向海弘，何慧軍，楊春平，3，程 燕，張 毅，楊偉強(qiáng)

（1. 湖南大學(xué) 環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，湖南 長沙 410082；2. 湖南大學(xué) 環(huán)境生物與控制教育部重點實驗室，湖南 長沙 410082）

納米Al2O3固定化紅平紅球菌菌球的制備及其對苯酚的降解

向海弘1，2，何慧軍1，2，楊春平1，2，3，程 燕1，2，張 毅1，2，楊偉強(qiáng)1，2

（1. 湖南大學(xué) 環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，湖南 長沙 410082；2. 湖南大學(xué) 環(huán)境生物與控制教育部重點實驗室，湖南 長沙 410082）

以海藻酸鋁為主要包埋材料、納米Al2O3為添加劑，包埋固定紅平紅球菌，制得納米Al2O3固定化紅平紅球菌菌球，并將其用于苯酚的降解。表征結(jié)果顯示：菌球內(nèi)部包含豐富的菌絲體；內(nèi)部孔徑以中孔居多。實驗結(jié)果表明：菌球的最優(yōu)制備方案為0.05 g納米Al2O3加入3 mL海藻酸鈉溶液中、海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)6%、微生物包埋量0.5 mL/mL（以海藻酸鈉溶液計）、Al2（SO4）3質(zhì)量分?jǐn)?shù)3%；在初始苯酚質(zhì)量濃度為400 mg/L、反應(yīng)時間為24 h、菌球加入量為8 g/L、反應(yīng)pH為8.0、反應(yīng)溫度為30 ℃的條件下，菌球首次使用時可使苯酚完全降解，使用5次后的苯酚降解率仍達(dá)93%以上，具有良好的循環(huán)使用性。

納米Al2O3；固定化；紅平紅球菌；苯酚；降解

苯酚屬高毒類化合物，人體攝入一定量后會出現(xiàn)急性中毒反應(yīng)，長期飲用被苯酚污染的水體可引發(fā)瘙癢、貧血、頭暈及神經(jīng)系統(tǒng)障礙。苯酚污染主要來源于煤氣、煉油、焦化、木材防腐、化工等行業(yè)排放的廢水［1］。針對苯酚廢水，國內(nèi)外學(xué)者總結(jié)出了4大類治理方法：化學(xué)法、高級氧化法、物化法和生物法［2-5］。應(yīng)用固定化微生物技術(shù)對苯酚廢水進(jìn)行治理，具有穩(wěn)定性強(qiáng)、處理效率高、無二次污染等優(yōu)點，是目前的重點研究方向［6-10］。

在固定化微生物技術(shù)的研究中，選擇具有良好性能的載體是其中最為重要的課題之一［11-13］。納米復(fù)合材料由于具有良好的理化性質(zhì)、特殊的納米效應(yīng)及生物相容性，成為一種理想載體［14］。納米Al2O3具有高比表面積和高表面能，將其加入包埋材料中可有效促進(jìn)微生物對污染物的降解［15-16］。在微生物方面，紅平紅球菌（Rhodococcus erythropolis）屬紅球菌，可轉(zhuǎn)化降解多種難降解有機(jī)物［17-21］。

本工作以海藻酸鋁為主要包埋材料、納米Al2O3為添加劑，包埋固定紅平紅球菌，制得納米Al2O3固定化紅平紅球菌菌球（簡稱納米Al2O3固定化菌球），并將其用于苯酚的降解。利用正交實驗對納米Al2O3固定化菌球的制備工藝進(jìn)行了優(yōu)化，并考察了苯酚降解效果的影響因素，以期為工業(yè)應(yīng)用提供參考。

1 實驗部分

1.1 試劑、材料和儀器

納米Al2O3：純度99.99%，粉末狀，阿拉丁試劑（上海）有限公司；苯酚、海藻酸鈉（SA）、CaCl2、Al2（SO4）3、NaOH、HNO3：分析純。

紅平紅球菌：購于中國典型微生物保藏中心，菌種保藏號為ACCC No. 10543。

基礎(chǔ)培養(yǎng)基［22］（用于菌種的富集與活化）：酵母浸出粉5 g，胰蛋白胨10 g，NaCl 10 g，蒸餾水1 000 mL，pH=7.0。斜面培養(yǎng)基和固體平板在上述配方基礎(chǔ)上加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的瓊脂。

無機(jī)鹽培養(yǎng)基（用于降解實驗）：NH4Cl 2 g，MgSO40.2 g，K2HPO40.5 g，KHPO40.2 g，F(xiàn)eCl30.005 g，CaCl20.001 g，蒸餾水1 000 mL，pH=7.0。

實驗中所使用的培養(yǎng)基均經(jīng)121 ℃高溫蒸汽滅菌鍋滅菌20 min。

DHG-9076A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上海璽恒實業(yè)有限公司；ZDX-35B型座式自控電熱壓力蒸汽滅菌鍋：上海精密儀器儀表有限公司；LRH-250A型生化培養(yǎng)箱：上海齊欣科學(xué)儀器有限公司；THZ-82B型氣浴恒溫振蕩器：常州諾基儀器有限公司；Mili-q型超純水機(jī)：密理博中國有限公司；NOVA-2000e型比表面積測定儀：美國Quantachrome公司；QUANTA-200型環(huán)境掃描電子顯微鏡：荷蘭Philips-FEI公司；722型可見光分光光度計：上海菁華科技儀器有限公司；FE-20型pH計：上海精密儀器儀表有限公司； WGZ-20型濁度計：美國Biolog公司；AL-104型分析天平：梅特勒-托利多國際股份有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 納米Al2O3固定化菌球的制備

稱取0.05～0.15 g納米Al2O3粉末，將其加入到3 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%～6%的海藻酸鈉溶液中，攪拌均勻，得到無菌納米Al2O3和海藻酸鈉混合液。向上述混合液中接種0.5～1.5 mL菌濃度為2.0×106個/mL的紅平紅球菌懸浮液，充分混合后逐滴滴入60 mL濃度為0.8 mol/L的無菌CaCl2溶液中，交聯(lián)30 min，得到納米Al2O3-海藻酸鈣-紅平紅球菌微球。用無菌超純水將上述微球洗滌3次，置于30 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%～3%的Al2（SO4）3溶液中固定4 h。將微球濾出，用無菌超純水洗滌3次，得到納米Al2O3-海藻酸鋁-紅平紅球菌微球。將納米Al2O3-海藻酸鋁-紅平紅球菌微球轉(zhuǎn)移至100 mL的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，在溫度30 ℃、搖床轉(zhuǎn)速120 r/min的條件下恒溫振蕩培養(yǎng)24 h后，將菌球濾出，即得最終的納米Al2O3固定化菌球。

采用正交實驗對制備條件進(jìn)行優(yōu)化。不加入納米Al2O3粉末，在最優(yōu)條件下重復(fù)上述操作，制得未加納米Al2O3的菌球。

1.2.2 苯酚的降解實驗

在無機(jī)鹽培養(yǎng)基中加入一定量的苯酚，取該培養(yǎng)基100 mL置于250 mL錐形瓶中，并加入一定量最優(yōu)條件下制備的納米Al2O3固定化菌球。用0.1 mol/L的HNO3或NaOH溶液調(diào)節(jié)pH，在搖床轉(zhuǎn)速120 r/min的條件下恒溫振蕩一定時間。每隔一段時間取樣。

1.3 分析方法

采用4-氨基安替吡啉直接光度法［23］測定所取試樣中的苯酚含量，計算苯酚降解率。采用濁度計測定菌濃度。采用SEM技術(shù)觀察菌球的微觀形貌。采用BET技術(shù)分析納米Al2O3固定化菌球的孔結(jié)構(gòu)。

2 結(jié)果與討論

2.1 正交實驗結(jié)果

在制備納米Al2O3固定化菌球的過程中，納米Al2O3加入量、SA質(zhì)量分?jǐn)?shù)、菌液接種量（即微生物包埋量）、Al2（SO4）3質(zhì)量分?jǐn)?shù)會影響菌球?qū)Ρ椒拥慕到庑Ч?。在前期實驗確定上述4因素取值范圍的基礎(chǔ)上，以苯酚降解率為主要考核指標(biāo)，采用4因素3水平進(jìn)行正交實驗，正交實驗因素水平見表1，正交實驗結(jié)果見表2。由表1和表2可見：理論最優(yōu)方案為A1B3C3D3，即納米Al2O3加入量0.05 g、SA質(zhì)量分?jǐn)?shù)6%、微生物包埋量1.5 mL、Al2（SO4）3質(zhì)量分?jǐn)?shù)3%；此方案對應(yīng)的苯酚降解率最高，成球性最好；各因素對苯酚降解率影響的大小順序為：D＞C＞A＞B，即Al2（SO4）3質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞微生物包埋量＞納米Al2O3加入量＞SA質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

表1 正交實驗因素水平

表2 正交實驗結(jié)果

2.2 菌球的表征結(jié)果

2.2.1 SEM照片

菌球的SEM照片見圖1。由圖1可見：未加納米Al2O3菌球的橫截面上有零散分布的菌絲體；而加入納米Al2O3后，可明顯觀察到紅平紅球菌的長勢良好，大量的菌絲體被包埋在微球內(nèi)部，附著生長。由此可推知，納米Al2O3固定化后的紅平紅球菌微球具有特殊的結(jié)構(gòu)，納米Al2O3能為微生物吸附固定在其表面提供足夠大的空間，優(yōu)化了紅平紅球菌在菌球內(nèi)的生長，從而提高其對苯酚的降解率。

圖1 菌球的SEM照片

2.2.2 BET數(shù)據(jù)

經(jīng)測定，最優(yōu)條件下制備的納米Al2O3固定化菌球的比表面積為2.294 m2/g，總孔體積為1.664×10-2cm3/g。納米Al2O3固定化菌球的孔徑分布見圖2。由圖2可見，納米Al2O3固定化菌球的內(nèi)部孔徑集中在30 nm以下，中孔居多。這有利于紅平紅球菌包埋于孔中，同時也能確保微生物所需營養(yǎng)元素及目標(biāo)污染物進(jìn)入菌球內(nèi)，便于紅平紅球菌接觸吸收。

圖2 納米Al2O3固定化菌球的孔徑分布

2.3 苯酚降解效果的影響因素

2.3.1 反應(yīng)時間和初始苯酚質(zhì)量濃度

在納米Al2O3固定化菌球加入量為8 g/L、反應(yīng)pH為8.0、反應(yīng)溫度為30 ℃的條件下，反應(yīng)時間和初始苯酚質(zhì)量濃度對苯酚降解效果的影響見圖3。由圖3可見：隨初始苯酚質(zhì)量濃度的增加，苯酚的完全降解需要更長的時間；當(dāng)初始苯酚質(zhì)量濃度為100，200，400 mg/L時，苯酚完全降解的時間分別為16，18，24 h；當(dāng)初始苯酚質(zhì)量濃度增至600 mg/ L時，24 h后的苯酚質(zhì)量濃度降至418 mg/L，表明納米Al2O3固定化菌球仍具有一定的降解能力。

圖3 反應(yīng)時間和初始苯酚質(zhì)量濃度對苯酚降解效果的影響

2.3.2 納米Al2O3固定化菌球加入量

在初始苯酚質(zhì)量濃度為400 mg/L、反應(yīng)時間為22 h、反應(yīng)pH為8.0、反應(yīng)溫度為30 ℃的條件下，納米Al2O3固定化菌球加入量對苯酚降解率的影響見圖4。由圖4可見：當(dāng)菌球加入量從2 g/L增至6 g/ L時，苯酚降解率從43.6%提高到78.6%；當(dāng)菌球加入量為8 g/L時，苯酚降解率達(dá)到94.8%的最大值；再增加菌球加入量，苯酚降解率反而下降。這是因為當(dāng)菌球加入量過大時，會引起菌體生長過快，導(dǎo)致單位體積內(nèi)的營養(yǎng)和溶解氧供應(yīng)不足，不利于對苯酚的降解。因此，選擇最適菌球加入量為8 g/L。

圖4 納米Al2O3固定化菌球加入量對苯酚降解率的影響

2.3.3 反應(yīng)pH

pH對微生物的生命活動有很大的影響。在初始苯酚質(zhì)量濃度為400 mg/L、反應(yīng)時間為22 h、菌球加入量為8 g/L、反應(yīng)溫度為30 ℃的條件下，以未加納米Al2O3的菌球作為對照組，反應(yīng)pH對苯酚降解率的影響見圖5。由圖5可見：實驗組的苯酚降解率相對于對照組在不同pH下均有較大程度地提高；在pH為4.0或10.0（即過酸或過堿）的條件下，實驗組的苯酚降解率較低，均低于70%；在pH 為5.0～9.0的范圍內(nèi)，苯酚降解率較高；當(dāng)pH為8.0時，實驗組的苯酚降解率達(dá)到最大，為94.8%。這是因為：苯酚降解過程中產(chǎn)生的物質(zhì)多數(shù)呈酸性，使培養(yǎng)基中的pH降低［25］；當(dāng)初始pH為8.0時，伴隨著實驗的進(jìn)行pH趨于中性，有利于微生物對苯酚的降解；這使得紅平紅球菌在微堿性溶液中具有很好的苯酚降解率。因此，選擇最適反應(yīng)pH為8.0。

圖5 反應(yīng)pH對苯酚降解率的影響

2.3.4 反應(yīng)溫度

在初始苯酚質(zhì)量濃度為400 mg/L、反應(yīng)時間為22 h、菌球加入量為8 g/L、反應(yīng)pH為8.0的條件下，以未加納米Al2O3的菌球作為對照組，反應(yīng)溫度對苯酚降解率的影響見圖6。由圖6可見：在相同的溫度環(huán)境下進(jìn)行苯酚降解，實驗組相對于對照組表現(xiàn)出較為明顯的優(yōu)勢；在30～35 ℃的溫度范圍內(nèi)，實驗組的苯酚降解率達(dá)到90%以上，明顯高于其他溫度范圍；反應(yīng)溫度為30 ℃時的苯酚降解率最高。由此可見，環(huán)境溫度過低或過高均會抑制苯酚降解菌酶的活性，從而抑制苯酚的生物降解［26］。因此，選擇最適反應(yīng)溫度為30 ℃。

圖6 反應(yīng)溫度對苯酚降解率的影響

2.4 納米Al2O3固定化菌球的重復(fù)使用效果

在實際工業(yè)應(yīng)用中往往會涉及到固定化菌球的多次重復(fù)使用。在初始苯酚質(zhì)量濃度為400 mg/ L、反應(yīng)時間為24 h、菌球加入量為8 g/L、反應(yīng)pH 為8.0、反應(yīng)溫度為30 ℃的條件下，納米Al2O3固定化菌球的重復(fù)使用效果見圖7。由圖7可見：在菌球的5次重復(fù)使用過程中，第1和第2次的苯酚降解率維持在100%，第3～5次的苯酚降解率出現(xiàn)不同程度的下降，但下降幅度較??；使用5次后的苯酚降解率仍達(dá)93%以上，說明納米Al2O3固定化菌球在循環(huán)使用過程中保持著穩(wěn)定的生物活性，具有良好的重復(fù)使用性。

圖7 納米Al2O3固定化菌球的重復(fù)使用效果

3 結(jié)論

a）納米Al2O3固定化菌球的最優(yōu)制備方案為納米Al2O3加入量0.05 g、SA質(zhì)量分?jǐn)?shù)6%、微生物包埋量1.5 mL、Al2（SO4）3質(zhì)量分?jǐn)?shù)3%。

b）表征結(jié)果顯示：納米Al2O3固定化菌球內(nèi)部包含豐富的紅平紅球菌菌絲體；菌球具有較大的比表面積，內(nèi)部孔徑集中在30 nm以下，中孔居多。

c）納米Al2O3固定化菌球降解苯酚的最適條件為菌球加入量8 g/L、反應(yīng)pH 8.0、反應(yīng)溫度30 ℃。

d）在初始苯酚質(zhì)量濃度為400 mg/L、反應(yīng)時間為24 h、菌球加入量為8 g/L、反應(yīng)pH為8.0、反應(yīng)溫度為30 ℃的條件下，納米Al2O3固定化菌球首次使用時可使苯酚完全降解，使用5次后的苯酚降解率仍達(dá)93%以上，具有良好的重復(fù)使用性。

［1］ 奚旦立，孫裕生. 環(huán)境監(jiān)測［M］. 4版. 北京：高等教育出版社，2011：113 - 126.

［2］ 任磊，史延華，賈陽，等. 菌株Arthrobacter sp. CN2降解對硝基苯酚的特性與動力學(xué)［J］. 環(huán)境科學(xué)，2015，36（5）：1757 - 1762.

［3］ 楊岳主，李玉平，楊道武，等. 鐵銅催化劑非均相Fenton降解苯酚及機(jī)制研究［J］. 環(huán)境科學(xué)，2013，34（7）：2658 - 2664.

其實，我和阿花也是老朋友了，阿花當(dāng)年從韶關(guān)來深圳時,我們就認(rèn)識了。林強(qiáng)信將雪茄掐在煙灰缸里，說，我們曾有過多次合作，而且很愉快。所以你去她廠里，我贊成。你幫她，就等于我在幫她嘛。哈哈哈……

［4］ 陳柳柳，徐源，楊倩，等. 微生物燃料電池對苯酚的降解及其產(chǎn)電性能［J］. 化工環(huán)保，2015，35（1）：1 - 5.

［5］ 趙天亮，陳芳嬡，寧平，等. 工業(yè)含酚廢水治理進(jìn)展及前景［J］. 環(huán)境科學(xué)與技術(shù)，2008，31（6）：64 - 66.

［6］ 朱柱，李和平，鄭澤根. 固定化細(xì)胞技術(shù)處理含酚廢水的研究［J］. 重慶環(huán)境科學(xué)，2000，22（6）：64 - 67.

［7］ 周定，王建龍，侯文華，等. 固定化細(xì)胞在廢水處理中的應(yīng)用及前景［J］. 環(huán)境科學(xué)，1993，14（5）：51 - 54.

［8］ 劉瓊玉，李太友. 含酚廢水的無害化處理技術(shù)進(jìn)展［J］. 環(huán)境污染治理技術(shù)與設(shè)備，2002，3（2）：62 -66.

［9］ Godjevargova T，Ivanova D，Alexieva Z，et al. Biodegradation of toxic organic components from industrial phenol production waste water by free and immobilized Trichosporon cutaneum R57［J］. Process Biochem，2003，38（6）：915 - 920.

［10］ 周定，侯文華. 固定化微生物法處理含酚廢水的研究［J］. 環(huán)境科學(xué)，1990，11（1）：2 - 6.

［11］ Kourkoutas Y，Bekatorou A，Banat I M，et al. Im-mobilization technologies and support materials suitable in alcohol beverages production：A review［J］. Food Microbiol，2004，21（4）：377 - 397.

［12］ Koneracká M，Kop?ansky P，Antal? k M，et al. Immobilization of proteins and enzymes to fi ne magnetic particles［J］. J Magn Magn Mater，1999，201（1/2/3）：427 - 430.

［13］ 朱柱，李和平，鄭澤根. 固定化細(xì)胞技術(shù)中的載體材料及其在環(huán)境治理中的應(yīng)用［J］. 重慶建筑大學(xué)學(xué)報，2000，22（5）：95 - 101.

［14］ 吳慧玲，張淑平. 海藻酸鈉納米復(fù)合材料的研究應(yīng)用進(jìn)展［J］. 化工進(jìn)展，2014，33（4）：954 - 959.

［15］ Guo Hua，Lai Quanyong，Wang Wei，et al. Functional alginate nanoparticles for efficient intracellular release of doxorubicin and hepatoma carcinoma cell targeting therapy［J］. Int J Pharm，2013，451（1/2）：1 - 11.

［16］ Joshi A，Keerthiprasad R，Jayant R D，et al. Nanoin-micro alginate based hybrid particles［J］. Carbohydr Polym，2010，81（4）：790 - 798.

［17］ Zhang Jingshun，Sun Zhongtao，Li Yingying，et al. Biodegradation of p-nitrophenol by Rhodococcus sp. CN6 with high cell surface hydrophobicity［J］. J Hazard Mater，2009，163（2/3）：723 - 728.

［18］ Kitova A E，Kuvichkina T N，Arinbasarova A Y，et al. Degradation of 2，4-dinitrophenol by free and immobilized cells of Rhodococcus erythropolis HL PM-1［J］. Appl Biochem Microbiol，2004，40（3）：258 - 261.

［19］ Li Yuguang，Xing Jianmin，Li Wangliang，et al. Medium optimization of Rhodococcus erythropolis LSSE8-1 by Taguchi methodology for petroleum biodesulfurization［J］. Korean J Chem Eng，2007，24（5）：781 - 786.

［20］ Prieto M B，Hidalgo A，Serra J L，et al. Degradation of phenol by Rhodococcus erythropolis UPV-1 immobilized on Biolite? in a packed-bed reactor［J］. J Biotechnol，2002，97（1）：1 - 11.

［21］ Paisio C E，Talano M A，González P S，et al. Isolation and characterization of a Rhodococcus strain with phenol-degrading ability and its potential use for tannery effluent biotreatment［J］. Environ Sci Pollut Res，2012，19（8）：3430 - 3439.

［22］ Sandhu A，Halverson L J，Beattie G A. Bacterial degradation of airborne phenol in the phyllosphere［J］. Environ Microbiol，2007，9（2）：383 - 392.

［23］ 國家環(huán)境保護(hù)局《水和廢水監(jiān)測分析方法》編委會.水和廢水監(jiān)測分析方法［M］. 4版. 北京：中國環(huán)境科學(xué)出版社，2002：501 - 512.

［24］ Zhang Yewang，Prabhu P，Lee Jungkul. Alginate immobilization of recombinant Escherichia coli whole cells harboring L-arabinose isomerase for L-ribulose production［J］. Bioprocess Biosyst Eng，2010，33 （6）：741 - 748.

［25］ Pessione E，Divari S，Griva E，et al. Phenol hydroxylase from Acinetobacter radioresistens is a multicomponent enzyme［J］. European J Biochem，1999，265 （2）：549 - 555.

［26］ 周群英，王士芬. 環(huán)境工程：微生物學(xué)［M］. 3版. 北京：高等教育出版社，2011：100 - 118.

（編輯 魏京華）

Preparation of Rhodococcus erythropolis beads immobilized with nano Al2O3and degradation of phenol

Xiang Haihong1，2，He Huijun1，2，Yang Chunping1，2，3，Cheng Yan1，2，Zhang Yi1，2，Yang Weiqiang1，2

（1. College of Environmental Science and Engineering，Hunan University，Changsha Hunan 410082，China；2. Key Laboratory of Environmental Biology and Pollution Control，Ministry of Education，Hunan University，Changsha Hunan 410082，China）

The bacterial beads of immobilized Rhodococcus erythropolis with nano Al2O3was prepared by embedding method using sodium aluminum as major embedding materials and nano Al2O3as additives. The bacterial beads were used for degradation of phenol. The characterization results show that the beads contain abundant mycelium inside and the majority of the internal holes are mesoporous. The optimum conditions for preparation of the beads are as follows：adding 0.05 g nano Al2O3into 3 mL sodium alginate solution，sodium alginate mass fraction 6%，microorganism embedding capacity 0.5 mL for 1 mL sodium alginate solution and Al2（SO4）3mass fraction 3%. Under the conditions of initial phenol mass concentration 400 mg/L，reaction time 24 h，bacterial beads dosage 8 g/L，reaction pH 8.0 and reaction temperature 30 ℃，phenol is completely degraded at the fi rst use of bacterial beads，and the phenol degradation rate maintains higher than 93% after 5 times of reuse，which indicate that the beads are reusable.

nano Al2O3；immobilization；Rhodococcus erythropolis；phenol；degradation

X703

A

1006-1878（2016）03-0272-06

10.3969/j.issn.1006-1878.2016.03.007

2015 - 11 - 20；

2016 - 02 - 28。

向海弘（1992—），女，湖南省邵陽市人，碩士生，電話 15074968068，電郵 x09438106@163.com。聯(lián)系人：楊春平，電話 0731 - 88823987，電郵 yangc@hnu.edu.cn。

國家國際科技合作專項（2015DFG92750）；湖南省戰(zhàn)略性新興產(chǎn)業(yè)科技攻關(guān)類項目（2014GK1012）。