趙炳祥，羅荔敏，鄢良春，華 樺，胡 美，趙軍寧＊＊＊

（1.華潤三九（雅安）藥業(yè)有限公司 雅安 625000；2.四川省中醫(yī)藥科學院中藥藥理毒理研究所/國家中醫(yī)藥管理局中藥質(zhì)量生物評價重點研究室/四川省道地藥材系統(tǒng)開發(fā)工程技術(shù)研究中心/中藥品質(zhì)評價與創(chuàng)新中藥研究四川省重點實驗室 成都 610041）

Microtox技術(shù)應(yīng)用于參麥注射液綜合毒性檢測＊

趙炳祥1＊＊，羅荔敏1＊＊，鄢良春2，華 樺2，胡 美1，趙軍寧2＊＊＊

（1.華潤三九（雅安）藥業(yè)有限公司 雅安 625000；2.四川省中醫(yī)藥科學院中藥藥理毒理研究所/國家中醫(yī)藥管理局中藥質(zhì)量生物評價重點研究室/四川省道地藥材系統(tǒng)開發(fā)工程技術(shù)研究中心/中藥品質(zhì)評價與創(chuàng)新中藥研究四川省重點實驗室 成都 610041）

目的：開發(fā)一項新的檢測技術(shù)——Microtox技術(shù)，以用于參麥注射液的綜合毒性檢測。方法：以費氏弧菌為測試菌種，通過方法學考察確定最優(yōu)檢測體系及方法學可靠性；在最優(yōu)檢測體系條件下，首次以費氏弧菌對不同生產(chǎn)廠家所生產(chǎn)的參麥注射液進行發(fā)光菌綜合毒性檢測。結(jié)果：在2 mL反應(yīng)體系下，最優(yōu)復蘇液體積0.9 mL/支菌，每個待測樣品加入最優(yōu)菌液體積50 μL，最優(yōu)檢測時間為10 min，最優(yōu)pH范圍為5-10，且10 min發(fā)光強度以80-120萬為宜；重復性試驗、中間精密度試驗的相對標準偏差均＜15%；不同生產(chǎn)廠家A、B、C成品的EC50平均值分別為35.60%、92.34%、146.57%，具有極顯著性差異（P＜0.01）。結(jié)論：參麥注射液對費氏弧菌的毒性存在顯著的濃度-效應(yīng)關(guān)系，且不同生產(chǎn)廠家之間成品EC50值具有顯著性差異，提示參麥注射液成品生物學檢測標準存在進一步提升的空間，應(yīng)用Microtox技術(shù)檢測參麥注射液綜合毒性并用于控制不同廠家成品質(zhì)量波動具有很好的應(yīng)用前景。

Microtox技術(shù) 發(fā)光細菌 參麥注射液 綜合毒性

參麥注射液是在古方“生脈散”的基礎(chǔ)上運用現(xiàn)代化提取技術(shù)手段改劑型而成的中藥注射劑，由紅參、麥冬2味藥材組成；功能主治為益氣固脫、養(yǎng)陰生津，用于治療氣陰兩虛型休克、冠心病、病毒性心肌炎、慢性肺心病、粒細胞減少癥，與化療藥物連用具有減毒增效的作用。近年來，隨著臨床應(yīng)用的不斷普及，不良反應(yīng)發(fā)生率高居不下，是2013-2015年國家藥品不良反應(yīng)中心ADR發(fā)生率排名前10品種。使用參麥注射液的不良反應(yīng)主要為：胸悶、畏寒、心悸、發(fā)熱潮紅、過敏樣反應(yīng)、皮疹等癥狀[1-3]。參麥注射液現(xiàn)共有7家生產(chǎn)企業(yè)，33個批準文號。

趙軍寧等[3]于2010年在新型中藥質(zhì)量控制模式的思路與方法——“功效-毒性-物質(zhì)”；在此基礎(chǔ)上，結(jié)合傳統(tǒng)中藥功能主治與現(xiàn)代化藥理、毒理及藥物化學研究成果，建立了新型多指標質(zhì)量控制與評價的方法體系。本研究探索將Microtox技術(shù)運用于參麥注射液綜合毒性評價，為輔助該品種質(zhì)量控制提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗藥物

參麥注射液，微黃色至淡棕色的澄明液體（來自A、B、C共3家藥企成品，各3批次）。

1.2 菌種

北京濱松光子技術(shù)股份有限公司費氏弧菌凍 干 粉 試 劑 盒（菌 種CS234，批 號：D15A005-D15A025），-20℃避光保存。

1.3 試劑與儀器

費氏弧菌復蘇稀釋液，費氏弧菌滲透壓調(diào)節(jié)液（北京濱松光子技術(shù)股份有限公司，批號：20150820），純化水。發(fā)光菌測試儀（北京濱松光子技術(shù)股份有限公司，型號：BHP9514）。

1.4 方法

1.4.1 測定發(fā)光強度的方法

從冰箱取出費氏弧菌凍干粉1支（-20℃保存），室溫（18-25℃）先平衡15 min，后加入0.9 mL復蘇液，于室溫下放置10 min后，此為測試用菌液。根據(jù)預(yù)實驗結(jié)果先將待測樣品用純化水稀釋至合適的濃度后，再用滲透壓調(diào)節(jié)液（17：3）混勻，此為待測樣品溶液。每次試驗均采用復蘇稀釋液作為空白對照。每支測試管中放入2 mL待測樣品或空白對照液，分別向各測試管中加入50 μL測試菌液，輕輕震蕩混勻，室溫放置10 min后用濱松發(fā)光菌測試儀讀取各管發(fā)光強度值。

1.4.2 方法學考察

（1）測定方法影響因素考察

復蘇液體積、加入菌液體積及時間對空白對照管初始發(fā)光強度值的影響：向平衡后的費氏弧菌凍干粉中分別加入0.5、0.6、0.7、0.8、0.9 mL復蘇液進行復蘇，10 min后分別取每個復蘇液體積下的菌液20、30、40、50、60 μL至裝有2 mL稀釋液的空白對照管中，輕輕震蕩3-4次混勻后開始計時，每2 min測定1次發(fā)光強度值，比較不同復蘇液體積、不同菌液加入量及不同測定時間對空白對照管初始發(fā)光強度值的影響。

時間對不同濃度待測樣品發(fā)光強度值的影響：向待測管中加入2 mL不同濃度下待測樣品溶液，后用移液器加入最優(yōu)復蘇參數(shù)條件下測試菌液，輕輕震蕩從混勻開始計時，每2 min測定1次發(fā)光強度值，比較不同濃度待測樣品發(fā)光強度值隨時間的變化情況。

pH對發(fā)光強度的影響：用NaOH溶液或HCl溶液與復蘇稀釋液以適宜的比例混合混合，配制pH為1、2、4、5、8、10、11、12、14的復蘇稀釋液；分別取上述復蘇稀釋液2 mL于測試管中（n=3），加入50 μL測試菌液，輕輕震蕩使之充分混勻開始計時，每2 min測定1次發(fā)光強度值，比較pH對發(fā)光強度的影響。

（2）精密度考察

重復性考察：以1.4.1的方法對不同廠家各個批次的參麥注射液成品進行檢測，每批樣品平行3次試驗，對結(jié)果進行分析。

中間精密度考察：①不同人員：以1.4.1的方法由不同的實驗員在同一個工作日對同一批參麥注射液成品進行檢測，對結(jié)果進行分析；②不同工作日：由相同的實驗員在不同工作日對同一批參麥注射液成品進行檢測，對結(jié)果進行分析。

1.4.3 費氏弧菌——參麥注射液綜合毒性評價

按照1.4.1的方法，對不同廠家各個批次的參麥注射液成品進行發(fā)光強度檢測并計算抑制率和EC50值（抑制率為50%時該樣品的濃度值），根據(jù)EC50值對比各樣品的綜合毒性大?。‥C50值與各樣品綜合毒性成負相關(guān)）。

1.4.4 數(shù)據(jù)處理和毒性評價

抑制率計算公式為：

采用excel對數(shù)模型擬合樣品濃度-效應(yīng)曲線，根據(jù)擬合模型計算樣品的EC50值（抑制率為50%時該樣品的濃度值），以EC50值表征參麥注射液綜合毒性的大小，并對數(shù)據(jù)進行處理和統(tǒng)計分析。

1.4.5 統(tǒng)計學方法

運用Excel軟件先進行F-TEST方差齊性檢驗，后進行T-TEST雙尾等方差檢驗。P＞0.05無顯著性差異，P＜0.05有顯著性差異，P＜0.01有極顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 影響因素考察

復蘇液體積、加入菌液體積及時間對空白對照管初始發(fā)光強度值的影響：由圖1可見，固定加入菌液體積，復蘇液體積不同會造成初始發(fā)光強度值隨時間的走勢不同，隨復蘇液體積增大初始發(fā)光強度值呈現(xiàn)先增高后降低趨勢；固定復蘇液體積，所加菌液體積不同會造成初始發(fā)光強度值隨時間的走勢不同，隨所加菌液體積增大初始發(fā)光強度值亦呈現(xiàn)先增高后降低趨勢；結(jié)合上述試驗結(jié)果為減小試驗誤差同時考慮成本問題，選取最優(yōu)復蘇液體積0.9 mL，每管加菌液體積50 μL，10-30 min內(nèi)發(fā)光強度值基本沒有太大變化可用于試驗測定（初始發(fā)光強度值在80-120萬之間為宜）。

2.1.1 時間對不同濃度待測樣品發(fā)光強度值的影響

由圖2可見，不同濃度的參麥注射液對費氏弧菌初試發(fā)光強度值的影響不同，低濃度促進發(fā)光，高濃度抑制發(fā)光，且中間濃度抑制率在15 min左右開始發(fā)生衰減。綜合空白對照管的結(jié)果，設(shè)定參麥注射液-費氏弧菌綜合毒性評價體系參數(shù)為：復蘇液0.9 mL，每管加入菌液50 μL，最優(yōu)檢測時間10 min。

圖1 復蘇液體積、加入菌液體積及時間對空白對照管初始發(fā)光強度值的影響（n=3）

圖2 時間對不同濃度待測樣品發(fā)光強度值的影響（n=3）

2.1.2 pH對發(fā)光強度的影響

由圖3可見，待測樣品溶液pH在5-10時對發(fā)光強度值的影響較?。ā?0%）。

2.2 精密度考察

重復性：根據(jù)表1可見，重復性試驗的相對偏差＜15%。

中間精密度：根據(jù)表2可見，中間精密度試驗的相對偏差＜15%。

2.3 不同廠家參麥注射液綜合毒性比較

由表3和圖4可見，不同生產(chǎn)廠家A、B、C的參麥注射液成品EC50值差異較大。

3 討論

3.1 Microtox技術(shù)綜合毒性評價體系

利用發(fā)光菌生理上的獨特性，Microtox技術(shù)根據(jù)發(fā)光強度的變化檢測生物毒性，也是目前GB/T 15441-1995和ISO11348認證的急性毒理測試方法。細菌有很多種類，但是他們的發(fā)光原理是相同的，都是酶促氧化反應(yīng)。一般主要有熒光素酶、FMN、NAD（P）H、長鏈脂肪醛（RCHO）、分子氧等物質(zhì)參與發(fā)光反應(yīng)。在正常的生理條件下發(fā)光菌能發(fā)出波長在450-490 nm的藍綠色可見光，發(fā)光強度在特定試驗條件下是恒定的；發(fā)光強度在接觸外來受試物時會發(fā)生變化，外來受試物抑制細菌發(fā)光主要通過2個途徑：①直接抑制酶類參與發(fā)光反應(yīng)的活性；②抑制與發(fā)光反應(yīng)有關(guān)的細胞內(nèi)代謝過程。原理圖如圖5所示[4]。

圖3 pH對發(fā)光強度的影響（n=3）

表1 3批參麥注射液成品重復性試驗

表2 中間精密度試驗

表3 不同廠家參麥注射液成品生物綜合毒性結(jié)果

該技術(shù)評價體系優(yōu)點如下：①發(fā)光菌具有同高等生物類似的物理化學性質(zhì)和酶作用過程特點，模擬性強，是一種綜合毒性檢測方法；②該方法為國際公認的客觀可靠的方法，且方法簡單，便于操作，重復性好；③反應(yīng)靈敏度高，比一般生物反應(yīng)細胞靈敏幾個數(shù)量級；④可以同時獲得多個定量參數(shù)，EC50、標準毒物參比值、毒性劑量-效應(yīng)動力曲線等多個定量參數(shù)的測定，綜合表征上述注射劑毒性特點[5-13]。

3.2 參麥注射液對發(fā)光菌的綜合毒性

本文首次應(yīng)用一種Microtox技術(shù)方法測定參麥注射液綜合毒性，選取費氏弧菌作為發(fā)光菌測試菌種，考察并建立其生物綜合毒性評價體系，確定最優(yōu)復蘇液體積為0.9 mL，最優(yōu)菌液加入量為50 μL，最優(yōu)檢測時間10 min，最優(yōu)pH范圍5-10，且10 min時空白對照發(fā)光強度以80-120萬為宜。重復性和中間精密度在此方法體系下較為良好，RSD＜15%，方法穩(wěn)定性好。從研究結(jié)果分析，參麥注射液對費氏弧菌的毒性存在顯著的濃度-效應(yīng)關(guān)系，且不同生產(chǎn)廠

圖4 不同廠家參麥注射液成品生物綜合毒性結(jié)果

圖5 發(fā)光菌發(fā)光代謝過程和原理圖

1 王連心,謝雁鳴,艾青華,宋年斌.參麥注射液上市后臨床安全性主動監(jiān)測與被動監(jiān)測大數(shù)據(jù)綜合評估.中國中藥雜志,2015,40(24)：4752-4756.

2 張建軍.參麥注射液的臨床研究進展.中國現(xiàn)代藥物應(yīng)用,2015,9(8)：266-267.

3 王志豪. 157例參麥注射液不良反應(yīng)報告分析.中國處方藥,2015,13(9)：6-7.

4 Meighen E A. Molecular biology of bacterial bioluminescence. Microbiol Rev, 1991, 55(1)：123-142.

5 趙軍寧,鄢良春.基于Microtox技術(shù)（微毒測試）的中藥綜合毒性快速評價.世界中醫(yī)藥,2014,9(2)：137-144.

6 趙軍寧,鄢良春,鄭曉秋.一種快速檢測中藥注射劑綜合毒性的生物測試方法.中國：ZL201310210195.8,2016-09-06.

7 趙軍寧,鄢良春，朱雅寧，等.一種快速檢測紅花注射液綜合毒性的生物測試方法. 中國： ZL201410113782.X,2016-08-17.家之間成品EC50值具有顯著性差異，提示參麥注射液成品生物學檢測標準存在進一步提升的空間，應(yīng)用Microtox技術(shù)檢測參麥注射液綜合毒性并用于控制不同廠家成品質(zhì)量波動具有很好的應(yīng)用前景。

8 趙軍寧,鄢良春,鄭曉秋,等.一種快速檢測魚腥草注射液綜合毒性的生物測試方法. 中國： ZL201310369652.8,2016-02-17.

9 李孝容,華樺,鄢良春,等.蒼耳子微毒測試(Microtox)與小鼠急性毒性的相關(guān)性研究.中藥藥理與臨床,2016,32(2)：134-138.

10 夏見英,華樺,鄢良春,等.基于Microtox技術(shù)快速檢測蒼耳子藥材及其飲片、成方制劑毒性變化規(guī)律.中藥藥理與臨床,2016,32(2)：151-154.

11 熊靜悅,李孝容,鄢良春,等. Microtox中藥注射劑微毒測試體系明亮發(fā)光桿菌502和青?；【鶴67發(fā)光反應(yīng)條件的比較研究.中藥藥理與臨床,2016,32(2)：227-230.

12 鄭曉秋,鄢良春,趙軍寧,等.應(yīng)用Microtox技術(shù)檢測魚腥草注射液綜合毒性的研究.中藥藥理與臨床,2013,29(6)：92-95.

13 熊靜悅,李孝容,鄢良春,等.基于Microtox技術(shù)的中藥注射劑微毒快速測試體系反應(yīng)條件的優(yōu)化與方法學的考察.中國中藥雜志,2016,41(9)：1622-1626.

Microtox Technology for the Evaluation of Comprehensive Toxicity of Shen Mai Injection

Zhao Bingxiang1, Luo Limin1, Yan Liangchun2, Hua Hua2, Hu Mei1, Zhao Junning2
(1.China Resources 999 Pharmaceutical Co., Ltd. (Ya'an), Ya'an 625000, China; 2. Sichuan Academy of Chinese Medicine Sciences, Chengdu 610041, China)

In this research, we chiefly explored a new fast test method--microtox technology to evaluate the comprehensive toxicity of Shen Mai injection. We investigated characteristic parameters of vibrio fischeri (CS234) under different conditions in the pursuit of the optimum test parameters of the reliable method; and then locked the best parameters for Shen Mai injection assay with the products from different manufacturers by microtox fast test. As a result, the optimum reaction condition included 0.9 mL recovery liquid in each freeze-dried vial and 50 μL bacteria suspension of each sample within 2 mL solution in aggregate with 10-mins detection after adding bacteria suspension which pH value ranging from 5 to 10 and luminous intensity from 0.8 to 1.2 million in 10 mins. The relative standard deviation values of replication experiment and precision test were all below 15%. Under this optimum detection condition, it was found that the EC50values were 35.60%, 92.34% and 146.57%, differing among the samples from three representative drug manufacturers, respectively (P ＜ 0.01). In conclusion, the concentration-effect relationship of Shen Mai injection existed in the toxicity assessment of vibrio fischeri with various EC50values from the three manufacturers. These results suggested that biological detection standards of Shen Mai injection presented great growth potential. Microtox-based fast test in the evaluation of comprehensive toxicity of ShenMai injection showed favorable application prospects over controlling the quality of different sources of products.

Microtox technology, bacteria growth inhibition, Shen Mai injection, comprehensive toxicity

10.11842/wst.2016.11.017

R285

A

（責任編輯：朱黎婷，責任譯審：朱黎婷）

2016-11-15

修回日期：2016-12-06

＊ 科學技術(shù)部“重大新藥創(chuàng)制”科技重大專項項目（2015ZX09501004-001-005）：基于Microtox（微毒）測試的中藥安全性快速檢測、質(zhì)量控制與風險預(yù)警新技術(shù)研究，負責人：趙軍寧；國家自然科學基金委面上項目（81470180）：基于Microtox技術(shù)的中藥毒性分級原理與標準研究，負責人：趙軍寧；國家中醫(yī)院管理局國家公益性行業(yè)科研專項（201507004）：與臨床病癥相關(guān)的確有療效常用中藥炮制技術(shù)與配伍減“毒”研究——蒼耳子，負責人：華樺；四川省科技廳科技支撐計劃項目（2015SZ0033）：麥冬整合式產(chǎn)業(yè)鏈綜合開發(fā)研究-已上市中成藥參麥注射液的二次開發(fā)，負責人：朱雅寧。

＊＊ 趙炳祥、羅荔敏為共同第一作者。

＊＊＊ 通訊作者：趙軍寧，本刊編委，研究員，博士，博士生導師，主要研究方向：中藥藥理學、中藥質(zhì)量生物控制、道地藥材與民族藥系統(tǒng)研究開發(fā)。