羅荔敏，鄢良春，華 樺，祝勇軍，胡 美，趙軍寧＊

（1.華潤三九（雅安）藥業(yè)有限公司 雅安 625000；2.四川省中醫(yī)藥科學(xué)院中藥藥理毒理研究所/國家中醫(yī)藥管理局中藥質(zhì)量生物評價重點研究室/四川省道地藥材系統(tǒng)開發(fā)工程技術(shù)研究中心/中藥品質(zhì)評價與創(chuàng)新中藥研究四川省重點實驗室 成都 610041）

Microtox技術(shù)應(yīng)用于生脈注射液綜合毒性檢測＊

羅荔敏1＊＊，鄢良春2＊＊，華 樺2，祝勇軍1，胡 美1，趙軍寧2＊＊＊

（1.華潤三九（雅安）藥業(yè)有限公司 雅安 625000；2.四川省中醫(yī)藥科學(xué)院中藥藥理毒理研究所/國家中醫(yī)藥管理局中藥質(zhì)量生物評價重點研究室/四川省道地藥材系統(tǒng)開發(fā)工程技術(shù)研究中心/中藥品質(zhì)評價與創(chuàng)新中藥研究四川省重點實驗室 成都 610041）

目的：探索-Microtox技術(shù)應(yīng)用于生脈注射液綜合毒性檢測。方法：以費氏弧菌為測試菌種，通過方法學(xué)考察確定最優(yōu)檢測體系及方法學(xué)可靠性；在最優(yōu)檢測體系條件下，首次以費氏弧菌對不同生產(chǎn)廠家所生產(chǎn)的生脈注射液進行發(fā)光菌綜合毒性檢測。結(jié)果：2 mL反應(yīng)體系下，最優(yōu)復(fù)蘇液體積0.9 mL/支菌，每個待測樣品加入最優(yōu)菌液體積50 μL，最優(yōu)檢測時間10 min，最優(yōu)pH范圍5-10，且10 min發(fā)光強度以80-120萬為宜；重復(fù)性試驗、中間精密度試驗的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均＜15%；不同生產(chǎn)廠家A、B、C成品的EC50平均值分別為22.10%、34.10%、46.04%，具有極顯著性差異（P＜0.01）。結(jié)論：生脈注射液對費氏弧菌的毒性存在顯著的濃度-效應(yīng)關(guān)系，且不同生產(chǎn)廠家之間成品EC50值具有顯著性差異，提示我們生脈注射液成品生物學(xué)檢測標(biāo)準(zhǔn)存在進一步提升的空間，應(yīng)用Microtox技術(shù)檢測生脈射液綜合毒性并用于控制不同廠家成品質(zhì)量波動具有很好的應(yīng)用前景。

Microtox技術(shù) 發(fā)光細菌 生脈注射液 綜合毒性

生脈散出自李東垣的《內(nèi)外傷辯感論》，生脈散注射液由中醫(yī)經(jīng)典古方生脈散發(fā)展而來，以紅參、麥冬、五味子入藥，具有益氣養(yǎng)陰、復(fù)脈固脫等功效[1]，臨床主要用于治療心悸、氣短、冠心病、心絞痛、感染性休克、流行性出血熱、心律失常等。但該藥不良反應(yīng)問題較為明顯，是2013-2015年國家藥品不良反應(yīng)中心ADR發(fā)生率排名前10的品種，以全身損害為主，且多為變態(tài)反應(yīng)[2,3]。

趙軍寧等[3]于2010年在新型中藥質(zhì)量控制模式的思路與方法——“功效-毒性-物質(zhì)”的基礎(chǔ)上，結(jié)合傳統(tǒng)中藥功能主治與現(xiàn)代化藥理、毒理及藥物化學(xué)研究成果，建立了新型多指標(biāo)質(zhì)量控制與評價的方法體系。本研究探索將Microtox技術(shù)運用于生脈注射液綜合毒性評價，為輔助該品種質(zhì)量控制提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗藥物

生脈注射液，呈淡黃色或淡黃棕色的澄明液體，來自A、B、C 3家藥企成品，各廠家選3個批次。

1.2 菌種

北京濱松光子技術(shù)股份有限公司費氏弧菌凍干粉試劑盒（CS234，批號：D15D006-D15D023），-20℃避光保存。

1.3 試劑與儀器

費氏弧菌復(fù)蘇稀釋液，費氏弧菌滲透壓調(diào)節(jié)液（北京濱松光子技術(shù)股份有限公司，批號：20150820），純化水。發(fā)光菌測試儀（北京濱松光子技術(shù)股份有限公司，型號：BHP9514）。

1.4 方法

1.4.1 測定發(fā)光強度的方法

從冰箱取出費氏弧菌凍干粉1支（-20℃保存），室溫（18-25℃）先平衡15 min，后加入0.9 mL復(fù)蘇液，于室溫下放置10 min后，此為測試用菌液。根據(jù)預(yù)實驗結(jié)果先將待測樣品用純化水稀釋至合適的濃度后，再用滲透壓調(diào)節(jié)液（17：3）混勻，此為待測樣品溶液。每次試驗均采用復(fù)蘇稀釋液作為空白對照。每支測試管中放入2 mL待測樣品或空白對照液，分別向各測試管中加入50 μL測試菌液，輕輕震蕩混勻，室溫放置10 min后用濱松發(fā)光菌測試儀讀取各管發(fā)光強度值。

1.4.2 方法學(xué)考察

（1）測定方法影響因素考察

復(fù)蘇液體積、加入菌液體積及時間對空白對照管初始發(fā)光強度值的影響：向平衡后的費氏弧菌凍干粉中分別加入0.5、0.6、0.7、0.8、0.9 mL復(fù)蘇液進行復(fù)蘇，10 min后分別取每個復(fù)蘇液體積下的菌液20、30、40、50、60 μL至裝有2 mL稀釋液的空白對照管中，輕輕震蕩從混勻開始計時，每2 min測定1次發(fā)光強度值，比較不同復(fù)蘇液體積、不同菌液加入量及不同測定時間對空白對照管初始發(fā)光強度值的影響。

時間對不同濃度待測樣品發(fā)光強度值的影響：向待測管中加入2 mL不同濃度下待測樣品溶液，后用移液器加入最優(yōu)復(fù)蘇參數(shù)條件下測試菌液，輕輕震蕩從混勻開始計時，每2 min測定1次發(fā)光強度值，比較不同濃度待測樣品發(fā)光強度值隨時間的變化情況。

pH對發(fā)光強度的影響：用NaOH溶液或HCl溶液與復(fù)蘇稀釋液以適宜的比例混合混合，配制pH為1、2、4、5、8、10、11、12、14的復(fù)蘇稀釋液；分別取上述復(fù)蘇稀釋液2 mL于測試管中，加入50 μL測試菌液，輕輕震蕩使之充分混勻開始計時，每2 min測定1次發(fā)光強度值，比較pH對發(fā)光強度的影響。

（2）精密度考察

重復(fù)性考察：以1.4.1的方法對不同廠家各個批次的生脈注射液成品進行檢測，每批樣品平行3次試驗，對結(jié)果進行分析。

中間精密度考察：①不同人員：以1.4.1的方法由不同的實驗員在同一個工作日對同一批生脈注射液成品進行檢測，對結(jié)果進行分析；②不同工作日：由相同的實驗員在不同工作日對同一批生脈注射液成品進行檢測，對結(jié)果進行分析。

1.4.3 采用費氏弧菌對生脈注射液進行綜合毒性評價

按照1.4.1的方法，對不同廠家各個批次的生脈注射液成品進行發(fā)光強度檢測并計算抑制率和半數(shù)抑制濃度（EC50值），根據(jù)EC50值對比各樣品的綜合毒性大小（EC50值與各樣品綜合毒性成負相關(guān)）。

1.4.4 數(shù)據(jù)處理和毒性評價

抑制率計算公式為

采用Excel對數(shù)模型擬合并繪制濃度-抑制率曲線，根據(jù)曲線擬合公式計算樣品的EC50值（半數(shù)抑制濃度），以EC50值表征生脈注射液綜合毒性的大小，并對數(shù)據(jù)進行處理和統(tǒng)計分析。

1.4.5 統(tǒng)計學(xué)方法

運用Excel軟件先進行F-TEST方差齊性檢驗，后進行T-TEST雙尾等方差檢驗。P＞0.05無顯著性差異，P＜0.05有顯著性差異。P＜0.01有極顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 影響因素考察

復(fù)蘇液體積、加入菌液體積及時間對空白對照管初始發(fā)光強度值的影響：由圖1可見，固定加入菌液體積，復(fù)蘇液體積不同會造成初始發(fā)光強度值隨時間的走勢不同，隨復(fù)蘇液體積增大初始發(fā)光強度值呈現(xiàn)先增高后降低趨勢；固定復(fù)蘇液體積，所加菌液體積不同會造成初始發(fā)光強度值隨時間的走勢不同，隨所加菌液體積增大初始發(fā)光強度值亦呈現(xiàn)先增高后降低趨勢；結(jié)合上述試驗結(jié)果為減小試驗誤差同時考慮成本問題，選取最優(yōu)復(fù)蘇液體積0.9 mL，每管加菌液體積50 μL，10-30 min內(nèi)發(fā)光強度值基本沒有太大變化可用于試驗測定（初始發(fā)光強度值在80-120萬之間為宜）。

2.1.1 時間對不同濃度待測樣品發(fā)光強度值的影響

由圖2可見，不同濃度的生脈注射液對費氏弧菌初試發(fā)光強度值的影響不同，低濃度促進發(fā)光，高濃度抑制發(fā)光，且中間濃度抑制率在15 min左右開始發(fā)生衰減。綜合空白對照管的結(jié)果，設(shè)定生脈注射液-費氏弧菌綜合毒性評價體系參數(shù)為：復(fù)蘇液0.9 mL，每管加入菌液50 μL，最優(yōu)檢測時間10 min。

圖1 復(fù)蘇液體積、加入菌液體積及時間對空白對照管初始發(fā)光強度值的影響（n=3）

圖2 時間對不同濃度待測樣品發(fā)光強度值的影響（n=3）

2.1.2 pH對發(fā)光強度的影響

由圖3可見，待測樣品溶液pH在5-10時對發(fā)光強度值的影響較?。ā?0%）。

2.2 精密度考察

重復(fù)性：根據(jù)表1可見，重復(fù)性試驗的相對偏差＜15%。

中間精密度：根據(jù)表2可見，中間精密度試驗的相對偏差＜15%。

2.3 不同廠家生脈注射液綜合毒性比較

由表3和圖4可見，不同生產(chǎn)廠家A、B、C的生脈注射液成品EC50值差異較大（P＜0.01），具有極顯著性差異。

圖3 pH對發(fā)光強度的影響（n=3）

表1 3批生脈注射液成品重復(fù)性試驗

表2 中間精密度試驗試驗

表3 不同廠家生脈注射液成品生物綜合毒性結(jié)果

3 討論

3.1 Microtox技術(shù)綜合毒性評價體系

利用發(fā)光菌生理上的獨特性，Microtox技術(shù)根據(jù)發(fā)光強度的變化檢測生物毒性，也是目前GB/ T 15441-1995和ISO11348認證的急性毒理測試方法。細菌有很多種類，但是他們的發(fā)光原理是相同的，都是酶促氧化反應(yīng)。一般主要有熒光素酶、FMN、NAD（P）H、長鏈脂肪醛（RCHO）、分子氧等物質(zhì)參與發(fā)光反應(yīng)。在正常的生理條件下發(fā)光菌能發(fā)出波長在450-490 nm的藍綠色可見光，發(fā)光強度在特定試驗條件下是恒定的；發(fā)光強度在接觸外來受試物時會發(fā)生變化，外來受試物抑制細菌發(fā)光主要通過2個途徑：①直接抑制酶類參與發(fā)光反應(yīng)的活性；②抑制與發(fā)光反應(yīng)有關(guān)的細胞內(nèi)代謝過程。原理圖如圖5所示[4]。

該技術(shù)評價體系優(yōu)點如下：①發(fā)光菌具有同高等生物類似的物理化學(xué)性質(zhì)和酶作用過程特點，模擬性強，是一種綜合性的毒性檢測方法；②該方法為國際公認的客觀可靠的方法，且方法簡單，便于操作，重復(fù)性好；③反應(yīng)靈敏度高，比一般生物反應(yīng)細胞靈敏幾個數(shù)量級；④可以同時獲得多個定量參數(shù)，EC50、標(biāo)準(zhǔn)毒物參比值、毒性劑量-效應(yīng)動力曲線等多個定量參數(shù)的測定，綜合表征上述注射劑毒性特點[5-13]。

3.2 生脈注射液對發(fā)光菌的綜合毒性

本文首次應(yīng)用一種Microtox技術(shù)方法測定生脈注射液綜合毒性，選取費氏弧菌作為發(fā)光菌測試菌種，考察并建立其生物綜合毒性評價體系，確定最優(yōu)復(fù)蘇液體積為0.9 mL，最優(yōu)菌液加入量為50 μL，最優(yōu)檢測時間10 min，最優(yōu)pH范圍5-10，且10 min時空白對照發(fā)光強度以80-120萬為宜。重復(fù)性和中間精密度在此方法體系下較為良好，RSD＜15%，方法穩(wěn)定性好。從研究結(jié)果分析，生脈注射液對費氏弧菌的毒性存在顯著的濃度-效應(yīng)關(guān)系，且不同生產(chǎn)廠家之間成品EC50值具有顯著性差異，提示我們生脈注射液成品生物學(xué)檢測標(biāo)準(zhǔn)存在進一步提升的空間，應(yīng)用Microtox技術(shù)檢測參生脈射液綜合毒性并用于控制不同廠家成品質(zhì)量波動具有很好的應(yīng)用前景。

圖4 不同廠家生脈注射液成品生物綜合毒性結(jié)果

圖5 發(fā)光菌發(fā)光代謝過程和原理圖

1 張珊珊,魏德建.生脈注射液治療缺血性中風(fēng)急性期隨機對照實驗的系統(tǒng)評價更新.中國中醫(yī)急癥,2013,22(5)：696-697.

2 黃培芬.生脈注射液臨床應(yīng)用及不良反應(yīng)的文獻研究.中國民族民間醫(yī)藥,2015(6)：97-98.

3 焦文斌.淺談生脈注射液的不良反應(yīng)及產(chǎn)生原因.當(dāng)代醫(yī)藥論叢,2014,12(5)：253.

4 Meighen E A. Molecular biology of bacterial bioluminescence. Microbiol Rev, 1991, 55(1)：123-142.

5 趙軍寧,鄢良春.基于Microtox技術(shù)（微毒測試）的中藥綜合毒性快速評價.世界中醫(yī)藥,2014,9(2)：137-144.

6 趙軍寧,鄢良春,鄭曉秋.一種快速檢測中藥注射劑綜合毒性的生物測試方法.中國：ZL201310210195.8,2016-09-06.

7 趙軍寧,鄢良春,朱雅寧,等.一種快速檢測紅花注射液綜合毒性的生物測試方法.中國：ZL201410113782.X,2016-08-17.

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9 李孝容,華樺,鄢良春,等.蒼耳子微毒測試(Microtox)與小鼠急性毒性的相關(guān)性研究.中藥藥理與臨床,2016,32(2)：134-138.

10 夏見英,華樺,鄢良春,等.基于Microtox技術(shù)快速檢測蒼耳子藥材及其飲片、成方制劑毒性變化規(guī)律.中藥藥理與臨床,2016,32(2)：151-154.

11 熊靜悅,李孝容,鄢良春,等. Microtox中藥注射劑微毒測試體系明亮發(fā)光桿菌502和青海弧菌Q67發(fā)光反應(yīng)條件的比較研究.中藥藥理與臨床,2016,32(2)：227-230.

12 鄭曉秋,鄢良春,趙軍寧,等.應(yīng)用Microtox 技術(shù)檢測魚腥草注射液綜合毒性的研究.中藥藥理與臨床,2013,29(6)：92-95.

13 熊靜悅,李孝容,鄢良春,等.基于Microtox技術(shù)的中藥注射劑微毒快速測試體系反應(yīng)條件的優(yōu)化與方法學(xué)的考察.中國中藥雜志,2016,41(9)：1622-1626.

Application of Microtox-Based Fast Test to the Evaluation of Comprehensive Toxicity of Sheng Mai Injection

Luo Limin1, Yan Liangchun1, Hua Hua2, Zhu Yongjun1, Hu Mei1, Zhao Junning2
(1. China Resources 999 Pharmaceutical Co., Ltd. (Ya'an), Ya'an 625000, China; 2. Sichuan Academy of Chinese Medicine Sciences, Chengdu 610041, China)

This study aimed at exploring the application of microtox technology to the evaluation of comprehensive toxicity of Sheng Mai injections. Characteristic parameters of vibrio fischeri (CS234) were measured by methodology inspection under different conditions to optimize the reaction condition with reliable technology. It was the first experiment to accomplish the comprehensive toxicity of Sheng Mai injections from various manufacturers using vibrio fischeri under the target condition. It was found that parameters of the optimum condition contained 0.9 mL recovery liquid volume in each freeze-dried vial and 50 μL bacteria suspension of each sample, being included in 2 mL solution in aggregate under 10 mins' detection time after adding bacteria suspension with the favorable pH value ranging from 5 to 10 and luminous intensity from 0.8 to 1.2 million within 10 mins. The relative standard deviation values of replication experiment and precision test were all below 15%. Under this optimum detection condition, it was found that the EC50 values were 22.10%, 34.10% and 46.04%, respectively, presenting significant statistical differences (P＜0.05). These results demonstrated that the growth of biological detection standards of Sheng Mai injection was highlighted a long way to go. Besides, the microtoxbased fast test for the evaluation of the comprehensive toxicity of Sheng Mai injection showed a prospective application to controlling the quality of different products from manufacturers.

Microtox technology, bacteria growth inhibition, Sheng Mai injection, comprehensive toxicity

10.11842/wst.2016.11.018

R285

A

（責(zé)任編輯：朱黎婷，責(zé)任譯審：朱黎婷）

2016-11-15

修回日期：2016-11-30

＊ 科學(xué)技術(shù)部“重大新藥創(chuàng)制”科技重大專項項目（2015ZX09501004-001-005）：基于Microtox（微毒）測試的中藥安全性快速檢測、質(zhì)量控制與風(fēng)險預(yù)警新技術(shù)研究，負責(zé)人：趙軍寧；國家自然科學(xué)基金委面上項目（81470180）：基于Microtox技術(shù)的中藥毒性分級原理與標(biāo)準(zhǔn)研究，負責(zé)人：趙軍寧；國家中醫(yī)藥管理局國家公益性行業(yè)科研專項（201507004）：與臨床病癥相關(guān)的確有療效常用中藥炮制技術(shù)與配伍減“毒”研究——蒼耳子，負責(zé)人：華樺；四川省科技廳科技支撐計劃項目（2014SZ0139）：益母草注射液、三七通舒膠囊等已上市中成藥大品種的二次開發(fā)-中藥大品種生脈注射液二次開發(fā)研究，負責(zé)人：朱雅寧。

＊＊ 羅荔敏、鄢良春為共同第一作者。

＊＊＊ 通訊作者：趙軍寧，本刊編委，研究員，博士，博士生導(dǎo)師，主要研究方向：中藥藥理學(xué)、中藥質(zhì)量生物控制、道地藥材與民族藥系統(tǒng)研究開發(fā)等。