金 寧張崇國李紅妍王 莉李 娟王科明王朝霞王繼榮▲

1.南京醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院病理科，江蘇南京 210011；2.南京醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院腫瘤科，江蘇南京 210011；3.南京醫(yī)科大學病理教研室，江蘇南京 211166

MMP-9在結(jié)直腸癌中的表達及臨床意義

金 寧1張崇國2李紅妍3王 莉2李 娟2王科明2王朝霞2王繼榮2▲

1.南京醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院病理科，江蘇南京 210011；2.南京醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院腫瘤科，江蘇南京 210011；3.南京醫(yī)科大學病理教研室，江蘇南京 211166

目的檢測基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP-9）在結(jié)直腸癌中的表達情況，探討其與腸癌浸潤和轉(zhuǎn)移的相關(guān)性。方法2007年1月～2010年12月期間在南京醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院和鹽城市第三人民醫(yī)院就診的行手術(shù)治療的99例結(jié)直腸癌患者作為研究對象。應(yīng)用組織芯片技術(shù)結(jié)合免疫組化SP法檢測結(jié)腸癌組織和自身正常腸黏膜組織中MMP-9的表達情況，分析腸癌的不同病理特征和組織中MMP-9表達之間的關(guān)系。結(jié)果MMP-9在結(jié)直腸癌組織中的表達明顯高于正常腸黏膜（P＜0.001）。在浸潤深度深、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分期晚的患者中，癌組織中MMP-9的表達明顯增高（P＜0.05）。癌組織中的表達與患者生存相關(guān)，癌組織MMP-9表達高的患者死亡比例高（P＜0.05）。結(jié)論MMP-9在結(jié)直腸癌組織中的表達和腫瘤浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移正相關(guān)。MMP-9可作為結(jié)直腸癌進展的指標，用于判斷預(yù)后。

結(jié)直腸癌；MMP-9；臨床意義

在消化道惡性腫瘤中結(jié)直腸癌極為常見，近年來，腸癌的發(fā)病率和死亡率每年均成上升趨勢[1]。目前結(jié)直腸癌的有效治療方法仍是手術(shù)治療，但是術(shù)后結(jié)直腸癌侵襲轉(zhuǎn)移可導(dǎo)致術(shù)后復(fù)發(fā)甚至死亡。腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致結(jié)直腸癌患者死亡的主要因素[2]。惡性腫瘤浸潤、侵襲及復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移的機制極其復(fù)雜，多種基因／蛋白質(zhì)的調(diào)控，多種細胞因子的參與，多條細胞信號通路的涉及，牽涉到惡性腫瘤細胞的增殖、黏附以及細胞外基質(zhì)和基膜的降解等不同過程和階段[3]。基質(zhì)金屬蛋白酶9（MMP-9）是重要的蛋白水解酶，屬于基質(zhì)金屬蛋白酶家族（MMPs），起破壞和裂解細胞外基質(zhì)的作用，從而促發(fā)惡性腫瘤細胞浸潤和腫瘤相關(guān)血管形成，最終促進惡性腫瘤的侵襲、復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移[4]。采用免疫組化結(jié)合組織芯片技術(shù)，本研究檢測結(jié)直腸癌組織99例和相應(yīng)的正常腸黏膜組織51例中MMP-9的表達，分析MMP-9的表達與結(jié)直腸癌各病理特征間的關(guān)系及二者表達的相關(guān)性。探討MMP-9蛋白在結(jié)直腸癌侵襲和轉(zhuǎn)移過程中的意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料

以2007年1月～2010年12月期間在南京醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院和鹽城市第三人民醫(yī)院行結(jié)直腸腸癌切除術(shù)的99例病例作為研究對象。患者納入標準為：行結(jié)直腸癌根治術(shù)的腫瘤患者；排除標準為：診斷為非結(jié)直腸癌的、已經(jīng)接受結(jié)直腸癌切除術(shù)、術(shù)前接受化療或放化療患者。統(tǒng)一在病理科收集腸癌及其對應(yīng)的正常腸組織蠟塊，同時將這些組織制成組織芯片點陣?；颊卟v中采集數(shù)據(jù)，包括：姓名、性別、年齡、臨床相關(guān)指標（血常規(guī)、肝腎功能、腫瘤標志等）、病理結(jié)果（腫瘤侵犯深度、淋巴結(jié)等）等。通過電話、衛(wèi)生部門及公安戶籍詢查等途徑對結(jié)直腸癌患者隨訪核查，隨訪終點是死亡，隨訪的終點時間為2014年5月1日。所有患者都有一份詳細的生存和臨床調(diào)查表，記錄患者的一般情況、臨床資料和隨訪情況等。99例患者中男63例，女36例；年齡33～92歲，中位年齡62歲，平均（61.4±12.8）歲。其中有51例患者有相應(yīng)的正常組織，我們觀察癌組織和正常組織中的MMP-9表達情況，并進行相關(guān)分析。

1.2 研究方法

1.2.1 組織芯片的制備 復(fù)查組織的HE染色切片，對癌和正常組織位點進行標記，每個患者的癌組織和相應(yīng)正常組織各選3個位點，組織芯間距2.0mm，取樣針直徑1.0mm，設(shè)計10×12點陣，包含120個位點，共制備組織芯片蠟塊4個。在52℃恒溫烤箱中將組織陣列塊加熱融合，然后存放4℃冰箱備用。

1.2.2 免疫組化SP法 常規(guī)切取厚度約4μm的切片。經(jīng)過二甲苯脫臘后，再進行水化。切片經(jīng)3% H2O2酶處理及洗滌后，按照推薦的抗體稀釋滴度加入鼠抗人MMP-9單克隆抗體，放置4℃冰箱過夜。接著按順序滴加羊抗鼠二抗以及辣根過氧化酶-卵白素-生物素標記的復(fù)合物，通過DAB顯色、蘇木素復(fù)染，左后封片。使用Olympus DD70 BX51圖像采集系統(tǒng)采集組織表達圖像， 應(yīng)用IMAGE-PRO plus4.0圖像分析軟件分析結(jié)果。免疫組化結(jié)果判定方法： 每張切片中隨機選擇10個高倍視野，以背景的染色強度為1，讀取吸光值（A）的相對比值，取其均值作為染色強度。

1.2.3 免疫組化評分標準 MMP-9表達的評分依照半定量的IRS方法，由兩個病理科醫(yī)師分別雙盲完成。若在雙盲讀片中量值差異較大，則由兩位讀片者共同讀片，再重新確定分值。染色濃度與染色比例的乘積為MMP-9表達的結(jié)果，染色濃度計分方法：0為完全陰性，1為弱陽性，2為中等陽性，3為強陽性；著色細胞比例計分方法：染色細胞比例為全視野的0～25%為1分， 26%～50%為2分，51%～75%為3分，76%～100%為4分。所以，IRS 評分為0～12分。應(yīng)用受試者工作特征曲線（ROC）分析得出，MMP-9的最優(yōu)切點值為8。在這些條件下，IRS為≤8被認為是MMP-9低表達，而IRS為＞8則認為是MMP-9高表達。

1.3 統(tǒng)計學處理

2 結(jié)果

2.1 結(jié)直腸癌組織與正常組織中MMP-9的表達情況

研究隊列中，99例癌組織與51例正常組織對比，癌組織中MMP-9表達高于正常組織，表達差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.001），見表1。51例有癌旁正常組織的患者進行配比分析，同樣看到癌組織中MMP-9表達高于正常組織，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.001），見表2。

表1 MMP-9在癌組織和正常組織中的表達差異

表1 MMP-9在癌組織和正常組織中的表達差異

注：兩組數(shù)據(jù)比較，t=5.0341，P＜0.001

類型 n MMP-9表達癌組織 99 9.25±3.21正常組織 51 6.25±3.89

表2 MMP-9在癌組織和自身正常組織中表達差異

表2 MMP-9在癌組織和自身正常組織中表達差異

注：兩組數(shù)據(jù)比較，t=7.1028，P＜0.001

類型 n MMP-9表達癌組織 51 9.67±3.19正常組織 51 6.25±3.89

2.2 結(jié)直腸癌患者MMP-9表達與臨床指標、生存預(yù)后的關(guān)系

99例患者有2例失訪，不計入生存分析。相對于癌組織中MMP-9低表達的大腸癌患者的高生存率57.45%，高表達患者的總生存率較低僅36.00%（P＜0.05），見表3。進一步觀察癌組織中MMP-9表達與大腸癌患者臨床指標間的相關(guān)性，結(jié)果顯示：癌中MMP-9表達高的患者中T4比例高達50.98%，高于MMP-9表達低的患者（P＜0.05）；N1/N2/ N3患者在MMP-9表達高的患者中占60.78%，高于MMP-9表達低的患者中的比例（P＜0.05）；同樣遠處轉(zhuǎn)移的患者在MMP-9高表達的患者中有29.41%，同樣高于MMP-9低表達的患者組（P＜0.05）；TNM分期為Ⅳ期的患者在MMP-9表達高的患者中比例高于低表達組（30.00% vs 6.98%，P＜0.05），提示MMP-9表達與腫瘤浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠處轉(zhuǎn)移及TNM分期正相關(guān)；而與腫瘤病理分級、年齡及性別均無相關(guān)性，見表4。同時，我們也發(fā)現(xiàn)癌旁組織中的MMP-9表達與任何臨床指標均無明顯相關(guān)，見表5。

表3 結(jié)直腸癌組中MMP-9表達與生存的關(guān)系[n（%）]

表4 結(jié)直腸癌患者中癌組織MMP-9的表達與臨床指標間的關(guān)系（例，%）

3 討論

在全球，結(jié)直腸癌是第三最常見的腫瘤類型，同時位列致死惡性腫瘤第四位[5]。轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)是結(jié)直腸癌致死的主要因素，所以高達50%以上的患者確診時無法接受根治性手術(shù)。國內(nèi)外對結(jié)直腸癌復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的機制進行了一系列探索，研究發(fā)現(xiàn)了一些與復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移相關(guān)的分子和作用通路，如NOTCH-DAB1-ABL-RHOGEF、KRas、TWIST及MicroRNAs等[6-8]，然而結(jié)直腸癌的分子發(fā)病和復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移機制在很大程度上仍然不十分清楚，因此，進一步深入了解結(jié)直腸癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的分子機制，對改善結(jié)直腸癌治療方案及其預(yù)后情況都有很大的促進作用。

腫瘤微環(huán)境在腫瘤發(fā)生中起重要作用，同時參與控制腫瘤的侵襲或轉(zhuǎn)移。腫瘤微環(huán)境的組成較為復(fù)雜，在支持腫瘤的發(fā)展和轉(zhuǎn)移過程中，較多信號因子涉及其中?；|(zhì)是腫瘤微環(huán)境的重要組成，基質(zhì)降解是促進腫瘤進展的重要關(guān)鍵環(huán)節(jié)[9-11]。MMPs 是一類具有降解細胞外基質(zhì)活性的酶家族，酶與鋅結(jié)合。MMPs 家族的第一種膠原酶在1962 年被發(fā)現(xiàn)，到目前為止已近30種。MMP-9在 MMPs中分子量最大，正常情況下以酶原形式分泌，一旦被激活，則形成Ⅳ型膠原酶，一方面通過毛細血管內(nèi)生、新生血管生成等促進腫瘤的生長及擴散，另外可以破壞和降解鄰近腫瘤表面的基底膜和細胞外基質(zhì)，從而使腫瘤細胞沿著缺失的基底膜向周圍組織浸潤，最終促進腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移[4，11]。研究發(fā)現(xiàn)，MMP-9與乳腺癌、骨肉瘤的轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)相關(guān)，在結(jié)直腸癌中也有一些零星的報道[12-16]。

表5 結(jié)直腸癌患者正常組織中MMP-9的表達與臨床指標間的關(guān)系[n（%）]

本研究發(fā)現(xiàn)，MMP-9 在結(jié)直腸癌組織中為強陽性表達，癌組織中的表達為（9.25±3.21），明顯高于正常組織水平（6.25±3.89） （P＜0.001）。同時我們發(fā)現(xiàn)癌組織中MMP-9表達高的患者中T4比例高達50.98%，高于MMP-9表達低的患者中的比例30.23%（P＜0.05）；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者在MMP-9高表達組別中占60.78%，在MMP-9低表達組占39.53%（P＜0.05）；同時在MMP-9高表達組，29.41%的患者有遠處轉(zhuǎn)移，在低表達組遠處轉(zhuǎn)移患者比例僅為6.98%。同樣MMP-9高表達組，TNM分期中Ⅳ期患者比例明顯增高。因此癌組織中MMP-9 的表達水平可判斷結(jié)直腸癌的浸潤進展程度從而幫組確定患者TNM分期。在進一步的研究中我們發(fā)現(xiàn)，隨訪到觀察終點時癌組織中MMP-9表達高的患者生存比例低，為36.00%，明顯低于MMP-9表達低的患者中的比例57.45%，提示癌組織中MMP-9表達與結(jié)直腸癌患者預(yù)后相關(guān)，MMP-9的高表達會導(dǎo)致患者的預(yù)后非常差，這也佐證了MMP-9對于結(jié)直腸癌分期的意義是具有臨床價值的，是具有連接性的因果關(guān)系的，這對結(jié)直腸癌患者的臨床預(yù)后判斷具有重要的指導(dǎo)意義。另外，本研究發(fā)現(xiàn)MMP-9的表達與腫瘤病理分級、年齡及性別均無相關(guān)性，而正常組織中MMP-9的表達與腫瘤浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠處轉(zhuǎn)移及TNM分期均無相關(guān)，這證明了MMP-9與結(jié)直腸癌細胞的特異性，這對于臨床上進一步發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌的發(fā)病機制，做出合理的臨床診斷以及制定針對性的治療方案具有非常重要的臨床價值和意義，同時也為研究針對結(jié)直腸癌的靶向藥物提供了新的方向。

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Expression of MMP-9 in colorectal carcinoma and its clinical significance

JIN Ning1ZHANG Chongguo2LI Hongyan3WANG Li2LI Juan2WANG Keming2WANG Zhaoxia2WANG Jirong2
1. Department of Pathology, the Second Affiliated Hospital of Nanjing Medical University, Jiangsu, Nanjing 210011, China; 2. Department of Oncology, the Second Affiliated Hospital of Nanjing Medical University, Jiangsu, Nanjing 210011, China; 3. Department of Pathology, Nanjing Medical University, Jiangsu, Nanjing 211166, China

ObjectiveTo investigate the expressions of matrix metalloproteinases (MMP-9) in colorectal carcinoma, and to analyze correlation between MMP-9 and invasion and metastasis of colorectal carcinoma.Methods99 cases of colorectal carcinoma patients received radical resection in the Second Affiliated Hospital of Nanjing Medical University and Yancheng NO.3 People's Hospital from January 2007 to December 2010 were enrolled in our study. The expressions of MMP-9 in colorectal carcinoma and normal colorectal tissues were detected by using tissue chip technology combined with immunohistochemistry SP assay. The relations between the expressions of MMP-9 and clinicopathological features of colorectal carcinoma were analyzed.ResultsIn colorectal carcinoma, the expression levels of MMP-9 was significantly higher than those of normal colorectal tissues (P＜0.001). Patients with high stage of invasive depth, lymph node metastasis, and high linical stage showed obvious higher positive rates of MMP-9 than those of patients with low stage of invasive depth, without lymph node metastasis, and with low linical stage (P＜0.05). It showed obvious negative correlation among MMP-9 and survival of patients with colorectal carcinoma. Patients with higher MMP-9 expression level in carcinoma tissues showed higher death rates (P＜0.05).ConclusionThe expression of MMP-9 in colorectal carcinoma is closely related to the depth of tumor invasion, lymph node metastasis. MMP-9 can relex the progress of colorectal carcinoma, and judge the prognosis of patients with colorectal carcinoma.

Colorectal carcinoma; MMP-9; Clinical significance

R735.34

A

2095-0616（2016）21-33-05

2016-09-01）

江蘇省高校自然科學研究面上項目（15KJB320006）。

▲通訊作者