汪海濤，楊 波，盧學春，胡 博，楊紅旗，羅龍龍，林 潔，李素霞，范 輝，喬春霞，王 巍，郎曉玲，耿 晶，黎 燕，吳曉雄，呂 明，朱宏麗

（1.中國人民解放軍總醫(yī)院老年血液科，北京 100853；2.軍事醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所免疫學研究室，北京 100850；3.中國人民解放軍總醫(yī)院第一附屬醫(yī)院血液科，北京 100048；4.北京大學腫瘤醫(yī)院胸外科，北京 100142）

氨磷汀對人巨核細胞白血病Dami細胞增殖及分化的影響

汪海濤1，2，3，楊 波1，盧學春1，胡 博2，4，楊紅旗1，羅龍龍2，林 潔1，李素霞1，范 輝1，喬春霞2，王 巍2，郎曉玲2，耿 晶2，黎 燕2，吳曉雄3，呂 明2，朱宏麗1

（1.中國人民解放軍總醫(yī)院老年血液科，北京 100853；2.軍事醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所免疫學研究室，北京 100850；3.中國人民解放軍總醫(yī)院第一附屬醫(yī)院血液科，北京 100048；4.北京大學腫瘤醫(yī)院胸外科，北京 100142）

目的探討氨磷?。ㄒ懒蛄姿?，Amf）對人巨核細胞白血病Dami細胞分化的影響。方法Amf 0.01 ～5.0 mmol·L-1分別處理Dami細胞12 d，每天光鏡下觀察細胞形態(tài)，計數(shù)Dami細胞數(shù)量，繪制增殖曲線；第12天，計數(shù)直徑>20 μm細胞數(shù)量，透射電鏡觀察Dami細胞血小板分界膜系統(tǒng)的形成，流式細胞儀檢測細胞DNA倍體化及細胞表面抗原CD33，CD34和CD41a的變化。結果Amf 0.1 ～1.0 mmol·L-1促進Dami細胞分化；Amf>1.0 mmol·L-1時抑制Dami細胞增殖，Amf 1.0 mmol·L-1作用12 d后光鏡下觀察到細胞體積增大，直徑>20 μm細胞比例增加24.6%（P<0.01）；透射電鏡觀察可見細胞出現(xiàn)血小板分界膜系統(tǒng)；流式細胞儀發(fā)現(xiàn)，髓系細胞分化抗原CD33表達減少13.6%；巨核細胞相關分化抗原CD41a表達增加11.9%（P< 0.05）；DNA倍體分析發(fā)現(xiàn)，實驗組4N和8N細胞分別增至31.56%和8.83%（P<0.01），并出現(xiàn)16N的超多倍體細胞（3.43%）。結論Amf>1.0 mmol·L-1時抑制Dami細胞增殖，0.1 ～1.0 mmol·L-1時誘導Dami細胞向成熟巨核細胞分化。

氨磷??；Dami細胞；細胞分化；CD41a；DNA倍體化

氨磷?。ㄒ懒蛄姿幔琣mifostine，Amf），化學名2-（3-氨基丙胺基）-乙硫醇磷酸酯，于20世紀60年代由美國Walter Reed陸軍研究所研發(fā)，用于核輻射損傷的防護。作為一種前體藥物，Amf只有在細胞膜堿性磷酸酶作用下脫去磷酸基，生成游離硫醇后才有活性［1］。目前，Amf也用于減輕放化療過程中腎、骨髓、黏膜、耳及神經(jīng)系統(tǒng)毒性［2-4］。

臨床研究發(fā)現(xiàn)，Amf對血細胞減少性疾病，如骨髓增生異常綜合征（myelodysplastic syndrome，MDS）和免疫性血小板減少癥（immune thrombocytopenia，ITP）有一定療效，2種均有巨核細胞的病態(tài)造血或分化成熟障礙，Amf治療后患者血小板有不同水平的升高［5-8］。這種作用并不能用Amf經(jīng)典的堿性磷酸酶途徑解釋，我們設想Amf可能通過促進巨核細胞的分化成熟，從而對MDS和ITP等存在巨核細胞分化障礙的疾病起到治療作用。

為了驗證Amf對Dami細胞的分化作用，本研究先用不同濃度Amf誘導Dami細胞，得到Amf促進Dami細胞分化的合適濃度，然后從細胞形態(tài)學，分化抗原和DNA倍體化3個方面驗證了Amf對Dami細胞分化的作用。

1 材料與方法

1.1藥物、細胞、試劑和儀器

Amf，純度>99%，大連卓悅美羅藥業(yè)有限公司，4℃避光保存，每次使用時配制成液體。Dami細胞來源于美國ATCC公司，由軍事醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所免疫學研究室凍存。RPMI 1640培養(yǎng)基，美國Hyclone公司；5%戊二醛，美國Sigma公司；小鼠抗人CD41a-PE抗體（批號：340931）和碘化丙啶（propidium iodide，PI）（批號：P4170），美國Santa Cruz公司；小鼠抗人CD33-PC5(批號:53199)、小鼠抗人CD34-PE抗體(批號:3569)，美國CST公司。3111型CO2培養(yǎng)箱，美國Thermo公司；CK40型倒置熒光顯微鏡，日本Olympus公司；5417R型高速離心機，德國Eppendorf公司；流式細胞儀，美國BD公司。

1.2細胞培養(yǎng)及增殖檢測

Dami細胞在含10%加熱滅活的胎牛血清和雙抗的RPMI 1640培養(yǎng)基中呈懸浮生長，37℃，含5%CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)。將細胞濃度調整為5×108L-1，于6孔板中培養(yǎng)，分別調整Amf濃度為0.01，0.1，1.0和5.0 mmol·L-1，每2 d傳代1次，每天計Dami細胞數(shù)，連續(xù)12 d，繪制增殖曲線。

1.3光學顯微鏡觀察細胞形態(tài)

Amf 1.0 mmol·L-1誘導Dami細胞0，4，8和12 d，于倒置顯微鏡下觀察，隨機取3個視野，記錄細胞直徑>20 μm的細胞數(shù)量，并照相記錄。

1.4透射電鏡觀察細胞血小板分界膜系統(tǒng)形成

血小板分界膜系統(tǒng)由巨核細胞膜深度凹陷形成，是分割形成血小板的前提條件，也是巨核細胞成熟的標志。在Amf 1.0 mmol·L-1誘導Dami細胞第12天，取2×106細胞，5%戊二醛固定，磷酸鹽緩沖液100 mmol·L-1（pH=7.2）洗1遍，四氧化鋨固定后溶于環(huán)氧樹脂膠，切片后進行醋酸鈾和檸檬酸鉛染色，透射電鏡觀察。

1.5流式細胞儀檢測細胞CD33，CD34和CD41a的表達

在Amf 1.0 mmol·L-1誘導的第12天，收集約1× 106細胞于EP管，4℃預冷的PBS洗1遍，分別加入100 μL小鼠抗人CD41a/CD33/CD34抗體，槍尖吹勻，37℃避光孵育30 min；PBS洗3遍，流式細胞儀檢測。

其次，政策的系統(tǒng)性和配套性增強。任何一個政策都不是孤立存在的，縱觀四十年來養(yǎng)老服務政策的出臺，發(fā)現(xiàn)養(yǎng)老服務政策的系統(tǒng)性越來越強，通常是圍繞一個主題的政策會有一系列的《意見》《通知》作為支撐和配套，形成一個文件群，以文件的形式將宏觀導向、發(fā)展思路、具體規(guī)定和實際做法制度化，既保證了政策的連貫性和延續(xù)性，也推動了宏觀政策的具體實施和落地見效，增強了政策制度的針對性、協(xié)調性、系統(tǒng)性。

1.6流式細胞儀檢測細胞DNA倍體化

在Amf 1.0 mmol·L-1誘導的第0，4，8和12天分別收集2×106細胞，-20℃預冷的PBS洗1遍，加入75%乙醇2 mL，-20℃固定24 h；PBS洗1遍，加RNA酶1 g·L-1100 μL，37℃避光30 min，加入PI染液0.1 g·L-1100 μL，室溫避光5 min，流式細胞儀檢測，Cell quest pro軟件分析細胞倍體化。

1.7統(tǒng)計學分析

使用SPSS13.0軟件包分析，計量資料用x±s表示，兩組之間均數(shù)比較采用t檢驗，等級資料用Wilcoxon檢驗，P<0.05認為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1氨磷汀對Dami細胞增殖的影響

增殖曲線結果顯示（圖1），和正常對照組相比，Amf濃度<0.01 mmol·L-1時，Dami細胞增殖不受影響；而>1.0 mmol·L-1時，Dami細胞增殖受到抑制（P<0.05）。

Fig.1 Effect of amifostine（Amf）on proliferation of Dami cells determined by cell counting.x±s，n=3.*P< 0.05，compared with normal control group.

2.2氨磷汀對Dami細胞形態(tài)的影響

Fig.2 Effect of Amf 1.0 mmol·L-1on morphology of Dami cells（A）and proportion of Dami cells with diameter>20 μm（B）.See Fig.1 for the treatment.x±s，n=3. **P<0.01，compared with normal control group.

Dami細胞向巨核細胞分化過程中，細胞體積逐漸增大，并>20 μm［9］。顯微鏡下隨機選取3個視野，計數(shù)直徑>20 μm細胞的比例（圖2），和正常對照組相比，Amf 1.0 mmol·L-1誘導12 d后，直徑>20 μm的Dami細胞比例由0.2%增加至24.8%（P<0.01）。后續(xù)實驗選用Amf 1.0 mmol·L-1誘導Dami細胞分化。

2.3氨磷汀對血小板分界膜系統(tǒng)形成的影響

透射電鏡觀察血小板分界膜系統(tǒng)（圖3），結果顯示，與正常對照細胞相比，在Amf 1.0 mmol·L-1處理第12天，電鏡觀察見Dami細胞胞體明顯增大，直徑可達約100 μm，細胞邊緣不規(guī)則，呈海綿狀。提示Amf能促進Dami細胞向成熟巨核細胞分化。

Fig.3 Effect of Amf 1.0 mmol·L-1for 12 d on platelet demarcation membrane system in Dami cells by transmission electron microscopy.Arrows indicate the platelet demarcation membrane system.

2.4氨磷汀對Dami細胞CD33，CD34和CD41a表達的影響

Fig.4 Effect of Amf 1.0 mmol·L-1for 12 d on expression of CD33（A），CD34（A）and CD41a（B）on Dami cell surface by flow cytometric analysis.C was the semi-quantitative result of A and B.x±s，n=3.*P<0.05，compared with normal control group.

流式細胞儀檢測結果（圖4）顯示，兩組Dami細胞表面CD34表達均很弱，<0.1%，未作比較。與正常對照細胞相比，Amf 1.0 mmol·L-1誘導第12天，Dami細胞表面髓系抗原CD33的表達減少13.6%（P< 0.05），而巨核細胞成熟相關抗原CD41a的表達增加11.9%（P<0.05）。

2.5氨磷汀對Dami細胞DNA倍體化的影響

細胞DNA倍體分布檢測結果（圖5）表明，在Amf 1.0 mmol·L-1誘導的第0天（正常對照組）以2N和4N為主，分別占62.46%和15.63%，而8N和16N細胞的比例分別占0.21%和0.02%。隨著時間延長（第4，8和12天），多倍體細胞逐漸增加；在誘導第12天，與正常對照組相比，4N和8N細胞比例分別增加至31.56%和8.83%，并出現(xiàn)16N細胞，占3.43%（P<0.01）。

Fig.5 Effect of Amf 1.0 mmol·L-1for indicated number of days on DNA ploidy in Dami cells.B was the semiquantitative result of A.x±s，n=3.*P<0.05，**P<0.01，compared with normal control（0 d）group.

3 討論

本研究單獨應用Amf誘導Dami細胞，發(fā)現(xiàn)Amf具有促進Dami細胞分化的作用。有關Amf促進巨核細胞分化作用最早由Kashiwakura等［10］報道，他們用Amf聯(lián)合血小板生成素（thrombopoietin，TPO）在體外誘導胎盤及臍帶血CD34+細胞向巨核細胞分化，發(fā)現(xiàn)和TPO組相比，巨核系祖細胞數(shù)量分別增加70倍和83倍。但他們采用Amf聯(lián)合TPO誘導細胞分化，不能直接說明Amf具有促進細胞分化的作用。

本研究Dami細胞直徑約在10 ～15 μm，處于原始巨核細胞階段，在Amf處理第4天，開始出現(xiàn)4N細胞，同時細胞體積增大至>20 μm。在處理第12天，直徑>20 μm細胞比例達24.8%，倍體在>4N細胞占43.8%，且透射電鏡觀察到血小板分界膜系統(tǒng)出現(xiàn)，說明Amf具有誘導Dami細胞向成熟巨核細胞分化的作用。成熟巨核細胞由造血干細胞經(jīng)巨核/紅系祖細胞、巨核系祖細胞、原始巨核細胞、幼巨核細胞和顆粒型巨核細胞等階段分化而來。巨核細胞的成熟過程伴隨著細胞體積及染色體倍體的增加。據(jù)報道，原始巨核細胞染色體倍體為2N，平均直徑約在20 μm，而幼稚巨核細胞階段開始出現(xiàn)多倍體，最多達8N，細胞直徑增大至約30 μm；成熟巨核細胞（顆粒型或產(chǎn)板型）倍體通常>32N，細胞體積巨大，>40 μm，且出現(xiàn)血小板分界膜系統(tǒng)［9，11］。本研究Dami細胞經(jīng)過Amf 1.0 mmol·L-1處理12 d后，細胞體積增大，倍體增加，并出現(xiàn)血小板分界膜系統(tǒng)，與文獻［9，11］報道相符。

人紅系和巨核系有著共同的祖細胞，即巨/紅系祖細胞，表型為Lin-CD34+CD33+D38+IL3Rα-CD45RA-［12］，當分化為成熟巨核細胞時，細胞表面CD33和CD34的表達降低，而CD41a，CD42b，CD45和CDw32等表達升高［11，13］。其中，CD41a是巨核細胞分化成熟的特征性分子標志，在巨核細胞分化過程中始終表達，其表達強度和巨核細胞分化成熟程度相關［14］。本研究分別在Amf誘導的第0，4，8和12天，通過流式細胞儀檢測Dami細胞表面CD41a表達水平，發(fā)現(xiàn)隨著Amf處理時間延長，Dami細胞表面CD41a表達強度逐漸增加，而CD33表達強度逐漸降低，符合巨核細胞的分化規(guī)律。

本研究結果表明，Amf具有誘導Dami細胞分化的作用，但Amf促進Dami細胞分化的分子機制尚不清楚。下一步將通過基因芯片技術檢測Amf處理前后Dami細胞基因表達譜差異，進一步研究Amf誘導Dami細胞分化的機制，為臨床應用Amf治療血小板生成障礙性疾病提供理論依據(jù)。

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Effect of amifostine on proliferation and differentiation of human megakaryocyte Dami cells

WANG Hai-tao1，2，3，YANG Bo1，LU Xue-chun1，HU Bo2，4，YANG Hong-qi1，LUO Long-long2，LIN Jie1，LI Su-xia1，F(xiàn)AN Hui1，QIAO Chun-xia2，WANG Wei2，LANG Xiao-ling2，GENG Jing2，LI Yan2，WU Xiao-xiong3，LYU Ming2，ZHU Hong-li1
（1.Department of Geriatric Hematology，Chinese PLA General Hospital，Beijing 100853，China；2.Laboratory of Immunology，Institute of Basic Medical Sciences，Academy of Military Medical Sciences，Beijing 100850，China；3.Department of Hematology，the First Affiliated Hospital of Chinese PLA General Hospital，Beijing 100048，China；4.Department of Thoracic Surgery，Peking University Cancer Hospital&Institute，Beijing 100142，China）

OBJECTIVE To investigate the effect of amifostine（Amf）on the differentiation of human megakaryocyte cell line-Dami.METHODS Dami cells were treated with Amf 0.01-5.0 mmol·L-1for 12 d. Dami cells were counted every day for the growth curve：only cells with a diameter>20 μm.The platelet demarcation membrane system was observed by transmission electron microscopy.The expression of CD33，CD34，CD41a and DNA ploidy was detected by flow cytometry.RESULTS Amf 0.1-1.0 mmol·L-1promoted the differentiation of Dami cells，but inhibited their proliferation at a concentration>1.0 mmol·L-1. When these cells were treated with Amf 1.0 mmol·L-1for 12 d，the platelet demarcation membrane system was observed，the percentage of cells with a diameter>20 μm was increased by 24.6%（P< 0.01），the expression of CD41a was increased by 11.9%，while the expression of CD33 was decreased by 13.6%（P<0.05）.Polyploidy cells（16N）were observed，and 4N，8N and 16N cells were increased to 31.56%，8.83%and 3.43%，respectively（P<0.05）.CONCLUSION Amf 0.1-1.0 mmol·L-1can promote the differentiation of Dami cells，but inhibit their proliferation at a high concentration（>1.0 mmol·L-1）.

amifostine；Dami cells；cell differentiation；CD41a；DNA ploidy

s：ZHU Hong-li，E-mail：bjzhl202_cn@sina.com，Tel：（010）66876267；LYU Ming，E-mail：lm62033@ 163.com，Tel：（010）66931325；

R979.6，R973

A

1000-3002-（2016）07-0723-05

10.3867/j.issn.1000-3002.2016.07.003

Foundation item：The project supported by National Natural Science Foundation of China（81273597）；Innovation and Nursery Foundation of Chinese PLA General Hospital（15KMM28）；and Military Health Care Foundation（13BJ247）

2016-04-12接受日期：2016-06-22）

（本文編輯：賀云霞）

國家自然科學基金項目（81273597）；解放軍總醫(yī)院科技創(chuàng)新苗圃基金（15KMM28）；全軍保健基金（13BJ247）

汪海濤，男，碩士，主要從事血液病的基礎與臨床研究，E-mail：ws_ht@126.com；朱宏麗，女，主任醫(yī)師，主要從事老年血液病的基礎與臨床研究。

朱宏麗，E-mail：bjzhl202_cn@sina.com，Tel：（010）66876267；呂 明，Tel：（010）66931325，E-mail：lm62033@163.com