閆瀚坤，張雪銘，劉保臻＊，吳玉臣

（1.睢縣畜牧局，河南 睢縣 476900；2.河南牧業(yè)經(jīng)濟學(xué)院）

雞沙門氏菌的分離鑒定及藥敏試驗

閆瀚坤1，張雪銘2，劉保臻2＊，吳玉臣2

（1.睢縣畜牧局，河南 睢縣 476900；2.河南牧業(yè)經(jīng)濟學(xué)院）

用飼料廠常用飼料添加劑對臨床分離的沙門氏菌進行藥敏試驗，為飼料廠選用合適飼料添加劑提供參考。從河南各地養(yǎng)雞場蛋雞病料（雞白痢疑似病例）中分離出沙門氏菌，選取臨床常用幾種不同的抗菌藥物以4個濃度梯度自制藥敏片，藥敏試驗測定它們的抑菌效果。此次分離的沙門氏菌對金霉素和喹乙醇低敏，且各類飼料添加劑濃度梯度間的效果差異不顯著（P＞0.05），在高濃度下對硫酸粘桿菌素高敏，在中低濃度下對硫酸粘桿菌素中敏，各地區(qū)間的效果差異不顯著。

雞白痢；沙門氏菌；分離鑒定；抑菌濃度；藥敏試驗

沙門氏菌病是各種動物由沙門氏菌屬細菌引起的疾病總稱，臨診上患雞白痢的雛雞多表現(xiàn)為排稀薄糊狀糞便，成年雞產(chǎn)蛋率、受精率、孵化率下降。蛋內(nèi)感染的雛雞，形成死胚或弱雛，出殼不久無癥狀死亡。出殼后感染的，4～5日齡常呈無癥狀急性死亡，7～10 d發(fā)病增多，2～3周齡達到高峰，死亡率達40%～70%。3周齡以上較少死亡，不死者終生帶菌［1-2］。該研究通過對蛋雞病料（雞白痢疑似病例）進行病原的分離、鑒定，選用幾種臨床常用藥物飼料添加劑分別以常用添加量的1倍、2倍、4倍、6倍4個濃度梯度稀釋成混懸液，自制藥敏片對病原分離株進行藥敏試驗，以測定病原分離株對不同濃度的常用藥物飼料添加劑的敏感程度，確定藥物飼料添加劑的品種和參考用量，為制定合理的防制措施提供科學(xué)依據(jù)，提高養(yǎng)殖戶的經(jīng)濟效益。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 藥物飼料添加劑 50%喹乙醇，每噸飼料中添加200 g；20%金霉素，每噸飼料中添加250 g；10%硫酸粘桿菌素，每噸飼料中添加200 g。

1.1.2 病料 來自開封、洛陽、信陽、新鄉(xiāng)規(guī)?；半u場，采集自然發(fā)病雞（雞白痢疑似病例）的肝、脾及泄殖腔分泌物［3］。

1.1.3 主要試劑 麥康凱瓊脂，SS瓊脂培養(yǎng)基，MH瓊脂，營養(yǎng)瓊脂，營養(yǎng)肉湯。

1.1.4 主要用品 “雙圈牌”定性濾紙，微量生化鑒定管。

1.1.5 主要儀器 立式壓力蒸汽滅菌器，數(shù)顯電熱培養(yǎng)箱，超凈工作臺。

1.2 試驗方法

1.2.1 病原分離 將采集的病樣無菌操作接種于普通營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，37℃溫箱內(nèi)增菌培養(yǎng)12～24 h。然后，用接種環(huán)蘸取少量普通肉湯分別在SS、麥康凱和普通瓊脂平板上劃線，置于37℃培養(yǎng)24 h。觀察平板上單個菌落的顏色、大小、光滑度、濕潤度和透明度，挑取獨立、較大的疑似沙門氏菌菌落進行染色鏡檢，觀察到符合沙門氏菌形態(tài)及染色特征的菌落的其余部分接種于普通瓊脂斜面進行增菌備用。

1.2.2 生化鑒定 制備三糖鐵和生化試驗培養(yǎng)基，將鏡檢符合沙門氏菌的純培養(yǎng)物進行糖類發(fā)酵試驗及生化反應(yīng)，主要包括葡萄糖、乳糖、山梨醇、尿素酶、靛基質(zhì)、MR試驗、VP試驗、枸櫞酸鹽產(chǎn)氣試驗、硫化氫試驗等。

1.2.3 藥敏試驗

1.2.3.1 藥敏片的制備 選質(zhì)量較好的濾紙片，用打孔器將定性濾紙制成直徑為6 mm的紙片，每50片放入一個潔凈干燥的青霉素小瓶中，裝32瓶，121℃高壓滅菌15 min，取出后放入溫箱，干燥備用。在無菌條件下，將新霉素、硫酸粘桿菌素、硫酸安普霉素、金霉素、喹乙醇、泰樂菌素、土霉素、林可霉素以添加量的1倍、2倍、4倍、6倍4種濃度梯度配成混懸液。將藥敏片放入配制好的混懸液中，混合均勻后用鑷子夾出，放入4℃冰箱冷藏，將藥敏片平鋪在滅菌平皿中放入37℃溫箱中干燥后，放入滅菌青霉素小瓶中加蓋滅菌橡皮塞，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3.2 MH平板的制備 在無菌條件下，將滅菌后的MH瓊脂傾注至無菌平皿，待培養(yǎng)基冷卻后形成4 mm的平板。取出一個MH平板置于37℃溫箱中培養(yǎng)24 h做無菌試驗，其余用密封袋封好置4℃冰箱保存，備用。

1.2.3.3 試驗方法 采用藥物紙片瓊脂擴散法。用無菌小棉簽蘸取菌液，在管壁上旋轉(zhuǎn)擠壓去掉多余菌液，涂布整個MH瓊脂培養(yǎng)基表面，反復(fù)3次，每次將平板旋轉(zhuǎn)60°，最后沿周邊繞兩圈，保證涂布均勻。貼上制備好的藥敏紙片，每塊平板貼同種藥的藥敏片4種濃度各1片。將平板倒置，37℃孵育18～24 h后取出，測量抑菌圈直徑。抑菌圈不明顯的和抑菌圈過大的平板要做補充試驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌的培養(yǎng)特性

分離的病原菌在普通瓊脂培養(yǎng)基上形成圓形凸起、光滑、濕潤、半透明、灰白色、直徑2～3 mm的菌落；在麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上形成無色、透明的菌落；在SS瓊脂培養(yǎng)基上形成無色、透明或半透明、中央顯黑色的菌落；在普通營養(yǎng)肉湯中生長貧瘠，形成較小菌落。革蘭氏染色鏡檢可見紅色、兩端鈍圓、短桿狀，單個、成對或成叢排列。以上結(jié)果均符合沙門氏菌特征。

2.2 分離菌的生化試驗

對分離到的致病菌進行了如下（表1）生化試驗，結(jié)果均符合沙門氏菌的特征。

表1 分離菌的生化試驗結(jié)果

2.3 藥敏試驗

以抑菌圈直徑大小作為敏感性高低的標準，直徑越大表明細菌對該藥的敏感性越高。藥敏試驗參照美國臨床實驗室標準化委員會（NCCLS）的標準進行對照。抑菌圈直徑在15 mm以上為高敏，10～14 mm為中敏，10 mm為低敏，0 mm為耐藥［4］，結(jié)果顯示平均抑菌圈直徑隨藥品溶液濃度增大而增大，不同藥物的作用效果有顯著差異，但各濃度梯度間及各地區(qū)間差異不顯著（P＞0.05）（見表2）。此次分離到的致病性沙門氏菌菌株對金霉素和喹乙醇低敏，在中低濃度下對硫酸粘桿菌素中敏，在高濃度下對硫酸粘桿菌素高度敏感，沙門氏菌對金霉素和喹乙醇的耐藥性較高。

3 討論

通過對來自開封、信陽、洛陽、新鄉(xiāng)自然發(fā)病疑似雞白痢病雞體內(nèi)病原菌的分離鑒定及生化試驗，確診為沙門氏菌引起的雞白痢。選取3種臨床常用藥品飼料添加劑，分別以常用添加量的1倍、2倍、4倍、6倍4個濃度梯度制作藥敏片對分離鑒定株進行藥敏試驗，結(jié)果顯示隨著金霉素和喹乙醇藥物濃度的升高，沙門氏菌對藥物的敏感性降低，不同藥物的作用效果有顯著差異，但各地區(qū)間差異不顯著（P＞0.05）。

該次試驗從病雞體內(nèi)分離到雞白痢沙門氏菌，并通過藥物敏感性試驗對該菌的藥物敏感性做了初步研究。試驗結(jié)果表明，隨著飼料添加劑濃度的增加，沙門氏菌對金霉素和喹乙醇的敏感性降低，可以看出對金霉素和喹乙醇呈現(xiàn)出不同程度的耐藥性，且有報道稱家禽在使用喹乙醇中有中毒現(xiàn)象［5］。硫酸粘桿菌素可以用于治療沙門氏菌引起的腸道感染、腹瀉等，該研究證實硫酸粘桿菌素在中低濃度下對沙門氏菌中等敏感，這與李夢云等［6］的研究結(jié)果一致，在高濃度下對沙門氏菌高度敏感、有明顯的抑菌效果，但過度使用亦可能造成細菌產(chǎn)生耐藥性，因此，建議在臨床使用其進行促生長時不可盲目加大劑量。近年來，濫用這幾類抗微生物藥，已經(jīng)造成敏感菌產(chǎn)生了巨大的耐藥性，為感染性疾病的治療帶來了巨大的困難。因此，應(yīng)對患病區(qū)域進行定點定時監(jiān)測，防止由于盲目用藥而造成耐藥敏感菌產(chǎn)生，減少由此帶來的經(jīng)濟損失［7-8］。同時應(yīng)加強飼養(yǎng)管理，增強抗病能力；對于患病豬進行無害化處理，做好消毒工作，保持良好的衛(wèi)生條件。

表2 不同藥物的作用效果

［1］陳溥言.獸醫(yī)傳染病學(xué)［M］.北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2013.

［2］甘孟侯.禽病診斷與防治［M］.北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2002.

［3］鐘興福，黃小華，何旭梅，等.家禽病料的采集及注意事項［J］.廣西畜牧獸醫(yī)，2013，29（6）：350-351.

［4］韓春.豬源致病性大腸桿菌的流行調(diào)查及藥敏試驗［J］.中國畜禽業(yè)，2014，（1）：113-115.

［5］張忠群.家禽幾種藥物中毒及其應(yīng)對措施［J］.養(yǎng)殖技術(shù)顧問，2012，（2）：143-143.

［6］李夢云，胡迎利，喬宏興，等.硫酸粘桿菌素體外抑菌效果的研究［J］.鄭州牧業(yè)工程高等?？茖W(xué)校學(xué)報，2014，34（2）：8-10.

［7］辛文娟，朱斌斌.肉雜雞白痢的診斷與治療［J］.中獸醫(yī)醫(yī)藥雜志，2014（1）：66.

［8］陳江.雞白痢的診斷與治療［J］.中國畜牧獸醫(yī)文摘，2016，32（3）：215.

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1004-5090（2016）12-0003-03

2016-10-13）