魯 明 付 波 馬 翔 吳冬冬 趙慶洪

南京醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院普外科，江蘇南京 210011

干細胞標志物CD133與胃癌臨床特征的相關性研究

魯 明 付 波 馬 翔 吳冬冬 趙慶洪▲

南京醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院普外科，江蘇南京 210011

目的探討CD133蛋白表達與胃癌患者臨床特征以及預后之間的關系。方法使用免疫組化染色方法檢測我院118例胃癌患者手術切除的病灶組織中CD133表達情況，并檢索相關數(shù)據(jù)庫對已報道的CD133表達與胃癌臨床特征的研究做系統(tǒng)性薈萃分析，進一步驗證我們的結果。結果免疫組化結果顯示胃癌患者CD133蛋白表達陽性率為28.81%（34例/118例）。CD133表達與患者年齡、性別、腫瘤直徑、分化程度、Lauren’s分型無關（P＞0.05）；但與胃癌患者腫瘤的浸潤深度、淋巴結轉移及TNM分期明顯相關（P＜0.05）。Meta分析結果顯示胃癌腫瘤浸潤越深（OR=0.36，95%CI=0.26～0.49，P＜0.0001）；有淋巴結轉移（OR=0.36，95%CI=0.26～0.50，P＜0.0001）；以及TNM分期越高（OR=0.32,95%CI=0.24～0.42，P＜0.0001)，CD133蛋白陽性表達率越高。并且CD133陽性表達提示胃癌患者預后不良（HR=2.21，95% CI=1.52～3.22）。結論CD133表達與胃癌浸潤深度，淋巴轉移，臨床分期以及預后顯著相關，也許能夠作為未來胃癌治療的新的分子靶點。

CD133；腫瘤干細胞；胃癌；免疫組化；薈萃分析

胃癌是全世界發(fā)病率最高的惡性腫瘤之一，在癌癥相關死亡原因中居第三位[1]。胃癌的發(fā)生是一個多因素，多機制，多途徑共同作用的結果。腫瘤干細胞理論為腫瘤的發(fā)病機制提出了全新的闡釋，隨著對腫瘤干細胞的深入研究，尋找其特異性的標志物成為研究熱點。CD133是一個5跨膜結構域的單鏈糖蛋白，它是一種在正常干細胞和腫瘤干細胞表面廣泛表達的糖蛋白。CD133作為一種腫瘤干細胞標志物已被發(fā)現(xiàn)于肺癌、結腸癌、肝癌、乳腺癌等多種腫瘤，但其生物學功能仍不明確。有研究探索了CD133的表達與胃癌患者臨床病理特征以及預后之間的關系，但結論尚不統(tǒng)一，存在較多爭議[2-4]。因此，為了更好的了解CD133在胃癌發(fā)病機制中的作用以及CD133蛋白的表達與胃癌臨床病理特征之間的關系，本研究采用免疫組化（ICH）方法檢測CD133蛋白在胃癌中的表達水平，同時本研究收集相關文獻，通過Meta分析方法系統(tǒng)性評價CD133表達與胃癌臨床病理特征以及患者預后的關系，為胃癌的診治及判斷預后評估提供循證醫(yī)學證據(jù)，也為胃癌將來的靶向治療提供新思路。

1 資料與方法

1.1 一般資料

1.1.1 病例選擇 選取南京醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院普外科胃癌術后（2014年12月～2016年8月）經(jīng)病理科切片所保存的原發(fā)性胃癌患者組織切片，標本均經(jīng)我院病理科醫(yī)師證實確認，術后病理分期參照美國癌癥聯(lián)合委員會（AJCC）及國際抗癌聯(lián)盟（UICC）第七版TNM分期標準。胃癌患者共118例，其中男84例，女34例；中位年齡62歲（42～85歲）。所有的患者均具有完整的病理資料，并且術前均未接受放化療或免疫治療，詳細情況見表1。

表1 CD133 蛋白的表達與胃癌臨床病理特征之間的關系

1.1.2 實驗試劑 兔抗人CD133單克隆抗體（北京奧博森生物技術有限公司），通用型二抗試劑盒（北京中衫金橋生物技術有限公司），Triton試劑（Vetec，美國），抗原修復液（南京凱基生物科技發(fā)展有限公司），DAB 顯色液（邁新試劑，中國）。梯度乙醇、蘇木素染液、二甲苯、過氧化氫液、中性樹膠及封片由南京醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院病理科提供。

1.2 方法

1.2.1 免疫組化技術 標本用10%甲醛溶液固定，分別行HE染色和免疫組織化學染色（ABC法）。常規(guī)脫蠟，梯度乙醇脫水，微波爐加熱抗原修復，3%H2O2滅活內(nèi)源性過氧化物酶，PBS沖洗，孵一抗、二抗，DAB顯色，蘇木精復染，樹脂封片。

1.2.2 染色結果判定 免疫組化的染色結果由兩位病理科醫(yī)生在雙盲的情況下獨立讀取。CD133定位于細胞膜上，陽性表達表現(xiàn)為淺黃色、棕黃色或棕褐色。隨機選取4個高倍視野，根據(jù)陽性細胞百分比及陽性細胞染色強弱計算免疫組化染色評分[5]：（1）無陽性細胞為 0分，陽性細胞總數(shù)＜25%為1分，25%～49%為2分，≥50%為3分；（2）無著色為 0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。（1）（2）兩項乘積即為其免疫組化評分，＜3分為陰性，≥3分為陽性見圖1。

圖1 CD133在胃癌及正常黏膜組織中的表達水平（免疫組化×400）

1.2.3 檢索策略 檢索PubMed，EMBASE，Web of Science數(shù)據(jù)庫。檢索時間至2016年8月1日，語言限制為英語。檢索詞為：“CD133”或“prominin-1”和“gastric cancer”或“gastric tumor”。檢索策略均采用主題詞同自由詞相結合的方法進行全面綜合的檢索。同時對納入的相關文獻的參考文獻也進行仔細回溯，以避免可能遺漏的類似研究。

1.2.4 文獻納入排除標準 納入標準：（1）均為公開發(fā)表的研究 CD133 在胃癌中的表達與胃癌臨床病理特征或胃癌患者生存預后之間相關性的研究；（2）研究中所有的胃癌患者均經(jīng)過病理檢查確診并且 CD133 蛋白的表達檢測方法為免疫組織化學（IHC）法；（3）研究能夠提供相應的數(shù)據(jù)信息；（4）納入研究語言僅限定為英語。排除標準：（1）文獻不能夠提供所需要的相關研究數(shù)據(jù)；（2）評論、綜述和動物研究以及其他非人類研究；（3）數(shù)據(jù)重復或重復發(fā)表的文獻。

表2 納入研究文獻的基本特征

1.2.5 文獻質量評估 納入文獻的質量評價使用病例-對照研究的NOS（Newcastle Ottawa Scale）評價標準來進行評估。包括以下項目：病例組和對照組的選擇方法、可比性、接觸暴露評估方法。

1.2.6 數(shù)據(jù)提取 所有納入研究的相關數(shù)據(jù)信息均有兩位人員獨立進行提取，并收集相關數(shù)據(jù)信息。對于無法直接獲得生存期相關數(shù)據(jù)信息的研究，我們使用Parmar等[6]和Tierney等[7]所報道的統(tǒng)計分析方法進行計算，或者對文獻中提供的Kaplan-Meier生存曲線使用 GetData Graph Digitizer2.26（http：//getdata-graph-digitizer.com）提取數(shù)據(jù)計算相應的風險比（HR）及其對應的 95%的可信區(qū)間（CI）。

1.2.7 統(tǒng)計學方法 CD133蛋白表達與胃癌臨床病理特征之間的關系采用χ2檢驗，檢驗水準α=0.05，且P＜0.05認為差異有統(tǒng)計學意義。通過風險比（HR）和95%可信區(qū)間（CI）計算CD133蛋白的表達水平與胃癌患者的生存預后的相關性。研究中的異質性使用Q檢驗和I2檢驗。如果P≥0.10且I2≤50%，表明納入的各研究結果之間存在一致性，此時采用固定效應模型；如果P＜0.10，I2＞50%，表示納入的各研究結果之間存在較大的異質性，選擇隨機效應模型。所有的統(tǒng)計分析使用SPSS17.0和Stata12.0軟件進行。

2 結果

2.1 胃癌組織中CD133蛋白表達與其臨床病理特征的關系

CD133蛋白的表達與胃癌臨床病理特征之間的關系詳見表1。統(tǒng)計分析結果顯示：胃癌組織中CD133蛋白的表達與胃癌腫瘤的浸潤深度、淋巴結轉移及TNM分期有明顯相關性，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。而與患者的性別、年齡、腫瘤大小、組織類型及組織分化程度均無明顯相關性（P＞0.05）。

2.2 Meta分析結果

2.2.1 納入研究的基本特征 最終共檢索到相關研究文獻108篇，逐層篩選后，最后9篇文獻被納入本次研究之中見圖2。納入的9篇相關研究[2-4，8-13]，包含了1316例胃癌患者。所有的研究均來自亞洲國家。各研究均分布在2010～2014年之間。納入文獻的基本特征詳見表2。

圖2 納入文獻篩選流程及結果圖

2.2.2 合并效應量分析 分析結果顯示胃癌男性組vs胃癌女性組與胃癌低齡組vs胃癌高齡組（OR=1.35，95%CI=0.92～1.96，P=0.121）；胃癌高中分化組vs胃癌低分化組（OR=0.96，95%CI=0.58～1.60，P=0.889）；說明胃癌組織中CD133蛋白的表達與患者性別年齡，胃癌組織分化程無關。

圖3 胃癌中浸潤深度T1～T2組vs浸潤深度T3～T4組CD133蛋白表達比較Meta分析

圖4 Ⅰ～Ⅱ期胃癌組vsⅢ～Ⅳ期胃癌組CD133蛋白表達比較Meta分析

圖5 無淋巴結轉移組vs有淋巴結轉移組CD133蛋白表達比較Meta分析

圖6 CD133陽性表達組vs CD133陰性表達組患者總生存預后比較Meta分析

有5篇研究報道了胃癌浸潤深度T1～T2組vs胃癌浸潤深度T3～T4組組織中CD133蛋白的表達情況。其結果顯示兩組間的差異具有統(tǒng)計學意義（OR=0.36， 95%CI=0.26～ 0.49，P＜ 0.0001），（P=0.197，I2=33.7%＜50%）。表明T3～T4組胃癌病人的CD133蛋白表達陽性率高于T1～T2組，詳見圖3。

有8篇研究報道了Ⅰ～Ⅱ期胃癌組vs Ⅲ～Ⅳ期胃癌組組織中CD133蛋白的表達情況。其結果顯示兩組間的差異具有統(tǒng)計學意義（OR=0.32，95%CI=0.24～ 0.42， P＜ 0.0001），（P=0.325，I2=13.4%＜50%）。表明Ⅲ～Ⅳ期胃癌組CD133蛋白的表達陽性率高于Ⅰ～Ⅱ期胃癌組，詳見圖4。

有6篇研究報道了胃癌無淋巴結轉移組vs胃癌伴淋巴結轉移組組織中CD133蛋白的表達情況。其結果顯示兩組間的差異具有統(tǒng)計學意義（OR=0.36，95%CI=0.26～ 0.50， P＜ 0.0001），（P=0.475，I2=0%＜50%）表明胃癌伴有淋巴結轉移組CD133蛋白的表達陽性率高于胃癌無淋巴結轉移組，詳見圖5。

在納入的所有文獻中，有8篇研究報道了胃癌組織中CD133蛋白的表達與胃癌患者總體生存預后之間的關系。數(shù)據(jù)顯示，CD133陽性vs CD133陰性，兩組間的差異具有統(tǒng)計學意義（OR=2.39，95% CI=1.99～2.87， P＜0.001）。同時，使用多因素和單因素分類進行統(tǒng)計分析，結果顯示CD133 蛋白陽性表達胃癌患者總體生存時間低于CD133蛋白陰性表達患者（HR = 2.21，95%CI = 1.52～3.22和HR=2.45，95%CI=1.98～3.02），提示CD133蛋白表達陽性率與胃癌患者生存預后有關，胃癌患者CD133 蛋白表達陽性提示預后不良，詳見圖6。

3 討論

胃癌是一種具有高發(fā)生率和死亡率的惡性腫瘤，其發(fā)生發(fā)展是一個長期的過程，與多種因素有關。隨著對腫瘤發(fā)病機制研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)腫瘤細胞在表面標志、細胞性質以及信號轉導通路等方面與干細胞具有許多相似之處，并且具有干細胞特性的細胞較正常細胞更容易發(fā)生突變而成為腫瘤發(fā)生的起始細胞。CD133是目前用于各種腫瘤干細胞研究的熱點標志物之一， 是一種跨膜糖蛋白，屬于prominin家族成員之一。CD133已在多種腫瘤中獲得了廣泛的研究，并且研究證實其與結直腸癌及胰腺癌的腫瘤進展密切相關[14]。欒可峰等[15]在研究口腔鱗癌發(fā)現(xiàn)CD133陽性細胞比CD133陰性細胞具有更強侵襲力和轉移能力。現(xiàn)研究證實CD133陽性的腫瘤細胞具有干細胞的特性，包括自我更新、無限繁殖和多向分化的潛能[16]，同時還具有顯著的致瘤能力。由于CD133在胃癌中的生物學功能及具體機制尚不明確，因此對CD133與胃癌關系的研究成為近年來的新熱點。在眾多研究中有關CD133蛋白的表達與胃癌臨床病理特征及胃癌患者的生存預后之間的關系的研究質量參差不齊，結果尚不統(tǒng)一，仍存在很大的爭議。

本研究的免疫組化結果顯示，胃癌組織中CD133的表達陽性率與患者年齡，性別，腫瘤大小及腫瘤的組織學分級無關。但隨著胃癌腫瘤浸潤深度、淋巴結轉移和腫瘤TNM分期的增高，CD133蛋白表達水平也明顯升高，提示CD133蛋白表達和胃癌侵襲轉移呈正相關。

柳少光等[17]對CD133在胃癌組織中表達進行了系統(tǒng)行評價發(fā)現(xiàn)CD133 蛋白在胃癌組織中的表達比癌旁組織及正常胃組織高，而且其表達與淋巴結轉移、遠處轉移及臨床分期等明顯相關，說明 CD133 可能在胃癌發(fā)生、發(fā)展過程中起重要作用。但由于其樣本量偏少，結論具有一定的局限性?，F(xiàn)為了進一步明確CD133表達和胃癌臨床特征之間關系，同時驗證我們的實驗結果，對已報道的CD133表達與胃癌臨床特征相關文獻進行系統(tǒng)性Meta分析。我們發(fā)現(xiàn)腫瘤的浸潤深度越深、有淋巴結轉移和TNM分期越高的患者CD133表達陽性率越高，CD133表達與性別、年齡及腫瘤分化程度之間的無統(tǒng)計學意義[18]，這與我們研究結果相一致。同時我們還發(fā)現(xiàn)，和CD133陰性表達的患者相比CD133 的陽性表達的患者其生存預后較差（HR=2.21，95%CI= 1.52～3.22）。總體而言，CD133 蛋白的表達與胃癌的臨床病理特征以及胃癌患者的生存預后具有密切的相關性，這與CD133在動物和細胞中的研究結果相一致。

然而本研究仍然存在一些不足。首先，納入實驗研究的118例胃癌患者樣本量相對較小，并且缺乏長期的隨訪資料。因此我們通過檢索相關文獻進行系統(tǒng)性meta分析，在一定程度上擴大了驗證的樣本量，彌補了樣本量的不足，同時根據(jù)現(xiàn)有研究結果間接的分析CD133表達與胃癌患者預后的關系，使我們的結論更可信、全面。其次，雖然限制免疫組化（IHC）為唯一的蛋白檢測方法，但不同的研究中對于限定 CD133 蛋白陽性表達的截斷值不同，這可能導致不同研究之間存在異質性。另外，所有納入研究的相關文獻均來自亞洲國家，這與胃癌在亞洲國家高發(fā)有關，但該項差異限制了本結果在亞洲以外其他人群中的應用。

綜上所述，CD133蛋白的表達與胃癌臨床病理特征之間的關系具有顯著相關性，胃癌腫瘤浸潤越深，有淋巴結轉移，TNM分期越高，CD133蛋白表達陽性率越高等。此外Meta分析的結果提示CD133蛋白陽性表達的胃癌患者具有較差的預后。以上結果表明CD133 在胃癌組織中表達對判斷腫瘤侵襲和轉移具有一定的臨床意義，可作為胃癌患者潛在的生存預后的指標，也許能夠為未來胃癌靶向治療開辟新的路徑。

[1] Torre LA， Bray F， Siegel RL， et al. Global cancer statistics， 2012 [J]. CA： a cancer journal for clinicians，2015， 65（2）： 87-108.

[2] YU JW， ZHANG P， WU JG， et al. Expressions and clinical significances of CD133 protein and CD133 mRNA in primary lesion of gastric adenocacinoma [J]. Journal of experimental & clinical cancer research ： CR， 2010，29：141.

[3] Zhao P， Li Y， Lu Y. Aberrant expression of CD133 protein correlates with Ki-67 expression and is a prognostic marker in gastric adenocarcinoma [J]. BMC cancer，2010， 10：218.

[4] Wang T， Ong CW， Shi J， et al. Sequential expression of putative stem cell markers in gastric carcinogenesis [J]. British journal of cancer， 2011， 105（5）： 658-665.

[5] 張子杰.乳腺癌中CD44、CD133+細胞表達及其與臨床特征相關性研究 [J]. 臨床和實驗醫(yī)學雜志， 2014，14： 1166-1168.

[6] Parmar MK， Torri V， Stewart L. Extracting summary statistics to perform meta-analyses of the published literature for survival endpoints [J]. Statistics in medicine，1998， 17（24）： 2815-2834.

[7] Tierney JF， Stewart LA， Ghersi D， et al. Practical methods for incorporating summary time-to-event data into metaanalysis [J]. Trials， 2007， 8：16.

[8] Hashimoto K， Aoyagi K， Isobe T， et al. Expression of CD133 in the cytoplasm is associated with cancer progression and poor prognosis in gastric cancer [J]. Gastric cancer ： official journal of the International Gastric Cancer Association and the Japanese Gastric Cancer Association，2014， 17（1）： 97-106.

[9] Chen S， Hou JH， Feng XY， et al. Clinicopathologic significance of putative stem cell marker， CD44 and CD133， in human gastric carcinoma [J]. Journal of surgical oncology， 2013， 107（8）： 799-806.

[10] Saricanbaz I， Karahacioglu E， Ekinci O， et al. Prognostic significance of expression of CD133 and Ki-67 in gastric cancer [J]. Asian Pacific journal of cancer prevention ：APJCP， 2014， 15（19）： 8215-8219.

[11] IShigami S， Ueno S， Arigami T， et al. Prognostic impact of CD133 expression in gastric carcinoma [J]. Anticancer research， 2010， 30（6）： 2453-2457.

[12] Wakmatsu Y， Sakamoto N， OO H Z， et al. Expression of cancer stem cell markers ALDH1， CD44 and CD133 in primary tumor and lymph node metastasis of gastric cancer [J]. Pathology international， 2012， 62（2）： 112-119.

[13] Lee HH， Seo KJ， An CH， et al. CD133 expression is correlated with chemoresistance and early recurrence of gastric cancer [J]. Journal of Surgical Oncology， 2012，106（8）： 999-1004.

[14] 姜林鶴， 宋云駿， 劉運江， 等. CD133在結直腸癌組織中的表達及其與患者預后關系的研究 [J]. 臨床和實驗醫(yī)學雜志， 2015， 9（10）： 723-25.

[15] 欒可峰， 李新新， 孫學輝， 等. 舌鱗狀細胞癌組織中CD44和CD133的表達及臨床意義 [J]. 湖北名族學院學報（醫(yī)學版）， 2016， 33（3）： 17-20.

[16] Ma S， Tang KH， Chan YP， et al. miR-130b Promotes CD133（+） liver tumor-initiating cell growth and selfrenewal via tumor protein 53-induced nuclear protein 1 [J]. Cell Stem Cell， 2010， 7（6）： 694-707.

[17] 柳少光， 高寅生， 候亞勃， 等. CD133在胃癌組織中的表達及臨床意義的系統(tǒng)評價 [J]. 中國循證醫(yī)學雜志， 2014， 14（3）： 349-354.

[18] 法凱，孫濤.胃癌干細胞的研究進展[J]. 疑難病雜志，2015，14（1）：97-99.

Correlation research between stem cell marker CD133 and clinical features of gastric cancer patients

LU Ming FU Bo MA Xiang WU Dongdong ZHAO Qinghong
Department of General Surgery, the Second Affiliated Hospital of Nanjing Medical University, Nanjing 210011, China

ObjectiveTo explore the association between the expression of CD133 and the clinical features of gastric cancer patients.MethodsThe expression of CD133 protein in gastric cancer tissues of 118 patients were detected by immunohistochemical (ICH) staining. A meta-analysis was performed to further validate the correlation of CD133 expression with the clinical characteristics of gastric cancer patients.ResultsThe results of ICH indicated that the positive expression rate of CD133 in gastric cancer tissues was 28.81% (34/118). The expression of CD133 was not associated with the age, sex, tumor diameter, differentiation and Lauren’ s types (P＞0.05), but it was correlated with depth of invasion, lymphatic metastasis and clinical stages (P＜ 0.05). In addition, in our meta-analysis, we found the expression rate of CD133 was higher in T3,T4 of invasion depth (OR=0.36, 95%CI=0.26–0.49, P＜0.0001), and it was positive of lymphatic metastasis (OR=0.36, 95%CI=0.26–0.50, P＜0.0001) and III, IV of clinical stage (OR=0.32, 95%CI=0.24–0.42, P＜0.0001). Positive expression of CD133 was related to worse prognosis (HR=2.21, 95%CI=1.52-3.22).ConclusionThe expression of CD133 was associated with depth of invasion, lymphatic metastasis, clinical stages and poor outcome of gastric cancer. CD133 may act as a new molecular target for treatment of gastric cancer in the future.

CD133; Cancer stem cell; Gastric cancer; ICH; Meta-analysis

R735.2

A

2095-0616（2016）21-22-07

2016-09-17）

▲通訊作者