劉薇薇，陳軍峰，肖 瑩，張 磊，陳萬(wàn)生＊＊

（1.中國(guó)人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)附屬長(zhǎng)征醫(yī)院 上海 200003；2.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬普陀醫(yī)院上海 200233；3.中國(guó)人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院藥用植物學(xué)教研室 上海 200433）

丹參中主要活性成分生物合成的研究進(jìn)展＊

劉薇薇2，陳軍峰1，肖 瑩1，張 磊3，陳萬(wàn)生1＊＊

（1.中國(guó)人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)附屬長(zhǎng)征醫(yī)院 上海 200003；2.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬普陀醫(yī)院上海 200233；3.中國(guó)人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院藥用植物學(xué)教研室 上海 200433）

丹參酮類和丹參酚酸類化合物是丹參中兩類主要的活性成分，其含量水平是丹參藥效的決定因素，直接體現(xiàn)了藥材的品質(zhì)。為深入解析丹參的品質(zhì)內(nèi)涵以提升丹參品質(zhì)，學(xué)者們開展了一系列研究以闡明丹參中活性成分的生物合成機(jī)制及累積特征。近年來，隨著更高效的基因組、代謝組等研究手段的應(yīng)用，丹參活性成分的生物合成研究獲得了快速發(fā)展，本研究對(duì)該領(lǐng)域研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，為丹參的活性成分及其藥材品質(zhì)的深入研究提供理論依據(jù)。

丹參 丹參酮 丹參酚酸 生物合成

中藥丹參（Salviae Miltiorrhizae Radix et Rhizoma）是唇形科植物丹參Salvia miltiorrhiza Bge.的干燥根和根莖，其有效成分具有良好的擴(kuò)張血管、治療心肌缺血、抗動(dòng)脈粥樣硬化、改善微循環(huán)以及抗菌消炎等活性，在中國(guó)廣泛應(yīng)用于心腦血管系統(tǒng)疾病的治療。伴隨著中國(guó)心腦血管疾病的高發(fā)態(tài)勢(shì)，丹參相關(guān)的藥材、制劑、保健品等實(shí)際需求也高速增長(zhǎng)。隨著丹參產(chǎn)業(yè)規(guī)模的不斷擴(kuò)大，丹參藥材的品質(zhì)對(duì)整個(gè)產(chǎn)業(yè)的影響也更加顯著，涉及該產(chǎn)業(yè)各種產(chǎn)品藥效、企業(yè)成本控制、種植戶收入等主要環(huán)節(jié)，以及延伸的一系列土地、環(huán)境等問題。根據(jù)2015年版《中華人民共和國(guó)藥典》要求，以總丹參酮（Tanshinones）含量不低于0.25%、丹參酚酸B（Salvianolic acid B）不低于0.3%作為丹參藥材質(zhì)量的主要評(píng)價(jià)指標(biāo)[1]。因此，以丹參酮及丹參酚酸兩類化合物為切入點(diǎn)，研究其在丹參中生物合成與累積的機(jī)制，已經(jīng)成為科學(xué)闡明丹參的品質(zhì)內(nèi)涵、實(shí)現(xiàn)丹參藥材品質(zhì)控制的主要途徑。近年來，隨著高通量代謝組、基因組、轉(zhuǎn)錄組等研究手段廣泛應(yīng)用于丹參的研究，丹參活性成分生物合成的研究發(fā)展更加迅速，產(chǎn)生了許多突破性成果，本文對(duì)相應(yīng)的成果進(jìn)行綜合概述，為丹參活性成分的生物合成研究提供較為完善的現(xiàn)狀分析。

1 高通量檢測(cè)技術(shù)在丹參活性成分研究中的應(yīng)用

1.1 代謝組學(xué)技術(shù)在丹參活性成分合成途徑中的應(yīng)用

隨著化合物檢測(cè)技術(shù)水平的提高和技術(shù)手段的不斷豐富，代謝組學(xué)技術(shù)已經(jīng)成為研究中藥活性成分生物合成的主要手段之一。在近期研究中，質(zhì)譜分析已經(jīng)成為研究丹參活性成分的主要手段。Lu W

等[2]利用HPLC-MS/MS實(shí)現(xiàn)了對(duì)丹參主要活性成分的快速識(shí)別及檢測(cè)，包括丹參酚酸類物質(zhì)及其前體共10個(gè)化合物，并成功應(yīng)用于多個(gè)丹參活性成分合成途徑的研究。在最近丹參相關(guān)的研究中，高通量代謝組學(xué)分析開始扮演越來越重要的角色。利用飛行時(shí)間質(zhì)譜（Q-TOF）、傅立葉變換質(zhì)譜（Orbitrap）等檢測(cè)平臺(tái)，通過分析化合物的精確分子量和質(zhì)譜信息，可以快速實(shí)現(xiàn)單參中兩類活性成分合成途徑上大部分相關(guān)化合物的指認(rèn)及定量（表1）。Di P等[3]對(duì)丹參酚酸進(jìn)行了全途徑化合物的指認(rèn)和定量，并且在此基礎(chǔ)上開展了丹酚酸合成途徑的同位素示蹤研究。Cui G等[4]建立了包括丹參酮類在內(nèi)的39個(gè)化合物的快速指認(rèn)方法，并且應(yīng)用到丹參二萜合酶蛋白家族的研究中。Zhao Q等[5]建立了丹參中40種化合物的快速檢測(cè)方法，同時(shí)期還利用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（GC-MS）技術(shù)檢測(cè)萜類途徑上游化合物。除了主要活性成分合成途徑研究外，高通量代謝組學(xué)分析還可同時(shí)對(duì)相關(guān)的初生代謝途徑進(jìn)行更大范圍的分析（如莽草酸途徑、氨基酸合成等途徑），從而整體了解丹參活性成分的生物合成。

表1 丹參主要活性成分及其合成途徑化合物的質(zhì)譜信息

表2 高通量測(cè)序技術(shù)在丹參活性成分合成途徑的應(yīng)用

1.2 高通量測(cè)序在丹參活性成分代謝合成中的應(yīng)用

隨著高通量測(cè)序技術(shù)的飛速發(fā)展以及成本下降，基因組測(cè)序、轉(zhuǎn)錄組測(cè)序已經(jīng)成為研究中藥有效成分生物合成的最有效工具，并廣泛應(yīng)用于丹參活性成分合成途徑的研究（表2）。陳士林、漆小泉課題組采用Illumina測(cè)序平臺(tái)首次完成了丹參基因組測(cè)序及拼接工作，獲得了大小為558 MB的丹參基因組，預(yù)測(cè)包含30 478個(gè)蛋白編碼基因[6]。全基因組序列的獲得，使我們可以獲得所有可能參與到丹參活性成分合成途徑的完整基因信息，包括丹參酚酸途徑[7]，丹參酮途徑[8]，以及眾多轉(zhuǎn)錄因子家族的完整信息[9-11]。

在基因組注釋的基礎(chǔ)上，使用高通量測(cè)序進(jìn)行表達(dá)譜測(cè)序（RNA sequencing），可以進(jìn)一步研究與丹參活性成分生物合成相關(guān)基因的表達(dá)特征，從而準(zhǔn)確解析活性成分的合成特征以及調(diào)控機(jī)制。研究者可以檢測(cè)相關(guān)基因在不同丹參器官[12]、不同根部組織[13]和不同影響因素下的轉(zhuǎn)錄變化[11,14,15]；同時(shí)結(jié)合不同層面的代謝組分析，解析代謝-轉(zhuǎn)錄變化的關(guān)聯(lián)性，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)對(duì)丹參酮及丹參酚酸類成分在丹參中生物合成途徑的深入、準(zhǔn)確的解析。

2 丹參活性成分的生物合成途徑

2.1 丹參酮的生物合成途徑

丹參酮屬于二萜醌類化合物，其生物合成途徑起始于萜類化合物的通用途徑即生成異戊二烯基焦磷酸（Isopentenyl Pyrophosphate，IPP）的甲羥戊酸途徑（Mevalonic Acid Pathway，MVA）和生成二甲烯丙基焦磷酸（Dimethylallyl Pyrophosphate，DMAPP）的丙酮酸/磷酸甘油醛途徑（MEP/DOXP Pathway，DXP）。兩個(gè)C5化合物結(jié)合生成牻牛兒醇焦磷酸（(E)-Geranyl pyrophosphate，GPP），繼而依次轉(zhuǎn)化為法尼基焦磷酸（(E,E)-Farnesyl Pyrophosphate，F(xiàn)PP），牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸（(E,E,E)-geranylgeranyl pyrophosphate，GGPP）。在早期的研究中，因受限于有限的背景信息，主要針對(duì)萜類上游通用途徑開展丹參酮生物合成研究。丹參中的乙酰輔酶A酰基轉(zhuǎn)移酶（AACT，Accession No. EF635969）、3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A合成酶（HMGS，Accession No. DQ243700）、3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶（HMGR，Accession No. EU680958）、脫氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶（DXS，Accession No. EU670744、FJ643618）、4-(5-焦磷酸胞苷)-2-C-甲基-D-赤蘚醇激酶（CMK，Accession No. EF534309）、2-C-甲基赤蘚醇-2,4-環(huán)焦磷酸合成酶（MCS，Accession No. JX233816）、1-羥基-2-甲基-2-(E)-丁烯基-4-焦磷酸還原酶（HDR）、牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸環(huán)化酶（GGPPS，Accession No. FJ643617）等一系列萜類途徑中的催化酶及其編碼基因被依次獲得。

在此基礎(chǔ)上，基于更加豐富的丹參基因信息，黃璐琦課題組將丹參酮的合成途徑進(jìn)行了一系列解析（圖1A）。丹參酮類化合物屬醌類二萜化合物，此萜類途徑分支起始于GGPP向半日花二烯/古巴基二磷酸酯（Labdadienyl/copalyl Diphosphate，CPP）的轉(zhuǎn)化，進(jìn)而生成次丹參酮二烯（Miltiradiene）。為了解析這兩步催化步驟的機(jī)制，Gao W等[19]對(duì)丹參根部組織的cDNA文庫(kù)進(jìn)行篩選，分別獲得了古巴基焦磷酸合酶（CPP synthases，SmCPS1，Accession No. EU003997）和類貝殼杉烯合酶（Kaurene synthaselike，SmKSL1，Accession No. EF635966）。體外酶活實(shí)驗(yàn)表明，SmCPS1不具有異構(gòu)特異性，可以催化GGPP轉(zhuǎn)化為ent-CPP和syn-CPP，該蛋白是被子植物中獲得的第一個(gè)對(duì)GGPP具有特異催化活性的Class II二萜環(huán)化酶。同時(shí)，SmKSL1也是第一個(gè)從被子植物中獲得的對(duì)CPP具有特異催化活性的Class I二萜合成酶。Guo等[20]對(duì)Ag+誘導(dǎo)的丹參毛狀根進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析，篩選獲得了6個(gè)根特異表達(dá)的細(xì)胞色素P450（Cytochrome P450，CYP）候選基因。通過體外活性篩選，證明CYP76AH1（Accession No. JX422213）可以催化次丹參酮二烯發(fā)生羥基化生成彌羅松酚（Ferruginol）。接下來，Guo等[21]進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)CYP76AH3可以催化彌羅松酚11位羥基化或7位酮基化，分別生產(chǎn)11-羥基彌羅松酚（11-Hydroxy ferruginol）和柳杉酚（Sugiol）；隨后兩個(gè)產(chǎn)物經(jīng)CYP76AK1催化20位羥基化生成10-羥甲基四氫次 丹 參 酮（10-Hydroxymethyl tetrahydromiltirone）和11,20-二羥基柳杉酚（11,20-Dihydroxy sugiol）。然而C-14和C-17如何發(fā)生環(huán)氧化，這個(gè)途徑怎樣繼續(xù)生成次丹參酮（Miltirone）、隱丹參酮（Cyrptotanshinone）、丹參酮IIA（Tanshinone IIA）、丹參酮I（Tanshinone I）（圖1A）等活性成分還需要進(jìn)一步的探索。

2.2 丹參酚酸的生物合成途徑

丹參酚酸類化合物的生物合成途徑起始于苯丙素通用途徑和酪氨酸途徑。早期的研究中，丹參酚酸途徑的研究主要參考彩葉草（Coleus Blumei）、紫草（Lithospermum erythrorhizon）等物種中已報(bào)道的途徑。分別由苯丙氨酸（L-Phenylalanine）經(jīng)脫氨、羥化、輔酶A連接三步催化，生成香豆酰輔酶A（4-Coumaroyl-CoA）；酪 氨 酸（L-Tyrosine）經(jīng)轉(zhuǎn)氨基、還原兩步催化反應(yīng)生成4-羥基苯乳酸（4-Hydroxyphenyllactic acid）。 兩 條 支 路 的產(chǎn)物經(jīng)BAHD家族?；D(zhuǎn)移酶迷迭香酸合成酶（Rosmarinic acid synthase，RAS）催化結(jié)合生產(chǎn)4-香豆?；?4-羥基苯乳酸（4-coumaroyl-4'-hydroxyphenyllactic acid），進(jìn) 而 被CYP98A14催化，于3'和4'位依次發(fā)生羥基化生成4-香豆?；?3',4'-羥 基 苯 乳 酸（4-coumaroyl-3',4'-hydroxyphenyllactic acid）及4-咖啡?；?3',4'-羥基苯乳酸（4-caffeoyl-3',4'-hydroxyphenyllactic acid）。 然而，Di P等發(fā)現(xiàn)[3]，丹參中酚酸類成分的累積特征與其他產(chǎn)生酚酸化類合物的唇形科植物截然不同，這個(gè)現(xiàn)象提示丹參中存在著特殊的酚酸合成路徑。通過13C同位素標(biāo)記代謝流分析（13C metabolic flux analysis），結(jié)果顯示，丹參的迷迭香酸（Rosmarinic Acid，RA）合成途徑確實(shí)與植物的已知途徑存在差異。主要差異發(fā)生在4-羥基苯乳酸的轉(zhuǎn)化上，丹參中4-羥基苯乳酸先經(jīng)過3位羥基化才與4-香豆酰輔酶A結(jié)合，該結(jié)果表明除了CYP98A14外，還有一個(gè)未知CYP蛋白存在于這個(gè)途徑。除此之外，目前為止，植物細(xì)胞中RA怎樣轉(zhuǎn)化為丹參酚酸B（Salvianolic Acid B，SAB）還是一個(gè)未知領(lǐng)域。通過該研究可以推測(cè)出，丹參酚酸B由兩個(gè)分別于2位、8位發(fā)生電子重排的RA分子結(jié)合而成；進(jìn)一步推測(cè)可得，植物中的漆酶（Laccase）家族可能具有類似催化功能。通過不同根部組織的表達(dá)譜分析，1個(gè)漆酶編碼基因SmLAC5的轉(zhuǎn)錄與丹參酚酸途徑具有最顯著的轉(zhuǎn)錄關(guān)聯(lián)性，為進(jìn)一步篩選丹參酚酸B合成催化蛋白提供了重要提示[22]。

圖1 丹參酮類化合物的生物合成途徑

2.3 丹參活性成分合成途徑的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制

圖2 丹參中酚酸類成分的生物合成途徑

隨著丹參酮及丹參酚酸類合成途徑被逐漸闡明，其調(diào)控機(jī)制的闡明成為下一個(gè)研究的熱點(diǎn)?；谵D(zhuǎn)錄調(diào)控可以更有效地對(duì)合成途徑實(shí)行調(diào)控，更高效地提高丹參中活性成分的合成。植物激素茉莉酸甲酯（Methyl Jasmonate，MeJA）基于植物抗逆反應(yīng)機(jī)制，能夠高效引起植物代謝途徑的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，是公認(rèn)的提高植物次生代謝產(chǎn)物的誘導(dǎo)因子，可以誘導(dǎo)丹參酮類、酚酸類化合物的合成大幅提升[14,23,24]，以此為切入點(diǎn)，Zhou Y等[25]對(duì)丹參中參與MeJA信號(hào)響應(yīng)的關(guān)鍵調(diào)控因子MYC2開展了研究，確認(rèn)了其對(duì)MeJA信號(hào)途徑的控制作用，初步確認(rèn)SmMYC2通過調(diào)控SmHCT6和 SmCYP98A14兩個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄水平而調(diào)控酚酸類化合物的合成。此外，JAZ蛋白作為另一類MeJA信號(hào)途徑的重要開關(guān)也被證明對(duì)丹參酮、丹參酚酸類途徑具有明顯的調(diào)控作用[21]。除了MeJA外，Ag+[27]、水楊酸[15]等分子都被證明可以有效激活丹參兩類活性成分的合成途徑，為我們從多角度進(jìn)一步全面闡明這些合成途徑的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制提供了理想的研究體系。

3 丹參活性成分的生物合成途徑的代謝調(diào)控

3.1 丹參活性成分合成途徑的次生代謝工程研究

基于對(duì)途徑的認(rèn)知，Xiao Y等[28]開展了丹參酚酸途徑的代謝工程研究，采用多種途徑調(diào)控策略，將途徑中的SmC4H、SmTAT、SmHPPR基因過表達(dá)激活合成途徑，通過RNAi抑制SmHPPD基因以抑制代謝支路，最終發(fā)現(xiàn)將TAT基因和HPPR基因共表達(dá)是最有效的調(diào)控策略，可以分別將RA和丹參酚酸B的含量提高3.3倍和4.4倍。為了提高丹參酮的含量，Kai等[29]將SmGGPPS，SmHMGR，SmDXS等基因過表達(dá)，發(fā)現(xiàn)共表達(dá)SmGGPPS、SmHMGR可以大幅提高丹參毛狀根中丹參酮類的含量達(dá)4.74倍。

基于MeJA對(duì)丹參活性成分調(diào)控的顯著作用，Gu X C等[30]通過提高SmAOC（Allene oxide cyclase）基因的表達(dá)，提升丹參中內(nèi)源茉莉酸水平的含量，從而實(shí)現(xiàn)了對(duì)丹參活性成分的高效調(diào)控。Zhang Y等[31]采用組合的遺傳操作，將外源轉(zhuǎn)錄因子（Anthocyanin Pigment 1 Transcription Factor，AtPAP1）導(dǎo)入丹參中，同時(shí)通過抑制SmCCR（Cinnamoyl-CoA reductase）及 SmCOMT（Caffeic acid O-methyltransferase）基因的轉(zhuǎn)錄抑制丹參苯丙素網(wǎng)絡(luò)中的其他支路，這個(gè)組合策略使丹參酚酸B的含量提高了3倍。利用玉米中的C1轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，Zhao S[32]等發(fā)現(xiàn)丹參中丹參酮的含量可以提高3.4倍，而同時(shí)酚酸類含量卻降低了37%，這個(gè)研究實(shí)現(xiàn)了對(duì)合成途徑的靶標(biāo)性調(diào)控，對(duì)將來實(shí)現(xiàn)丹參品質(zhì)的精確控制具有借鑒意義。

3.2 丹參活性成分的合成生物學(xué)研究

利用合成生物學(xué)策略，使用微生物細(xì)胞生產(chǎn)有價(jià)值的天然產(chǎn)物，是解決藥材資源問題的另一個(gè)理想途徑。Guo J等[20]將已知的丹參酮途徑在酵母中重構(gòu)，獲得了可以合成丹參酮前體彌羅松酚的酵母細(xì)胞，經(jīng)過元件優(yōu)化，使其發(fā)酵產(chǎn)量達(dá)到了10.5 mg·L-1。而隨著丹參酮合成途徑的解析，必將能夠?qū)崿F(xiàn)丹參酮活性物質(zhì)的高效發(fā)酵生產(chǎn)。對(duì)于酚酸類途徑，已有報(bào)道在大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)實(shí)現(xiàn)了全合成，但是還沒有獲得較高的產(chǎn)率，而丹參中特異存在的酚酸途徑的闡明[3]，則為這項(xiàng)研究提供了一個(gè)潛在的高效途徑以及相關(guān)的合成元件。

4 展望

鑒于丹參在中藥市場(chǎng)上具有重要地位，其活性成分又極具代表性，目前越來越多的國(guó)內(nèi)外頂級(jí)科研團(tuán)隊(duì)開始關(guān)注丹參的研究，隨著大量科研成果的累積，丹參已經(jīng)逐漸被視為藥用植物中的“模式植物”[33]。對(duì)丹參研究的飛速發(fā)展將極大地從各個(gè)方面提升這一傳統(tǒng)藥材的應(yīng)用。隨著丹參活性成分合成機(jī)制一步步被解析，我們可以從活性成分角度出發(fā)，逐步闡明丹參藥材品質(zhì)的科學(xué)內(nèi)涵，從而幫助我們制定更加科學(xué)準(zhǔn)確的丹參藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)、培育優(yōu)質(zhì)且穩(wěn)定的丹參種質(zhì)、形成科學(xué)的栽培種質(zhì)管理體系，以及利用工業(yè)化手段生產(chǎn)丹參中的活性成分等。最終，通過解決丹參藥材的資源和品質(zhì)兩大問題，逐步實(shí)現(xiàn)中藥丹參產(chǎn)業(yè)的現(xiàn)代化。

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33 宋經(jīng)元, 羅紅梅, 李春芳,等. 丹參藥用模式植物研究探討. 藥學(xué)學(xué)報(bào), 2013(7)：1099-1106.

A Research Progress on the Biosynthesis of Effective Compounds in Salvia Miltiorrhiza

Liu Weiwei2, Chen Junfeng1, Xiao Ying1, Zhang Lei3, Chen Wansheng1
(1. Changzheng Hospital, Second Military Medical University, Shanghai 200003, China; 2. Shanghai Putuo District Central Hospital Affiliated to Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, Shanghai 200233, China; 3. Department of Pharmacognosy, School of Pharmacy, Second Military Medical University, Shanghai 200433, China)

Tanshinones and phenolic acids are two major classes of effective compounds in S. miltiorrhizae Radix et Rhizoma. Accumulative levels of these compounds directly determined its quality and efficacy. Presently, for the purpose of understanding the underlying the mechanism behind the biosynthesis and regulation of effective compounds in S. miltiorrhiza, a series of progresses have been pressed ahead. Benefiting from the boost and convenience of high-throughput genomic, transcriptomic, and metabolic analysis methods, remarkable achievements have been accessed in this field. In this paper, a summary for the recent progress have been made with the provision of a reference for better understanding over the quality of S. miltiorrhiza.

Salvia miltiorrhiza Bunge, tanshinones, phenolic acid, biosynthesis

10.11842/wst.2016.11.010

R931.6

A

（責(zé)任編輯：馬雅靜，責(zé)任譯審：朱黎婷）

2016-10-27

修回日期：2016-11-02

＊ 國(guó)家自然科學(xué)基金委杰出青年科學(xué)基金（81325024）：中藥藥效物質(zhì)，負(fù)責(zé)人：陳萬(wàn)生；國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（81673550）：丹參根系形態(tài)、結(jié)構(gòu)特征與有效成分積累的關(guān)聯(lián)性及形成機(jī)制研究，負(fù)責(zé)人：陳軍峰；國(guó)家自然科學(xué)基金青年基金項(xiàng)目（31100221）：四倍體菘藍(lán)聚合蛋白酶與松脂醇還原酶的功能及特征研究，負(fù)責(zé)人：肖瑩。

＊＊ 通訊作者：陳萬(wàn)生，本刊編委，教授，博士生導(dǎo)師，主要研究方向：中藥藥效物質(zhì)和品質(zhì)調(diào)控研究；張磊，副教授，主要研究方向：藥用植物學(xué)。