石 萍，魯增輝，曾 緯，陳仕江

（重慶市中藥研究院 重慶 400065）

日本醫(yī)蛭的研究進展＊

石 萍，魯增輝，曾 緯，陳仕江＊＊

（重慶市中藥研究院 重慶 400065）

日本醫(yī)蛭是中國藥典收載的唯一吸食動物血液的水蛭藥材品種，具有極強的抗凝血酶活性和抗血小板聚集作用?，F(xiàn)階段對日本醫(yī)蛭的研究十分匱乏，不利于日本醫(yī)蛭資源繁育及開發(fā)利用。本研究綜合國內外日本醫(yī)蛭的研究現(xiàn)狀進行了分析，并闡述了日本醫(yī)蛭產(chǎn)業(yè)發(fā)展存在的問題，旨在為更好地保護利用中藥材資源提供數(shù)據(jù)和參考。

中藥 日本醫(yī)蛭 人工養(yǎng)殖 抗凝活性

中藥水蛭（Hirudo），作為活血化瘀類動物藥材的代表藥，具有破血、逐瘀、通經(jīng)的功效，始載于《神農本草經(jīng)》[1]。臨床研究表明，水蛭在治療動脈粥樣硬化[2]、高脂血癥[3]、抗血栓[4]、抗腫瘤[5]、抗炎癥[6]等方面有較好的療效。日本醫(yī)蛭（Hirudo nipponica Whitman，1886）隸屬于環(huán)節(jié)動物門蛭綱無吻蛭目醫(yī)蛭屬[7]，是《中國藥典》（2015年版）收載的唯一吸食動物血液的水蛭藥材種類，其體內含有世界上最強天然抗凝血酶類物質—水蛭素，因此具有極強的抗凝血酶活性和抗血小板聚集作用[8]，藥效遠高于《中國藥典》收載的另外兩個品種。

目前，國際上對蛭綱動物的研究主要集中于歐洲醫(yī)蛭Hirudo medicinalis Linnaeus[9,10]、寬體金線蛭Whitmania pigra Whitman[11,12]和菲牛蛭Poecilobdella manillensis Lesson[13]，對日本醫(yī)蛭的研究卻十分匱乏。本研究通過查閱總結國內外有關日本醫(yī)蛭相關研究報道，從日本醫(yī)蛭生藥學、活性成分、醫(yī)藥應用以及人工養(yǎng)殖等方面進行綜述，并探討了日本醫(yī)蛭產(chǎn)業(yè)發(fā)展存在的問題，為更好保護利用這一寶貴中藥材資源提供基礎資料和參考。

1 日本醫(yī)蛭的生藥學研究

1.1 水蛭藥材基原論證

根據(jù)《中國藥典》（2015年）記載水蛭基原為水蛭科動物螞蟥Whitmania pigra Whitman、水蛭H. nipponica Whitman或 柳 葉 螞 蟥W. acranulata Whitman的干燥全體[8]。但一直以來，學者們對于水蛭的基原品種都有較多的爭議與討論。來復根等[14]就中藥材水蛭的原動物來源分別從原動物、加工炮制及主治功能進行本草學考證，認為藥用水蛭的基原動物應該為日本醫(yī)蛭及麗醫(yī)蛭H. pulchra Song。涂玉堂[15]從藥理及歷代文獻等方面對水蛭基原進行了討論，認為水蛭藥材基原應以“醫(yī)蛭”的干燥全體為佳。劉敏等[16]采用文獻考證藥物品種、產(chǎn)地、炮制與藥物實測相結合的方法，運用數(shù)據(jù)統(tǒng)計學處理方法，對張仲景方中水蛭劑量開展古今折算研究，得出仲景方中水蛭應為日本醫(yī)蛭干燥全體。朱茂礽[17]依據(jù)古代本草記載，結合現(xiàn)代研究，認為應該把不吸血的螞蟥或柳葉螞蟥與吸血水蛭區(qū)別開，吸血水蛭也應按動物名區(qū)別開。張衛(wèi)等[18]通過系統(tǒng)的本草文獻梳理研究后認為，傳統(tǒng)中醫(yī)使用的中藥水蛭是生于水中，體型較小且能吸食人與牛、馬血的水蛭，具有這些特性的水蛭品種有日本醫(yī)蛭、麗醫(yī)蛭、南京牛蛭Poecilobdella nanjingensis sp. Nov.、菲牛蛭以及湖北牛蛭P. hubeiensis Yang 5個品種。

1.2 藥材鑒定、系統(tǒng)發(fā)育分類

關于水蛭藥材的鑒別特征，沒有標準統(tǒng)一的認識。有報道稱判斷水蛭藥材真?zhèn)蔚暮暧^標準為外觀有自然黑色光澤，味淡且有魚腥氣，折斷時有一定的韌度，斷面有膠質光澤[19]。張貴君等[20]指出水蛭的粉末鑒別特征為纖維、表皮細胞與縱肌纖維細胞。劉曉帆等[21]驗證發(fā)現(xiàn)，水蛭正品與偽品在這些方面幾乎一模一樣，無法進行鑒別。

蛭類的傳統(tǒng)分類研究主要依據(jù)形態(tài)學特征，但有些種類外形特征十分接近，因此除了傳統(tǒng)的形態(tài)學分類以外，很多學者利用不同的方法及手段加以研究。楊潼等[22]以日本醫(yī)蛭為研究對象，對醫(yī)蛭科種類的染色體數(shù)目及形狀進行了研究，并對蛭類染色體數(shù)目與系統(tǒng)發(fā)生的關系進行了討論，得出日本醫(yī)蛭所在的醫(yī)蛭科染色體數(shù)目2n=16，石蛭科的種類2n大多在16-22，二者有更加密切的親緣關系。在分子水平上，羅媛媛等[23]利用同工酶技術對日本醫(yī)蛭和天目山蛭Haemadipsa tianmushana Song的3種同工酶進行了比較研究，探討了該兩種吸血蛭上述酶類的異同程度，為蛭類分類和不同環(huán)境溫度下酶活變化等提供了參考資料。江佩芬等[24]采用蛋白電泳技術分析表明，日本醫(yī)蛭電泳主要條帶高于光潤金線蛭W. laevis Barid、寬體金線蛭、尖細金線蛭W. acranulata Whitman。汪波等[25]采用蛋白電泳對7種水蛭組織細胞可溶性蛋白成分進行了蛋白電泳圖譜特性分析，結果發(fā)現(xiàn)日本醫(yī)蛭蛋白條帶最多，為28個，并且吸血蛭類的蛋白條數(shù)要顯著多于非吸血蛭類，而3種不同地理分布的菲牛蛭間表達蛋白圖譜無明顯差異，該研究為在蛋白水平分析中國水蛭分類和藥材鑒別提供了參考依據(jù)。

DNA分子標記應用于水蛭物種分類及水蛭藥材混偽品鑒定的研究，也有報道。Liu等[26]采用ISSR和SRAP分子標記的方法對采自中國8省的日本醫(yī)蛭和螞蟥不同種群的遺傳多樣性和系統(tǒng)發(fā)育關系進行了研究。徐云玲等[27,28]對無吻蛭目5種水蛭線粒體基因組進行了測序及注釋分析，得到日本醫(yī)蛭線粒體全基因組序列，并對其系統(tǒng)進化關系進行了分析討論。劉曉帆等[29]利用COI基因對收集中國7個省區(qū)12份蛭類動物的樣品及藥材樣品進行了分子鑒定，從結果中可以看出，水蛭的正品來源日本醫(yī)蛭、寬體金線蛭以自舉值100的支持率形成一個獨立的分支，其他混偽品聚為獨立的一支，得出基于COI序列的DNA條形碼技術適用于藥材水蛭及其混偽品的鑒定。

圖1 日本醫(yī)蛭中提取到的蝶啶類化合物

2 日本醫(yī)蛭活性成分研究

2.1 日本醫(yī)蛭化學成分

目前，已從日本醫(yī)蛭中分離得到多種活性物質和成分。日本學者Noda等[30,31]自1993年起，先后從日本醫(yī)蛭中分離得到9個兩性磷脂類化合物和12個糖苷類化合物，在12個糖苷類化合物中，有6個是含3個半乳糖基的中性鞘氨醇。Li等[32]從日本醫(yī)蛭中得到3個蝶啶類化合物Hirudinoidines A-C。張漢貞等[33]對不同食性的螞蟥和日本醫(yī)蛭中所含氨基酸、微量元素進行了含量測定和分析，結果表明，兩種水蛭中氨基酸種類及含量無明顯差別，在微量元素的含量方面，尤其是活性較強的微量元素，吸血的日本醫(yī)蛭具有明顯的優(yōu)勢。金仕勇等[34]對人工養(yǎng)殖及野生條件下日本醫(yī)蛭微量元素分別進行了測定，結果表明人工及野生個體體內所含微量元素一致，均含有人體必需元素，這些元素對增強血液循環(huán)、抗凝血等具有很大的作用。李友賓等[35]利用各種色譜方法對日本醫(yī)蛭進行分離純化，得到8個化合物，分別是菜油甾醇、十六烷基甘油醚、（2S，3S，4E）-4，5-二脫氫十八鞘氨醇二十五烷酸脂肪酰胺、1-O-β-D-吡喃葡萄糖基-2-N-（二十二酰基）-E-4，5-二脫氫-3-羥基十八腦苷脂、丁二酸、次黃嘌呤、丙胺酸、異亮氨酸。

2.2 日本醫(yī)蛭抗凝活性成分

日本醫(yī)蛭具有非常強的抗血小板聚集及抗凝血作用，藥效遠大于《中國藥典》收載的螞蟥以及柳葉螞蟥[36]。李文等[37]通過體外抗血小板聚集與抗凝血實驗，對包含日本醫(yī)蛭在內的7種水蛭進行測定，結果表明日本醫(yī)蛭不同于其它水蛭，在體外抗血小板聚集與抗凝血均具有顯著的作用。姚楠等[38]研究了日本醫(yī)蛭不同萃取部位的抗凝活性，結果表明日本醫(yī)蛭低極性小分子具有抗凝活性。黃仁槐等[39]以日本醫(yī)蛭嗉囊消化液為原料，分離出了水蛭素，并分析了其具有較高的抗凝血酶活性。李友賓等[40]采用凝血酶滴定法對鮮品及干品日本醫(yī)蛭凝血酶活性分別進行測定，發(fā)現(xiàn)日本醫(yī)蛭生藥抗凝血活性極高，鮮品較干品而言，抗凝活性高出一半。吳志軍等[41]研究結果表明日本醫(yī)蛭在抗凝血酶、抗胰蛋白酶和抗糜蛋白酶生物活性方面，高于歐洲醫(yī)蛭、菲牛蛭、寬體金線蛭。蘇斌等[42]對水蛭標準品的建立進行了探索，采用基于血液凝固分析儀測定纖維蛋白原-凝血酶時間的水蛭生物活性測定方法，分別就基原為螞蟥和日本醫(yī)蛭的水蛭建立反應體系，定義并測得水蛭標準品效價，結果顯示該方法能區(qū)分和量化不同批次水蛭的效價，可用于控制水蛭的質量。

水蛭素為日本醫(yī)蛭中的主要活性物質，受pH、溫度、有機溶劑等多因素的影響，而中藥制劑傳統(tǒng)的炮制方法及常規(guī)使用的加溫滅菌方法對醫(yī)蛭活性效價有一定的影響[43]。劉文偉等[44]比較了日本醫(yī)蛭和寬體金線蛭在不同提取工藝處理后的抗凝血酶活性，結果表明未經(jīng)高溫處理的日本醫(yī)蛭有非常強的體外抗凝作用，而傳統(tǒng)的炮制法破壞了其中的水蛭素，從而使抗凝作用減弱。張漢貞等[43]以水蛭素為指標，對日本醫(yī)蛭鈷60-γ射線輻射滅菌前后抗凝活性進行比較研究，發(fā)現(xiàn)經(jīng)鈷60-γ射線輻射后不影響其活性效價，是一種有效可行的滅菌方法。除了水蛭素外，日本醫(yī)蛭中含有多種抗凝血活性蛋白質或多肽，貴艷麗[45]設計并制備了一種仿生親和介質來篩選日本醫(yī)蛭中的活性蛋白，并對純化出的蛋白進行抗凝活性分析，從中篩選出了一種具有很高的開發(fā)研究價值的新型抗凝血活性蛋白，命名為NLP-1（New Leech Protein-1）。武建卓[46]采用可控酶解、超濾、瓊脂糖離子交換層析等生物制藥技術對日本醫(yī)蛭樣品進行純化，得到純度高、生物活性強的低分子量水蛭抗凝血肽（HAP），含量達53.3%。

3 日本醫(yī)蛭醫(yī)用和藥用實踐

鑒于日本醫(yī)蛭極強的特異性抗凝血作用，在醫(yī)用及藥用實踐方面可見諸多報道。張德宗等[47]自1978年開始應用活體日本醫(yī)蛭清除治療斷指再植術后淤血，結果顯示效果良好。彭建強等[48,49]利用醫(yī)蛭吸血法處理大白鼠下腹部淤血島狀皮瓣，證明此種方法能有效解除大白鼠組織靜脈淤血，并且認為可將此法應用在吻合血管皮瓣移植或斷指再植術后靜脈淤血不適合手術探查的患者。在5例患有靜脈淤血的6指斷指再植患者和1例皮膚撕脫傷患者中應用日本醫(yī)蛭，利用其吸血的習性緩解了患者靜脈淤血狀況，促進了血液循環(huán)，有助于手術獲得成功[50]。劉坤[51]在1996-2004年利用醫(yī)蛭在輔助治療18例耳廓撕脫和耳廓部分撕脫傷的過程中也取得了很好的療效。林宏偉等[52]采用皮瓣、皮片聯(lián)合回植結合活體醫(yī)蛭吸血治療肢體大面積皮膚撕脫傷25例29肢，結果顯示療效較好，值得臨床推廣。

明確日本醫(yī)蛭藥材直接入藥的藥包括脈血康膠囊[8]，由日本醫(yī)蛭經(jīng)適宜的加工制成的腸溶膠囊，主治破血、逐瘀、通脈止痛。大黃蟄蟲丸由包含日本醫(yī)蛭在內的12種中藥組成，Zhang等[53]通過體內體外實驗均證明它能夠抑制血管平滑肌細胞增殖，并進一步采用血清藥理學方法探討了大黃蟄蟲丸抑制血管平滑肌細胞增殖的分子生物學機理，為更好地理解大黃蟄蟲丸在治療動脈粥樣硬化的作用機理提供依據(jù)。

4 日本醫(yī)蛭資源人工養(yǎng)殖研究

日本醫(yī)蛭在中國南北方廣大水田地區(qū)曾經(jīng)廣泛分布，近幾年由于人們大肆濫捕、環(huán)境惡化及棲息地的急劇縮減，野生醫(yī)蛭資源遭到嚴重破壞，種群數(shù)量銳減。開展規(guī)?；娜斯ゐB(yǎng)殖對日本醫(yī)蛭物種資源保護及滿足藥用水蛭市場強烈需求均具有十分重要的意義。然而，日本醫(yī)蛭養(yǎng)殖方面的報道資料極其有限，絕大部分人工養(yǎng)殖工作均由重慶市中藥研究院完成。羅媛媛等[54]研究報道了人工養(yǎng)殖條件下日本醫(yī)蛭耗氧量與體質量呈極顯著的線性回歸關系，為人工養(yǎng)殖合理安排養(yǎng)殖密度提供理論依據(jù)。陳仕江等[55,56]采用光合細菌制劑（Photosynthetic Bacteria，PSB）處理日本醫(yī)蛭養(yǎng)殖水體，結果表明采用PSB制劑能明顯降低日本醫(yī)蛭養(yǎng)殖水體中的化學需氧量、含氮化合物、有機物，增加水體中的溶氧，有效凈化養(yǎng)殖水體。金仕勇等[57]對比分析了濾篩網(wǎng)粘結于飼養(yǎng)箱體、香柏油、香茅醛等化學試劑阻止日本醫(yī)蛭逃逸效果，結果表明采用濾篩網(wǎng)（80-100目）粘結于飼養(yǎng)箱體的方法防逃逸效果最佳，同時對醫(yī)蛭的傷害最小。金仕勇等[58,59]對日本醫(yī)蛭快速生長以及適合飼養(yǎng)密度的研究表明，提高養(yǎng)殖溫度，打破日本醫(yī)蛭冬眠對醫(yī)蛭取食影響較小，對其體質量增加有明顯促進作用，但對其繁殖有一定的抑制，通過對不同放養(yǎng)密度的日本醫(yī)蛭飼養(yǎng)試驗表明，日本醫(yī)蛭適宜的養(yǎng)殖密度區(qū)間為80-120頭/m2，飼料系數(shù)3.8-4.8。石萍等[60]對全人工繁殖的日本醫(yī)蛭繁殖性能進行了研究，對醫(yī)蛭產(chǎn)繭數(shù)、卵繭質量、幼蛭孵化數(shù)，以及親蛭質量、親蛭密度對水蛭繁殖性能的影響進行了分析，結果表明日本醫(yī)蛭繁殖性能低下，親蛭質量、密度以及卵繭質量與水蛭的繁殖性能有顯著相關性。

5 日本醫(yī)蛭產(chǎn)業(yè)發(fā)展存在的問題及對策

5.1 日本醫(yī)蛭資源摸底及遺傳多樣性研究

近幾年由于環(huán)境惡化、人為過度捕撈以及棲息地的急劇縮減，造成日本醫(yī)蛭資源的日益枯竭，種質資源多樣性遭遇嚴重危機。曾經(jīng)在全國廣泛分布的日本醫(yī)蛭資源目前已經(jīng)極少能見到。日本醫(yī)蛭種質資源是現(xiàn)在及未來醫(yī)蛭及水蛭產(chǎn)業(yè)發(fā)展和創(chuàng)新的基礎和源泉，有價值的素材和資源一旦缺失就很難再找回來。因此開展現(xiàn)有野生日本醫(yī)蛭資源摸底調查及種質資源遺傳多樣性的研究，對于準確分析日本醫(yī)蛭時空變化趨勢，提出科學利用和有效保護的對策與建議、推進醫(yī)蛭科學發(fā)展具有重大意義。

5.2 日本醫(yī)蛭大規(guī)模人工養(yǎng)殖工作開展

中醫(yī)藥事業(yè)的長足發(fā)展難以建立在貧乏、瀕危物種上，而人工養(yǎng)殖作為既能永續(xù)利用天然資源又能有效保護野生資源的直接有效方法，理應大力推廣及提倡。在目前日本醫(yī)蛭養(yǎng)殖尚未形成規(guī)?；拇蟊尘跋?，應該集合多學科的技術優(yōu)勢，對日本醫(yī)蛭的養(yǎng)殖、繁殖及病害防治等方面進行攻關，建立工廠集約化日本醫(yī)蛭養(yǎng)殖基地，開展大規(guī)模人工養(yǎng)殖工作。

5.3 強化水蛭藥材監(jiān)管力度，大力完善日本醫(yī)蛭及水蛭藥材的鑒定體系

根據(jù)本課題組在前期對水蛭藥材市場的調查以及其它文獻報道，發(fā)現(xiàn)藥材市場的水蛭藥材種類繁多，其中不乏藥典未收載的水蛭品種，給水蛭藥材市場良性發(fā)展及人民群眾健康用藥帶來極大的紊亂及潛在風險，原因是由于中國蛭綱動物種類多、干品差異小，魚目混珠的現(xiàn)象時有發(fā)生。目前判斷水蛭藥材真?zhèn)蔚暮暧^標準以及分子鑒定方面研究工作雖有部分報道，但仍不深入、不細致，難以運用到實際的市場檢測中。因此，必須加強水蛭市場的監(jiān)管力度，大力研發(fā)水蛭藥材及相關中成藥的綜合細微鑒別體系。

5.4 水蛭藥材名稱規(guī)范化及差別化

《中國藥典》收錄的水蛭藥材包括3個品種，即日本醫(yī)蛭、寬體金線蛭、尖細金線蛭，在臨床研究及試驗、藥企生產(chǎn)水蛭相關藥材及藥品時，通常統(tǒng)一稱之為水蛭，而日本醫(yī)蛭在中國藥典中又稱為“水蛭”，因此極易混淆，加上《中國藥典》收載的3種水蛭在藥效上相去甚遠。這些均給科學研究、品質界定、給藥劑量濃度及藥效評價等方面帶來極大難度。建議：①《中國藥典》在今后的修訂過程中，應該給予特別的區(qū)分和規(guī)范化，可以按照《中國動物志》的標準名稱，將“水蛭”改為日本醫(yī)蛭，“螞蝗”改為寬體金線蛭，“柳葉螞蟥”改為尖細金線蛭；②藥企在生產(chǎn)水蛭藥材及相關產(chǎn)品時，應該備注說明具體的水蛭藥材品種。保證中國這類經(jīng)典的活血化瘀藥材的可持續(xù)保護和利用。

5.5 日本醫(yī)蛭有望填補中國醫(yī)用水蛭空白

歐洲醫(yī)蛭在國外廣泛應用于外科手術及美容手術中[61]?；谌毡踞t(yī)蛭在我國外科手術中的獨特優(yōu)勢，以及FDA批準歐洲醫(yī)蛭作為整形外科手術醫(yī)療器械的契機和提示[62,63]，理應將我國中藥中有悠久應用歷史的吸血水蛭-日本醫(yī)蛭作為醫(yī)療器械并加以推廣應用。

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A Research Progress and the Prospective of Hirudo Nipponica

Shi Ping, Lu Zenghui, Zeng Wei, Chen Shijiang
(Chongqing Academy of Chinese Materia Medica, Chongqing 400065, China)

Hirudo nipponica Whitman, a Chinese medicine which has a strong effect on platelet aggregation and antithrombin activity, is involved in the studies. The current situation is adverse to the cultivation, development and utilization of H. nipponica. Prior to summarizing the current research status and the unresolved problems and the prospective of H. nipponica, domestic and foreign literatures over the H. nipponica was discussed and judged, aiming at providing a reference for the comprehensive development and utilization of H. nipponica.

Chinese materia medica, Hirudo nipponica, artificial culture, anticoagulant activity

10.11842/wst.2016.11.028

R28

A

（責任編輯：朱黎婷，責任譯審：朱黎婷）

2016-03-06

修回日期：2016-08-26

＊ 重慶市科委應用開發(fā)計劃項目（cstc2013yykfA00002）：水蛭-藕-魚生態(tài)高效養(yǎng)殖技術研究，負責人：陳仕江；重慶市衛(wèi)生和計生委中醫(yī)藥科技項目（zy201402130）：水蛭腸道微生物區(qū)系及條件致病菌初步研究，負責人：魯增輝；重慶市南岸區(qū)科委科技攻關項目（2015-18-23）：日本醫(yī)蛭循環(huán)水工廠化養(yǎng)殖技術研究，負責人：魯增輝；重慶市衛(wèi)生計生委中醫(yī)藥科技項目（zy201602097）：日本醫(yī)蛭水蛭素生產(chǎn)技術的研究，負責人：石萍。

＊＊ 通訊作者：陳仕江，研究員，主要研究方向：中藥資源繁育研究。