原SABC免疫組化法鑒定：淫羊藿甙高劑量組和對(duì)照組免疫組化染色后可見(jiàn)棕黃色膠原顆粒，淫羊藿甙高劑量組最為密集，表明Ⅱ型膠原含量多，hMSCs向軟骨細(xì)胞分化顯著；淫羊藿甙低、中劑量組見(jiàn)少量棕黃色膠原；未誘導(dǎo)組未見(jiàn)膠原染色。從熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果分析，淫羊藿甙高劑量組、對(duì)照組Ⅱ型膠原相對(duì)表達(dá)量較高，2組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。淫羊藿甙低、中劑量組Ⅱ型膠原相對(duì)表達(dá)量較低，2組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。未誘導(dǎo)組無(wú)膠原表達(dá)。結(jié)論：淫羊藿甙可在體外誘導(dǎo)hMSCs分化為軟骨細(xì)胞。

淫羊藿甙；骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；軟骨細(xì)胞；分化；誘導(dǎo)

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)是一群具有多向分化潛能的均質(zhì)性細(xì)胞，作為種子細(xì)胞能夠根據(jù)微環(huán)境信號(hào)的指令分別分化為成骨細(xì)胞和軟骨細(xì)胞，適合于伴隨軟骨下骨損傷的軟骨缺損修復(fù)。從骨代謝進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，BMSCs的生物學(xué)特性與中醫(yī)理論“腎主骨生髓”存在相關(guān)性。骨、軟骨的生長(zhǎng)、修復(fù)均依賴于腎中精氣所提供的濡養(yǎng)和推動(dòng)。以往多以動(dòng)物來(lái)源的BMSCs作為研究對(duì)象，本實(shí)驗(yàn)擬研究補(bǔ)腎中藥淫羊藿的有效活性單體成分淫羊藿甙對(duì)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(hMSCs)向軟骨細(xì)胞的誘導(dǎo)分化的作用，結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 骨髓樣本取自廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院關(guān)節(jié)一科因骨關(guān)節(jié)炎行全髖關(guān)節(jié)置換手術(shù)的患者，經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)IRB允許并征得患者知情同意，從病人股骨近端髓腔中抽取獲得。用含有1 mL肝素(100 U/mL)的注射器抽取骨髓5 mL，并立即送入實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行體外培養(yǎng)。

1.2 主要試劑 MEM培養(yǎng)基(美國(guó)Gibco公司)；胎牛血清(美國(guó)Hyclone公司)；胰酶(北京索萊寶生物公司)；轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(TGF-β，美國(guó)Peprotech公司)；維生素C(上海江萊生物科技有限公司)；地塞米松(上海晶天生物科技有限公司)；胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-硒酸鈉(美國(guó)Sigma公司)；小鼠抗人膠原蛋白Ⅱ單抗(Santa公司)；PE標(biāo)記二抗小鼠 IgG(美國(guó)BioLegend)；RNA提取試劑盒(北京TIANGEN公司)；DNA聚合酶(北京TIANGEN公司)；NTP mix(北京TIANGEN公司)；引物合成(大連TaKaRa公司)；探針合成(大連TaKaRa公司)；磷酸緩沖鹽溶液1×PBS(pH=7.4)(北京索萊寶生物)；雙抗(美國(guó)Gibco公司)。

1.3 主要儀器 75 cm2培養(yǎng)瓶，25 cm2培養(yǎng)瓶；50 mL離心管，15 mL離心管(美國(guó)Corning公司)；24孔培養(yǎng)板(丹麥Nunc公司)；25 mL移液管，10 mL移液管，5 mL移液管，2 mL移液管(美國(guó)Corning公司)；6孔板(Coning)；酶標(biāo)儀，CO2培養(yǎng)箱(Heraeus)；針頭濾器，0.22 μm濾膜(MILLIpore)；SIGMA-3K15離心機(jī)(sigma)。免疫熒光纖維鏡(日本奧林巴斯公司)；Real-time PCR(美國(guó)ABI公司)，倒置顯微鏡(日本奧林巴斯公司)。

1.4 細(xì)胞分組及處理 收集體外增殖培養(yǎng)第3代的細(xì)胞，分5組：未誘導(dǎo)組，hMSCs不加誘導(dǎo)劑繼續(xù)培養(yǎng)；對(duì)照組，加入誘導(dǎo)液(TGF-β10 μg/L、Dex0.1 μmol/L、VitC50 mg/L)；淫羊藿甙低劑量組，在含10%FBS H-DMEM培養(yǎng)基中加入淫羊藿甙(終濃度為20 μg/L)；淫羊藿甙中劑量組，在含10% FBS H-DMEM培養(yǎng)基中加入淫羊藿甙(終濃度為40 μg/L)；淫羊藿甙高劑量組，在含10%FBS H-DMEM培養(yǎng)基中加入淫羊藿甙(終濃度為60 μg/L)。置于細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)，隔天換液1次，培養(yǎng)21天。

1.5 軟骨細(xì)胞鑒定 ①甲苯胺藍(lán)染色：甲苯胺藍(lán)染色顯示軟骨細(xì)胞周?chē)惾拘浴Ｌ前本厶怯眉妆桨匪{(lán)等堿性染料染色后呈紫紅色，而不是藍(lán)色，這種染色現(xiàn)象稱為異染性(metachromasia)基質(zhì)。②SABC免疫組化法：胞漿Ⅱ型膠原免疫著色為棕黃色。以4%多聚甲醛固定20 min，并滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，5%BSA室溫封閉20 min。滴加1∶100的兔抗膠原Ⅱ一抗，4℃過(guò)夜，陰性對(duì)照以PBS代替一抗。PBS洗滌2 min×3次。滴加生物素化山羊抗兔IgG，37℃恒溫箱20 min，PBS洗滌5 min×4次。二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色8 min，蒸餾水洗滌，蘇木素輕度復(fù)染10 s，充分水洗。梯度酒精脫水，二甲苯透明，封片。③膠原α1 mRNA表達(dá)水平定量測(cè)定。用Trizol試劑裂解沉淀細(xì)胞后，提取總mRNA，按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作步驟進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，得到cDNA。在PE7700熒光定量PCR儀上定量檢測(cè)膠原α1mRNA表達(dá)水平。反應(yīng)體系為：ddH2O 10.105mL，cDNA 1 mL，2×SYBR Green QPCR master mix 12.5 mL，ROX passive reference 0.375 mL，F(xiàn)orward primer(10 mmol/L)0.5 mL， Reverse primer (10mmol/L)0.5 mL，probe(10 mmol/L)0.2 mL，總體積25 mL。Ⅱ型膠原α1反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性10 min，95℃2 min，60℃30 s，72℃1.5 min，共40個(gè)循環(huán)；循環(huán)結(jié)束后繼續(xù)進(jìn)行建立熔解曲線的反應(yīng)，最后用專用軟件自動(dòng)分析結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 各組軟骨細(xì)胞鑒定結(jié)果比較 見(jiàn)圖1、圖2。甲苯胺藍(lán)染色鑒定：淫羊甙藿高劑量組和對(duì)照組染色均可見(jiàn)胞漿成紫紅色質(zhì)，表明糖氨聚糖含量豐富，hMSCs軟骨細(xì)胞分化；淫羊藿甙低、中劑量組及未誘導(dǎo)組染色未見(jiàn)特征性紫紅色異染，表明hMSCs未見(jiàn)明顯軟骨分化。Ⅱ型膠原SABC免疫組化法鑒定：淫羊藿甙高劑量組和對(duì)照組免疫組化染色后可見(jiàn)棕黃色膠原顆粒，淫羊藿甙高劑量組最為密集，表明Ⅱ型膠原含量多，hMSCs軟骨細(xì)胞分化顯著；淫羊藿甙低、中劑量組見(jiàn)少量棕黃色膠原；未誘導(dǎo)組未見(jiàn)膠原染色。

圖1 高劑量淫羊藿甙組甲苯胺藍(lán)染色結(jié)果（×40）

圖2 高劑量淫羊藿甙組Ⅱ型膠原SABC免疫組化法鑒定（×40）

2.2 各組膠原mRNA定量結(jié)果比較 見(jiàn)表1。從熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果分析，淫羊藿甙高劑量組、對(duì)照組Ⅱ型膠原相對(duì)表達(dá)量較高，2組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。淫羊藿甙低、中劑量組Ⅱ型膠原相對(duì)表達(dá)量較低，2組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。未誘導(dǎo)組無(wú)膠原表達(dá)。

表1 各組膠原蛋白mRNA定量結(jié)果比較()

表1 各組膠原蛋白mRNA定量結(jié)果比較()

淫羊藿甙低劑量組淫羊藿甙中劑量組淫羊藿甙高劑量組原Ⅱ檢出1 . 2 2 7 . 5 7 ± 2 . 3 4 7 . 0 5 ± 3 . 3 8 2 . 6 3 ± 1 . 2 9 1 8 S 2 . 5 4 ± 2 . 0 6 6 . 0 1 ± 2 . 1 3 6 . 6 2 ± 2 . 6 4 5 . 5 8 ± 3 . 5 5 6 . 0 1 ± 2 . 3 4 Δ Δ C t -3 . 1 8 ± 1 . 1 1 0 . 9 5 ± 0 . 8 8 1 . 4 7 ± 0 . 2 3 -3 . 3 8 ± 1 . 2 4 2 -ΔΔCt9 . 0 6 ± 5 . 4 6 0 . 5 1 ± 0 . 3 3 0 . 3 6 ± 0 . 5 4 1 0 . 4 1 ± 4 . 7 8基因C t值

3 討論

骨關(guān)節(jié)炎的病理學(xué)特點(diǎn)是以嚴(yán)重的局限性軟骨破壞，深達(dá)骨質(zhì)為特點(diǎn)。如何修復(fù)受損的關(guān)節(jié)軟骨并保持其功能，是骨關(guān)節(jié)炎的治療目標(biāo)。而臨床上軟骨缺損的治療一直是個(gè)難題，主要是因?yàn)檐浌亲陨硇迯?fù)能力弱，甚至不存在。而應(yīng)用軟骨細(xì)胞移植修復(fù)也不能成功，原因主要是由于軟骨細(xì)胞幾乎沒(méi)有遷移能力，不能迅速聚集到創(chuàng)傷部位。而B(niǎo)MSCs具有強(qiáng)大的增殖能力、多向分化能力及低免疫原性，貼壁生長(zhǎng)特性等等，而這些特性正可以使BMSCs成為種子細(xì)胞來(lái)修復(fù)軟骨缺損。因此，對(duì)軟骨缺損的修復(fù)轉(zhuǎn)向干細(xì)胞誘導(dǎo)分化成軟骨細(xì)胞研究。

軟骨細(xì)胞占關(guān)節(jié)軟骨總?cè)萘康?%左右，它的功能是合成分泌并維持外基質(zhì)。關(guān)節(jié)軟骨的正常生理功能依賴于軟骨細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)的代謝平衡。細(xì)胞外基質(zhì)主要由組織液、膠原、蛋白聚糖、非膠原蛋白等組成[1]。其中膠原纖維是軟骨的基本框架，膠原纖維占成人關(guān)節(jié)軟骨干重的2/3，而Ⅱ型膠原占膠原總數(shù)的80%～90%，由3條α1鏈以螺旋方式組成[2]。Ⅱ型膠原是關(guān)節(jié)軟骨的重要組成成分，對(duì)維持關(guān)節(jié)軟骨的彈性及硬度具有重要作用。在骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)病過(guò)程中最主要的特點(diǎn)是關(guān)節(jié)軟骨的進(jìn)行性丟失[3]，Ⅱ型膠原和蛋白聚糖的破壞最為顯著，影響了關(guān)節(jié)軟骨的正常生理功能。有研究表明，以豬Ⅱ型膠原移植修復(fù)新西蘭大白兔的關(guān)節(jié)軟骨缺損，收到良好效果[4]。而最理想的軟骨修復(fù)是建立軟骨細(xì)胞與Ⅱ型膠原的合成分解代謝平衡體系，這樣才能獲得持久的效果。本研究通過(guò)中藥單體淫羊藿甙誘導(dǎo)BMSCs向軟骨細(xì)胞分化，甲苯胺藍(lán)染色陽(yáng)性，Ⅱ型膠原免疫組化染色陽(yáng)性均提示誘導(dǎo)細(xì)胞表達(dá)特異性細(xì)胞基質(zhì)，這兩者是軟骨細(xì)胞的特征性標(biāo)志，說(shuō)明誘導(dǎo)細(xì)胞具有軟骨細(xì)胞的特點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，淫羊藿甙可在體外誘導(dǎo)hMSCs分化為軟骨細(xì)胞，為今后臨床應(yīng)用hMSCs修復(fù)軟骨的治療提供了細(xì)胞分子生物學(xué)水平的初步依據(jù)。

中藥的體外藥理實(shí)驗(yàn)因中藥本身的特點(diǎn)實(shí)施困難。目前常采用的方法是“含藥血清”實(shí)驗(yàn)方法。所謂“含藥血清”，是指給動(dòng)物或人服用一定量的藥物后，經(jīng)過(guò)一定的時(shí)間采血所獲得的血清，以模擬并試圖替代藥物本身而供實(shí)驗(yàn)研究使用的一種非單體藥物藥理研究的方法。近年來(lái)，該方法開(kāi)始引起眾多研究者的重視，并做了廣泛的研究，有效地帶動(dòng)了中藥及復(fù)方體外藥效學(xué)及藥理學(xué)評(píng)價(jià)研究的發(fā)展，但也逐漸暴露出其自身無(wú)法克服的弊端：無(wú)法確定最佳給藥方案；無(wú)法做到體外培養(yǎng)體系內(nèi)藥物濃度與血藥濃度相等又不影響組織、細(xì)胞生長(zhǎng)；藥效最佳的采血時(shí)間難以確定；血清成分復(fù)雜，不可控的影響因素太多，實(shí)驗(yàn)結(jié)果重復(fù)性差；血清本身固有的活性成分常影響試驗(yàn)結(jié)果，缺乏去除血清影響的理想措施[5]。而中藥單體成分簡(jiǎn)單，避免了中藥制劑中的多種雜質(zhì)，電解質(zhì)以及不同的酸堿度對(duì)體外培養(yǎng)系的影響，提高了研究結(jié)果的可靠性，從而對(duì)中藥進(jìn)行細(xì)胞學(xué)水平研究具有可行性。

淫羊藿始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》。其味辛甘，性溫，入肝腎二經(jīng)，具有補(bǔ)腎壯陽(yáng)，祛風(fēng)除溫等功效。用于陽(yáng)萎遺精、筋骨痿軟、風(fēng)濕痹痛、麻木拘攣等?，F(xiàn)代化學(xué)研究表明，淫羊藿單體成分淫羊藿甙為主要有效成分，具有廣泛藥理作用，可補(bǔ)腎陽(yáng)，強(qiáng)筋骨[6]。藥理學(xué)試驗(yàn)表明，其對(duì)于去卵巢腎陽(yáng)虛造模的大鼠骨質(zhì)疏松具有明顯的藥理作用[7]。

BMSCs體外向軟骨細(xì)胞分化受諸多生物學(xué)因素的影響，包括細(xì)胞培養(yǎng)微環(huán)境，細(xì)胞因子的參與、藥物等等。目前誘導(dǎo)BMSCs向軟骨細(xì)胞分化常用的誘導(dǎo)劑多由TGF-β、胰島素，地塞米松等組成[8]。近來(lái)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，以中藥制劑作為誘導(dǎo)劑也取得成功[9～10]。本組實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，含10%FBS H-DMEM培養(yǎng)基中加入淫羊藿甙能誘導(dǎo)BMSCs向軟骨細(xì)胞分化，熒光定量PCR可以檢測(cè)到Ⅱ型膠原表達(dá)。淫羊藿甙高劑量組誘導(dǎo)BMSCs軟骨細(xì)胞分化顯著。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，“腎主骨”“腎藏精，精生髓，髓養(yǎng)骨，骨生髓”，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)已經(jīng)證實(shí)，補(bǔ)腎之法可以治療骨質(zhì)疏松、關(guān)節(jié)軟骨退行性變。高劑量的淫羊藿甙有較強(qiáng)的補(bǔ)腎陽(yáng)，強(qiáng)筋骨的功效，這種治療作用與誘導(dǎo)BMSCs成軟骨細(xì)胞分化的機(jī)制可能有內(nèi)在的相關(guān)性。

［參與文獻(xiàn)］

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（責(zé)任編輯：駱歡歡）

R285.5

A

0256-7415（2016）01-0210-03

10.13457/j.cnki.jncm.2016.01.095

2015-06-11

廣州市花都區(qū)科技計(jì)劃項(xiàng)目（12-HDWS041）

黃荷（1974-），男，副主任中醫(yī)師，研究方向：骨關(guān)節(jié)疾病的中西醫(yī)結(jié)合治療。