王騰騰，趙永見，陳 巖，李金龍，王擁軍，施 杞，梁倩倩，徐 浩＊＊

（1.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院 上海 200032；2.上海中醫(yī)藥大學(xué)脊柱病研究所 上海 200032）

二陳加桃紅四物湯改善類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的機(jī)理研究＊

王騰騰1，2，趙永見1，2，陳 巖1，2，李金龍1，2，王擁軍1，2，施 杞1，2，梁倩倩1，2，徐 浩1，2＊＊

（1.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院 上海 200032；2.上海中醫(yī)藥大學(xué)脊柱病研究所 上海 200032）

目的：類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（Rheumatoid Arthritis，RA）是一種累及全身小關(guān)節(jié)的自身免疫性疾病。前期研究發(fā)現(xiàn)，充足的淋巴回流功能有利于RA的恢復(fù)。本文主要探討二陳加桃紅四物湯治療本病的療效及其對(duì)淋巴管回流功能的影響。方法：本研究采用10周齡TNF轉(zhuǎn)基因（TNF-Tg）小鼠為模型，以二陳加桃紅四物湯灌胃治療12周，并選取同窩野生型小鼠作對(duì)照，采用Micro-CT觀測(cè)小鼠的踝關(guān)節(jié)骨量，采用近紅外-吲哚菁綠系統(tǒng)檢測(cè)小鼠下肢淋巴管功能。結(jié)果：Micro-CT三維成像顯示，與對(duì)照組相比，TNF-Tg組可見明顯的骨質(zhì)破壞，踝關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)嚴(yán)重受損。二陳加桃紅四物湯治療后，骨結(jié)構(gòu)得到了一定程度的保護(hù)。淋巴管回流功能檢測(cè)顯示，與對(duì)照組相比，TNF-Tg組的淋巴管清除率明顯下降；與TNF-Tg組相比，二陳加四物湯可促使受損的淋巴功能恢復(fù)。與對(duì)照組小鼠相比，TNF-Tg組的Pulse值明顯下降，與TNF-Tg組相比，二陳加桃紅四物湯可促進(jìn)Pulse值明顯升高。結(jié)論：二陳加桃紅四物湯可以有效促進(jìn)TNF轉(zhuǎn)基因小鼠模型下肢的淋巴回流功能，從而緩解關(guān)節(jié)炎癥，保護(hù)骨組織免受侵蝕。

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎 二陳加桃紅四物湯 TNF轉(zhuǎn)基因小鼠 淋巴回流功能

RA是一種自身免疫性疾病，多種炎性因子介導(dǎo)了該病的炎癥反應(yīng)；替代醫(yī)學(xué)療法在治療RA方面具有較大的發(fā)展空間[1]。中醫(yī)認(rèn)為，痰瘀既是RA的病理產(chǎn)物，又是其基本病機(jī)[3]，二陳加四物湯為治療痰瘀互結(jié)的常用方劑?，F(xiàn)代研究認(rèn)為，淋巴管回流功能在RA的發(fā)病過程中起到重要的作用[4]；TNF轉(zhuǎn)基因（TNF-Tg）小鼠在闡釋炎癥反應(yīng)中發(fā)揮了重要作用[2]，是研究RA常用的動(dòng)物模型。本文主要探討二陳加四物湯對(duì)TNF-Tg模型小鼠淋巴管回流功能的影響以及對(duì)RA的治療作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

本實(shí)驗(yàn)采用的TNF-Tg小鼠（line 3647）來自1991年George Kollias實(shí)驗(yàn)室，并由羅徹斯特大學(xué)贈(zèng)送。TNF-Tg小鼠攜帶單人TNF拷貝基因，呈現(xiàn)自發(fā)慢性、進(jìn)展性關(guān)節(jié)炎，與WT同窩對(duì)照小鼠一起飼養(yǎng)于上海模式動(dòng)物中心，SPF級(jí)，自由飲水?dāng)z食。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

組織提取與DNA抽提（美國Sigma公司，貨號(hào)：051M8617V、SLBB1424V、041M6349），瓊脂糖（西班牙Biowest公司，批號(hào)：G-10111860），DNA Marker（北京TIANGEN公司，貨號(hào)：MD102），引物購自上海百力格生物技術(shù)有限公司。二陳加桃紅四物湯組成：半夏12 g、橘紅12 g、茯苓9 g、熟地12 g、當(dāng)歸12 g、白芍9 g、川芎9 g、桃仁9 g、紅花6 g、炙甘草6 g，以上所有中藥均購自上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院中藥房。異氟烷（深圳沃瑞德公司，批號(hào)：217140901），脫毛膏（印度利潔時(shí)公司，國妝特進(jìn)字J20130140）。吲哚菁綠（Indocyanine Green，ICG）（美國Acorn公司，批號(hào)：081424）。近紅外成像系統(tǒng)（法國Hubtech公司，型號(hào)：Fluobeam Clinical System）。小動(dòng)物麻醉機(jī)（美國VMR公司，型號(hào)：V1315267），Micro-CT（瑞士SCANCO公司，型號(hào)：uCT80）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 動(dòng)物鑒定及分組

對(duì)3周齡小鼠剪尾，進(jìn)行基因組DNA抽提。每個(gè)樣本加入提取液25.00 μL，制備液6.25 μL，25℃ 5 min→ 95℃ 10 min→ 25℃ 5 min，加入25.00 μL中和液混勻，室溫放置5 min。引物序 列F：5’-TACCCCCTCCTTCAGACACC-3’；R：5’-GCCCTTCATAATATCCCCCA-3’。PCR反應(yīng)體系20 μL：Bioteke PCR mix 7 μL、水10 μL、DNA抽提產(chǎn)物1 μL、上下游引物各1 μL。94℃ 3 min、94℃30 s→60℃ 35 s→72℃ 1.5 min，30個(gè)循環(huán)，72℃7 min，4℃保存。配制2%的瓊脂糖膠，上樣量10 μL，電壓110 V，持續(xù)40 min。陽性條帶在200-300 bp之間。

采用SPSS軟件將陽性小鼠按體質(zhì)量隨機(jī)區(qū)組，分為TNF-tg組、中藥二陳加四物湯組（簡(jiǎn)稱：中藥ECSWT組），每組10只。按照陽性小鼠平均體質(zhì)量，挑選體質(zhì)量相似、同窩飼養(yǎng)的陰性小鼠10只，為對(duì)照組。

1.3.2 動(dòng)物給藥

根據(jù)《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物藥理學(xué)》，將小鼠（20 g）與人（60 kg）的中藥計(jì)量進(jìn)行換算（換算系數(shù)9.01），小鼠需服中藥煎劑濃度為1.09 g·mL-1，取上述中藥1付，加12倍水，浸泡30 min，煮沸后再煎30 min，趁熱過濾得煎液1；所余藥渣加8倍水，同樣方法得煎液2；合并兩次煎液，通風(fēng)櫥中加熱濃縮至67 mL，每只小鼠灌胃0.2 mL。對(duì)照組和TNF-Tg組灌胃生理鹽水，每天1次，連續(xù)12周。

1.3.3 測(cè)量指標(biāo)

小鼠氣體麻醉，下肢脫毛，采用30號(hào)針頭，10 μL ICG（0.1 μg·mL-1，蒸餾水溶解）注射小鼠足底皮膚，在近紅外下連續(xù)可觀察到熒光信號(hào)由集合淋巴管進(jìn)入腘窩淋巴結(jié)，連續(xù)1 h并拍照，24 h后觀察5 min。采用Image J軟件定量測(cè)定圖片中ICG的信號(hào)強(qiáng)度。根據(jù)兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)的足底信號(hào)強(qiáng)度可得出淋巴管的清除率，公式：清除率=（S24h-S1h）/S1h×100%。ICG注射1 h之后，淋巴管的信號(hào)趨于穩(wěn)定，連續(xù)觀測(cè)500 s淋巴管搏動(dòng)情況，記錄Pulse值[5]。灌胃前與灌胃結(jié)束后各采集一次指標(biāo)。

動(dòng)物踝關(guān)節(jié)取材，置于75%酒精固定24 h；采用Micro-CT掃描，參數(shù)為：電壓55 kV、電流72 μA、分辨率10 μmpx。

1.4 統(tǒng)計(jì)方法

采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。統(tǒng)計(jì)結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差描述，多組間比較均用單因素方差分析，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性意義。

2 結(jié)果

2.1 踝關(guān)節(jié)Micro-CT 3D成像

與WT小鼠相比，TNF-Tg組小鼠可見明顯的骨質(zhì)破壞，踝關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)嚴(yán)重受損，骨量降低；與TNF-Tg組相比，ECSWT組小鼠骨結(jié)構(gòu)受損得到了一定程度的緩解，骨量亦有所提高（圖1）。

圖1 不同組別小鼠踝關(guān)節(jié)Micro-CT 3D圖像

2.2 淋巴管清除率檢測(cè)

如圖2、圖3所示，藍(lán)色圓圈部分為足底部注射部位，注射后24 h，與對(duì)照組（清除率76.10%）相比，TNF-Tg組的淋巴管清除率明顯下降（清除率47.15%，P＜0.05）。與TNF-Tg組相比，ECSWT組清除率明顯增加（清除率80.16%，P＜0.05），促進(jìn)了受損淋巴功能的恢復(fù)。

2.3 淋巴管Pulse檢測(cè)

圖4所示為ICG注射1 h后500 s內(nèi)淋巴管的信號(hào)強(qiáng)度變化情況，我們把峰值與谷值的變化次數(shù)轉(zhuǎn)化為Pulse個(gè)數(shù)。如圖5所示，對(duì)照組小鼠Pulse為每分鐘1.45e個(gè)信號(hào)強(qiáng)度，與之相比，TNF-Tg組明顯下降（每分鐘0.62e個(gè)信號(hào)強(qiáng)度，P＜0.05）。與TNF-Tg組相比，ECSWT組Pulse信號(hào)強(qiáng)度升高（每分鐘1.24e個(gè)信號(hào)強(qiáng)度，P＜0.05）。

圖2 不同組別小鼠ICG-NIR成像

圖3 不同組別小鼠下肢淋巴管清除率計(jì)量分析

圖4 不同組別小鼠下肢淋巴管信號(hào)強(qiáng)度情況

圖5 不同組別小鼠下肢淋巴管Pulse統(tǒng)計(jì)分析

3 討論

RA以關(guān)節(jié)腫脹、疼痛、畸形為主要臨床表現(xiàn)，若治療不當(dāng)，會(huì)導(dǎo)致全身多器官的的并發(fā)癥?！皩丁绷x為骨骼彎曲，本病在中醫(yī)屬于“尪痹”范疇；痰瘀在本病的病機(jī)、診治中占有很大的比例，風(fēng)寒濕邪侵襲經(jīng)絡(luò)，氣血阻滯，痰瘀膠著，遂成此證[6]。本病主要病理表現(xiàn)為多種炎性因子浸潤、滑膜細(xì)胞增生、血管翳的生成等[7]，與“痰瘀”的病機(jī)極為類似?！疤叼觥钡闹嗅t(yī)理論基礎(chǔ)實(shí)為“津血同源”，因此痰瘀同治的治療方法有著深厚的理論基礎(chǔ)和很長(zhǎng)的發(fā)展歷程。

二陳湯出自《太平惠民和劑局方》，主治“治痰飲為患”。《重樓玉鑰》有二陳湯可治“骨槽風(fēng)等癥”的記載。目前二陳湯主要治療肋骨骨折并發(fā)癥[8]、坐骨滑膜囊腫[9]等病。桃紅四物湯，又名加味四物湯，出自《玉機(jī)微義·卷三十一》（引《醫(yī)壘元戎》），“桃紅四物”之名首見于《醫(yī)宗金鑒·卷四十四》，《正骨心法要旨》中用本方治療跌打損傷下法之后痛不止?，F(xiàn)代研究證明，桃紅四物湯具有舒張血管、保護(hù)血管內(nèi)皮[10]、治療骨關(guān)節(jié)炎[11]，促進(jìn)成骨分化[12]、調(diào)節(jié)免疫功能[13]等作用。由此可見，以上兩方在骨病的臨床、基礎(chǔ)研究中均有應(yīng)用，兩方相合而成二陳加桃紅四物湯，為痰瘀同治的經(jīng)典搭配，可用于治療酒精性脂肪肝、甲亢、卵巢囊腫等多種疾病的痰瘀阻滯型[14-16]。

前期研究證明，RA患者的關(guān)節(jié)滑膜中存在大量炎性因子的浸潤，而淋巴管在關(guān)節(jié)的透明質(zhì)酸、炎性因子、代謝產(chǎn)物等大分子[17]的回流中起到了重要作用。TNF-Tg小鼠的淋巴回流收到破壞，本研究通過二陳加桃紅四物湯治療TNF-Tg小鼠，證明該方可促進(jìn)淋巴管回流功能的恢復(fù)，促進(jìn)炎性產(chǎn)物的代謝，從而緩解關(guān)節(jié)骨的破壞，治療RA。

血管在RA的作用越來越受到重視，大量研究發(fā)現(xiàn)，RA患者存在微循環(huán)障礙，心血管事件增加[18]等情況。此外，淋巴管在腫瘤轉(zhuǎn)移、水腫、過敏性疾病、代謝性疾病等領(lǐng)域發(fā)揮著重要的作用[19]，淋巴管在RA的作用也應(yīng)得到同樣的關(guān)注。淋巴管在RA的研究才剛剛起步，尚有大量?jī)?nèi)容有待探索和發(fā)現(xiàn)。淋巴管與炎癥、免疫關(guān)系密切，隨著免疫醫(yī)學(xué)的興起，淋巴管必將受到越來越多的關(guān)注。中醫(yī)素有“久病入絡(luò)”和“頑痹生痰”[20]之說，王清任亦提出“瘀血致痹”，痰瘀致病、病程纏綿、反復(fù)發(fā)作，與慢性、難治性RA等疾病相似。傳統(tǒng)的診斷技術(shù)、外科手術(shù)治療均忽略了淋巴管，淋巴管有可能是影響多種疾病愈后的關(guān)鍵所在。臨床中較棘手的并發(fā)癥或難治性疾病，包括對(duì)生物制劑無應(yīng)答者，都有可能在淋巴管上找到突破點(diǎn)。中醫(yī)藥如何在淋巴管研究潮流中發(fā)揮自己的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，是值得我們深思的問題和未來的研究方向。

1 Kumar L D, Karthik R, Gayathri N, et al. Advancement in contemporary diagnostic and therapeutic approaches for rheumatoid arthritis. Biomed Pharmacother, 2016， 79： 52-61.

2 Li P, Schwarz E M. The TNF-alpha transgenic mouse model of inflammatory arthritis. Springer Semin Immunopathol, 2003, 25： 19-33.

3 劉喜德,葉麗紅,王芳,等.類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎寒熱錯(cuò)雜痰瘀痹阻病因病機(jī)探討.中華中醫(yī)藥學(xué)刊,2010,28(10)： 2078-2079.

4 Liang Q Q, Shi Q, Wood R W, et al. Peri-articular lymphatic system and "Bi" theory of Chinese medicine in the pathogenesis and treatment of arthritis. Chin J Integr Med, 2015, 21： 648-655.

5 Weiler M, Kassis T, Dixon J B. Sensitivity analysis of near-infrared functional lymphatic imaging. J Biomed Opt, 2012, 17： 066019.

6 杜明瑞,馮福海.從“痰”“瘀”“虛”論治難治性類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎.中醫(yī)研究,2015,28(3)： 8-10.

7 Mateen S, Zafar A, Moin S, et al. Understanding the role of cytokines in the pathogenesis of rheumatoid arthritis. Clin Chim Acta, 2016, 455：161-171.

8 管宏章.觀察二陳湯加味治療肋骨骨折并血?dú)庑氐呐R床療效.內(nèi)蒙古中醫(yī)藥.2014： 42.

9 王輝.二陳湯加味治療坐骨滑膜囊腫.中醫(yī)藥臨床雜志,2005,17(2)：132-133.

10 劉竹青,尹登科,韓嵐,等.桃紅四物湯含藥血清對(duì)過氧化氫損傷的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)作用.中國中藥雜志,2013,38(3)： 402-406.

11 李寧,謝興文,宋敏.桃紅四物湯和四妙湯對(duì)大鼠膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎白介素-1四和白介素-6含量的影響.蘭州大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版),2009,35(2)： 24-26,30.

12 徐世紅,謝興文,李寧,等.桃紅四物湯含藥血清對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖、成骨分化的影響.中華中醫(yī)藥雜志,2013,28(9)： 2713-2716.

13 許得盛,沈自尹,王文健,等.右歸飲、四君子湯、桃紅四物湯調(diào)節(jié)腎虛、脾虛、血瘀證患者免疫功能的觀察.中國中西醫(yī)結(jié)合雜志,1999,19(12)： 9-11.

14 劉樹軍,黃靜娟,車念聰.二陳湯及桃紅四物湯對(duì)非酒精性脂肪肝CYP2E1活性影響的實(shí)驗(yàn)研究.中華中醫(yī)藥雜志,2008,23(8)： 729-731.

15 武春麗.二陳湯合桃紅四物湯治療狀腺機(jī)能亢進(jìn)癥突眼36例.陜西中醫(yī),2011,32(11)： 1488.

16 袁曉春,郭桂紅,熊燕秀,等.桃紅四物湯合二陳湯化裁治療卵巢囊腫68例.內(nèi)蒙古中醫(yī)藥,2013： 49.

17 劉寧飛,張魯榕,李圣利,等.肢體淋巴水腫和透明質(zhì)酸代謝.中華整形外科雜志,2004,20(2)： 30-33.

18 Faccini A, Kaski J C, Camici P G. Coronary microvascular dysfunction in chronic inflammatory rheumatoid diseases. Eur Heart J, 2016, 37：1799-1806.

19 Venero Galanternik M, Stratman A N, Jung H M, et al. Building the drains： the lymphatic vasculature in health and disease. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol, 2016, 5(6)： 689-710.

20 韋嵩.頑痹從痰論治.安徽中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2000,19(3)： 4-6.

Mechanisms Behind the Therapeutic Effects of Er Chen Combined with Tao Hong Si Wu Tang (ECSWT) on Rheumatoid Arthritis

Wang Tengteng1,2, Zhao Yongjian1,2, Chen Yan1,2, Li Jinlong1,2, Wang Yongjun1,2, Shi Qi1,2, Liang Qianqian1,2, Xu Hao1,2
(1. Longhua Hospital Affiliated to Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, Shanghai 200032, China; 2. Institute of Spine Diseases, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, Shanghai 200032, China)

Rheumatoid arthritis (RA) is a chronic autoimmune disorder primarily occurred in small joints. Our previous studies suggested that sufficient lymphatic drainage was favorable for the recovery of RA. This study aimed at exploring the effect of Er Chen combined with Tao Hong Si Wu Tang (ECSWT) on RA in TNF transgenic (TNF-Tg) mice. Ten-week old TNF-Tg mice and WT littermates were detected with indocyanine green-nearinfrared (ICG-NIR) lymphatic imaging system before and after accepting the 12-week intragastric administration of ECSWT. All ankle joints were assessed by micro-CT scanning. According to three dimensional images of Micro-CT, it was found that the ankle joints in the TNF-Tg group were much eroded compared with the control group. The bone mass and structure were protected after the treatment of ECSWT. ICG-NIR results showed that lymphatic clearance rate of the TNF-Tg group decreased compared with those of the control group. In comparison with the TNF-Tg group, ECSWT promoted the repair of lymphatic function. Compared with the control group, the pulse value of the TNF-Tg group declined; while this condition could be rescued by ERSWT. In conclusion, ECSWT mitigated bone erosion of astragalus bone area in TNF-Tg mice in contrast to the saline mice, while promoted the pulse value and clearance of lymphatic vessels afferent from footpad to popliteal lymph node, implying that ECSWT was a promising agent for treating RA through its promoting lymphatic drainage function effects.

Rheumatoid arthritis, TNF-Tg mice, Er Chen Combined Tao Hong Si Wu Tang, lymphatic drainage function

10.11842/wst.2016.11.007

R274

A

（責(zé)任編輯：朱黎婷，責(zé)任譯審：朱黎婷）

2016-11-04

修回日期：2016-11-04

＊ 國家自然科學(xué)基金委重點(diǎn)項(xiàng)目（81330085）：痰瘀型類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎與淋巴關(guān)系的基礎(chǔ)研究，負(fù)責(zé)人：施杞；國家自然科學(xué)基金委重大國際合作項(xiàng)目（81220108027）：益氣祛濕法調(diào)控淋巴系統(tǒng)對(duì)炎癥性關(guān)節(jié)炎的影響，負(fù)責(zé)人：王擁軍；教育部高等學(xué)校全國優(yōu)秀博士學(xué)位論文作者專項(xiàng)資金資助項(xiàng)目（201276）：負(fù)責(zé)人：梁倩倩；上海市龍華醫(yī)院龍醫(yī)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)（LYCX-01）：祛瘀化瘀防治頸痛和炎性關(guān)節(jié)炎的基礎(chǔ)研究，負(fù)責(zé)人：梁倩倩；上海市衛(wèi)生與計(jì)劃生育委員會(huì)中醫(yī)藥三年行動(dòng)計(jì)劃項(xiàng)目（ZY3-CCCX-2-1002）：國家中醫(yī)臨床研究基地建設(shè)項(xiàng)目，負(fù)責(zé)人：崔學(xué)軍；筋骨理論與治法教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，負(fù)責(zé)人：王擁軍；上海市長(zhǎng)寧區(qū)衛(wèi)生與計(jì)劃生育委員會(huì)"光華卓越PI工程"項(xiàng)目（2016-01），負(fù)責(zé)人：施杞；上海市教育委員會(huì)高校實(shí)驗(yàn)技術(shù)隊(duì)伍建設(shè)計(jì)劃（LH01.24.001）：負(fù)責(zé)人：趙永見。

＊＊ 通訊作者：徐浩，助理研究員，主要研究方向：中醫(yī)藥治療關(guān)節(jié)炎癥性疾病的療效及機(jī)制研究。