張定濤，何輝霞，羊書勇，吳 坡，蔣 佶，鄭維銀

普萘諾爾對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖和凋亡影響的體外實(shí)驗(yàn)

張定濤，何輝霞，羊書勇，吳 坡，蔣 佶，鄭維銀

目的觀察不同濃度的普萘諾爾對(duì)人血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和凋亡的影響,為普萘諾爾治療血管瘤的機(jī)制研究提供依據(jù)。方法 取體外培養(yǎng)的人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECS），胰酶消化后制成單細(xì)胞懸液，常規(guī)培養(yǎng)，在達(dá)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，加入不同濃度的普萘諾爾干預(yù)，24 h后采用MTT法檢測(cè)各組細(xì)胞的增殖率，流式細(xì)胞儀Annexin V-FI雙染法檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。結(jié)果 作用24 h后，128 μg/ml以上濃度的普萘諾爾明顯抑制人血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖，而且能夠明顯增加血管內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡。結(jié)論 普萘諾爾對(duì)人血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖有抑制作用，并能夠誘導(dǎo)人血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡。

普萘諾爾；血管內(nèi)皮細(xì)胞；細(xì)胞增殖；凋亡；抑制

血管瘤是嬰幼兒期最常見的良性腫瘤，是由血管內(nèi)皮細(xì)胞異常增殖導(dǎo)致的。血管瘤好發(fā)于面頸部，可能影響面部器官功能及外觀，甚至危及生命。偶然發(fā)現(xiàn)的β受體阻斷劑普萘洛爾可以治療血管瘤，于2008年首次被報(bào)道[1]，使口服普萘洛爾成為治療血管瘤的一種新方法。這種方法療效確切，患者耐受較好，但對(duì)其治療機(jī)制不甚明確。本研究采用體外實(shí)驗(yàn)，通過觀察普萘洛爾對(duì)人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECS）增殖及凋亡的影響，探討了普萘洛爾治療血管瘤的可能作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 HUVECS細(xì)胞株，購(gòu)自武漢大學(xué)典型物種保存中心；鹽酸普萘洛爾，購(gòu)自華中藥業(yè)股份有限公司；Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京碧云天公司；流式細(xì)胞儀(CyFlow RML型)購(gòu)自德國(guó)PAR TEC公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法 將液氮中凍存HUVECS細(xì)胞解凍復(fù)蘇后，加入適量的培養(yǎng)基,1000 r/min離心5 min，棄去上清液，再次加入培養(yǎng)基，調(diào)整細(xì)胞濃度至1× 105個(gè)/cm3后，將細(xì)胞接種于培養(yǎng)板中，傳代培養(yǎng)至第3代，調(diào)整細(xì)胞密度為2×105個(gè)/cm3，分裝至培養(yǎng)板，實(shí)驗(yàn)組加入不同濃度普萘洛爾 （32、64、128和256 μg/ml），每組3個(gè)復(fù)孔，對(duì)照組不加藥物只加細(xì)胞及培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

1.2.1 MTT法檢測(cè)HUVECS抑制率 各組細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，每孔加入5 g/L MTT溶液10 μl，繼續(xù)培養(yǎng)4 h；吸出孔內(nèi)培養(yǎng)液，每孔加入DMSO 200 μl(0.5 g/L），于室溫下振蕩10 min。酶標(biāo)儀檢測(cè)波長(zhǎng)490 nm處的每孔吸光度(OD值）。空白孔僅加培養(yǎng)液，繪制HUVECS生長(zhǎng)曲線，計(jì)算普萘洛爾對(duì)HUVECS的抑制率。

1.2.2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)HUVECS凋亡率 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HUVECS細(xì)胞，接種于6孔板，加入2 ml 含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h，達(dá)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后，再用不含血清的培養(yǎng)基饑餓培養(yǎng)，使細(xì)胞同步化到達(dá)G0期，更換培養(yǎng)基并加入普萘洛爾共2 ml，使藥物濃度為32、64、128和256 μg/ml。藥物作用細(xì)胞24 h后，吸出至2個(gè)1.5 ml的EP管中，各用1 ml PBS洗滌貼壁細(xì)胞2次，加入胰酶消化，200 μl PBS重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為1×106個(gè)/ml; 取100 μl細(xì)胞至5 ml管，加入200 μl annexin-VFITC；20～25℃水浴箱中避光孵育30 min后,加入10 μl碘化丙啶染色液（PI）混勻，加入1 ml PBS，隨即進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)HUVECS凋亡率。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用 SPSS19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用單因素方差分析檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 普萘洛爾對(duì)體外培養(yǎng)HUVECS形態(tài)的影響普萘洛爾作用于HUVECS 24 h后，倒置顯微鏡下觀察，部分細(xì)胞梭形變?yōu)椴灰?guī)則，細(xì)胞間隙增大，細(xì)胞黏附力降低，可見核分裂相及細(xì)胞碎片（圖1）。

圖1 普萘洛爾對(duì)HUVECS形態(tài)的影響（×100）

2.2 普萘洛爾對(duì)HUVECS生長(zhǎng)的抑制率 從表1可見，隨著普萘洛爾濃度的提高，對(duì)HUVECS生長(zhǎng)的抑制率逐漸增高。當(dāng)濃度＞128 μg/ml時(shí)，對(duì)HUVECS增殖抑制作用明顯，抑制率與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）。

2.3 普萘洛爾誘導(dǎo)HUVECS凋亡的檢測(cè)結(jié)果隨著普萘洛爾濃度升高，HUVECS凋亡率增加，普萘洛爾濃度達(dá)到128 μg/ml后，早期凋亡細(xì)胞和凋亡細(xì)胞總數(shù)計(jì)數(shù)中，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組比較均有明顯差異(P＜0.05，圖2、表2)。

圖2 普萘洛爾誘導(dǎo)HUVECS凋亡流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果

3 討論

作為嬰幼兒期常見的良性腫瘤，嬰幼兒血管瘤（infantile hemangiomas，IH）60%發(fā)生在面頸部[2]，它是由血管內(nèi)皮細(xì)胞異常增殖引起，臨床可分為增殖期、消退期和消退后期。雖然IH大都可以自然消退，因好發(fā)于面頸部，影響患兒容貌；如位于眼部、呼吸道的IH，可能會(huì)引起器官的功能障礙（如弱視、呼吸受阻）；同時(shí)常伴發(fā)潰瘍、出血等。雖然可以自然消退，但部分會(huì)遺留有色素異常、皮膚皺縮等并發(fā)癥，故目前學(xué)者多建議在增殖期行早期干預(yù)治療[2]。Leaute-Labreze等[1]于無(wú)意中發(fā)現(xiàn)β受體阻滯劑普萘洛爾可用于嬰幼兒血管瘤治療,隨后立即得到了推廣并取得了良好的效果[3-4]，并建議將普萘諾爾取代皮質(zhì)類固醇激素成為IH治療一線藥物[1,5]。雖然目前有大量文獻(xiàn)報(bào)道了普萘諾爾對(duì)IH的良好臨床治療結(jié)果，但對(duì)于其治療機(jī)制仍知之甚少。

為探討普萘諾爾對(duì)血管瘤的作用機(jī)制，本研究檢測(cè)了普萘諾爾體外對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡和增殖的影響，通過對(duì)體外HUVECS的培養(yǎng)，并以MTT實(shí)驗(yàn)觀察了普萘諾爾對(duì)HUVECS增殖的作用，發(fā)現(xiàn)128 μg/ml以上濃度對(duì)HUVECS的增殖有明顯的抑制作用。流式細(xì)胞儀檢測(cè)的結(jié)果顯示，隨著普萘諾爾濃度的增加，HUVECS凋亡率逐漸提高，早期凋亡率和晚期凋亡率均逐漸增高，128 μg/ml以上濃度與對(duì)照組比較有明顯促進(jìn)凋亡作用，呈現(xiàn)出劑量依賴效應(yīng)。

普萘諾爾可能是通過下調(diào)VEGF的mRNA表達(dá)，減低血管內(nèi)皮細(xì)胞的VEGF表達(dá)，從而抑制HUVECS增殖和分化[6-7]。血管內(nèi)皮細(xì)胞可以表達(dá)β腎上腺素能受體，刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖[8]，而β受體阻滯劑普萘諾爾則可以拮抗β腎上腺素能受體，阻止細(xì)胞增殖。另有體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)，普萘諾爾可以通過影響有絲分裂原激活蛋白激酶MAPK和蛋白激酶A（PKA）/花生四烯酸（AA）細(xì)胞信號(hào)通路，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[6]。又有學(xué)者認(rèn)為，普萘諾爾在下調(diào)VEGF的合成同時(shí)，還可促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞脂肪化，而不是促進(jìn)其凋亡[9]。

由此可見，普萘諾爾治療血管瘤的機(jī)制和對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的影響還不是十分清楚，尚需進(jìn)一步研究。

[1] Leaute-Labreze C,Dumas de la Roque E,Hubiche T,et al. Propranolol for Severe Hemangiomas of Infancy[J].N Eng J Med, 2008,358(24):2649.

[2] 中華口腔醫(yī)學(xué)會(huì)口腔頜面外科專業(yè)委員會(huì)脈管性疾病學(xué)組.口腔頜面部血管瘤和脈管畸形治療指南 [J].中華醫(yī)學(xué)雜志, 2011,9(1):61-67.

[3] Bonifazi E,Colonna V,Mazzotta F,et al.Propranolol in rapidly growing hemangiomas[J].Eur J Pediatr Dermatol,2008,18(3): 185.

[4] 熊師,羅俊,周立軍,等.普萘洛爾在嬰幼兒眼部血管瘤中的應(yīng)用[J].國(guó)際眼科雜志,2012,12(1):157-158.

[5] Holmes WJM,Mishra A,Gorst C,et al.Propranolol as first-line treatment for rapidly proliferating infantile haemangiomas[J].J Plast Reconstr Aesthet Surg,2011,64(4):445-451.

[6] Lamy S,Lachambre MP,Lord-Dufour S,et al.Propranolol suppresses angiogenesis in vitro:inhibition of proliferation, migration,and differentiation of endothelial cells[J].Vascul Pharmacol,2010,53(5):200-208.

[7] Ji Y,Li K,Xiao X,et al.Effects of propranolol on the proliferation and apoptosis of hemangioma-derived endothelial cells[J].J Pediatr Surg,2012,47(12):2216-2223.

[8] Sans V,de la Roque ED,Berge J,et al.Propranolol for severe infantile hemangiomas:follow-up report[J].Pediatrics,2009,124 (3):423-431.

[9] Ma Xiaorong,Zhao Tinghui,Ouyang Tianxiang,et al.Propranolol enhanced adipogenesis instead of induction of apoptosis of hemangiomas stem cells[J].Int J Clin Exp Pathol,2014,7(7): 3809-3817.

Effects of propranolol on apoptosis and proliferation of vascular endothelial cells in vitro

Zhang Dingtao,He Huixia,Yang Shuyong,Wu Po,Jiang Ji,Zheng Weiyin Department of Stomatology,General Hospital of Chengdu Military Command,Chengdu,Sichuan,610083,China

ObjectiveTo explore the effects of propranolol in different concentrations on the proliferation and apoptosis of human vascular endothelial cell in vitro in order to provide reference for the research on the mechanism of the treatment on hemangioma with propranolol.MethodsUnfrozen HUVECSs were cultured in vitro and made into unicell suspension after trypsinization.After conventional culture,different concentration of propranolol was added for the intervention when the culture had reached the logarithmic phase.24 h later,the growth rates of the cells were detected by MTT,and the apoptosis rates were tested by flow cytometry instrument Annexin V-FI.ResultsAfter the cells were treated for 24 h,propranolol with the concentration of 128 μg/ml and above could significantly inhibite the proliferation of the HUVECSs and increase the apoptosis.ConclusionPropranolol can effectively inhibit the proliferation of human vascular endothelial cells and promote the apoptosis．

propranolol;vascular endothelial cell;cell proliferation;apoptosis;inhibition

R 732.2

A

1004-0188（2016）04-0370-04

10.3969/j.issn.1004-0188.2016.04.008

2016-01-07）

610083成都,成都軍區(qū)總醫(yī)院口腔科

鄭維銀，E-mail:weiyinzheng@hotmail.com