陳文培，張子揚(yáng)，周成浩，劉 涵，胥 彤，郭宇琳，林寶琴

（廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，廣東廣州 510006）

·實(shí)驗(yàn)方法·

大鼠被動(dòng)皮膚過(guò)敏反應(yīng)實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化

陳文培，張子揚(yáng)，周成浩，劉 涵，胥 彤，郭宇琳，林寶琴

（廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，廣東廣州 510006）

目的通過(guò)卵白蛋白（OVA）致敏大鼠優(yōu)化被動(dòng)皮膚過(guò)敏反應(yīng)（PCA）的實(shí)驗(yàn)條件。方法1 ～2月齡SD大鼠ip給予OVA（每只0.2，1.0和5.0 mg）與弗氏完全佐劑的混合乳液，隔日1次，共3次，進(jìn)行致敏。分別于末次致敏后1，3，5，7，10，12，14，16和18 d用ELISA檢測(cè)血清總IgE（T-IgE）水平和OVA特異性IgE（OVA-sIgE）水平。大鼠致敏后12 ～16 d制備致敏血清。大鼠皮內(nèi)注射致敏血清被動(dòng)皮膚致敏后，于0.5，1.5，3，6，12，24，36，48和60 h后iv給予同等劑量OVA和伊文思藍(lán)激發(fā)，于激發(fā)后10，30和60 min測(cè)量大鼠皮膚藍(lán)斑直徑。結(jié)果OVA致敏大鼠血清T-IgE和OVA-sIgE水平分別于末次致敏后3 ～7 d和12 ～16 d達(dá)高峰；在OVA 0.2 ～5.0 mg劑量范圍內(nèi)，OVA-sIgE與T-IgE水平無(wú)明顯關(guān)聯(lián)性；OVA 1.0和5.0 mg致敏大鼠血清能誘發(fā)大鼠PCA；皮內(nèi)注射致敏血清0.5 ～3 h后激發(fā)的皮膚藍(lán)斑形態(tài)規(guī)則，范圍最大；激發(fā)后30 ～60 min檢測(cè)的皮膚藍(lán)斑范圍大，界線清晰，形狀規(guī)則，且著色較深。結(jié)論P(yáng)CA優(yōu)化條件為1 ～2月齡大鼠隔日每只ip給予OVA 1.0 ～5.0 mg，共致敏3次，致敏后12 ～16 d制備致敏血清。在被動(dòng)皮膚致敏0.5 ～3 h后，進(jìn)行激發(fā)，30 ～60 min后檢測(cè)皮膚內(nèi)層藍(lán)斑直徑。

卵白蛋白；Ⅰ型過(guò)敏反應(yīng)；IgE；被動(dòng)皮膚過(guò)敏反應(yīng)；大鼠

過(guò)敏反應(yīng)又稱超敏反應(yīng)。根據(jù)病理機(jī)制和臨床特點(diǎn)，過(guò)敏反應(yīng)分為4型，其中Ⅰ型過(guò)敏反應(yīng)由免疫球蛋白E（IgE）介導(dǎo)［1］，其機(jī)制為過(guò)敏原刺激呼吸道和消化道黏膜固有層淋巴組織中的B細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)闈{細(xì)胞，漿細(xì)胞釋放IgE抗體。IgE抗體與肥大細(xì)胞或嗜堿性粒細(xì)胞膜上的特異受體結(jié)合，使機(jī)體處于致敏狀態(tài)。當(dāng)相同過(guò)敏原再次進(jìn)入機(jī)體，接觸到結(jié)合了IgE的肥大細(xì)胞或嗜堿性粒細(xì)胞，則后者會(huì)“脫顆?！贬尫懦鲞^(guò)敏介質(zhì)如組胺和白三烯等，這些介質(zhì)刺激鄰近的血管或神經(jīng)，從而引起血管擴(kuò)張和平滑肌收縮等［2-3］。

用于評(píng)價(jià)藥物引起Ⅰ型過(guò)敏反應(yīng)的方法有主動(dòng)全身過(guò)敏反應(yīng)、主動(dòng)皮膚過(guò)敏反應(yīng)和被動(dòng)皮膚過(guò)敏反應(yīng)（passive cutaneous anaphylaxis，PCA）實(shí)驗(yàn)［1，4］。其中，PCA實(shí)驗(yàn)主要用于由IgE介導(dǎo)的過(guò)敏反應(yīng)的研究［4］，是研究藥物是否會(huì)產(chǎn)生Ⅰ型過(guò)敏反應(yīng)的較好方法。PCA的敏感動(dòng)物依次為BN大鼠、豚鼠和SD大鼠，較之于BN大鼠和豚鼠，SD大鼠盡管敏感性低于前兩者，但因其來(lái)源穩(wěn)定、價(jià)格便宜和便于飼養(yǎng)等，越來(lái)越受到國(guó)內(nèi)藥物安全評(píng)價(jià)工作者的重視和使用。然而，本實(shí)驗(yàn)室和不少其他GLP實(shí)驗(yàn)室根據(jù)我國(guó)2010年版《最新藥品注冊(cè)法規(guī)及指導(dǎo)原則》（簡(jiǎn)稱《原則》）中化學(xué)藥物刺激性、過(guò)敏性和溶血性研究技術(shù)指導(dǎo)原則［4］進(jìn)行多次PCA實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，即使是使用陽(yáng)性藥如卵白蛋白（ovalbumin，OVA）對(duì)大鼠進(jìn)行PCA實(shí)驗(yàn)，被動(dòng)皮膚致敏24或48 h激發(fā)時(shí)產(chǎn)生的皮膚藍(lán)斑邊界不清晰，難以定量，或有個(gè)別大鼠未出現(xiàn)藍(lán)斑。這一現(xiàn)象不利于準(zhǔn)確評(píng)價(jià)藥物的安全性。為此，本研究以SD大鼠為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，采用ip給予OVA與弗氏完全佐劑的混合乳液致敏，以期優(yōu)化PCA的實(shí)驗(yàn)條件。

1 材料與方法

1.1藥品、試劑和儀器

OVA和弗氏完全佐劑，德國(guó)Sigma公司；伊文思藍(lán)，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；OVA-特異性IgE（specific IgE，sIgE）酶聯(lián)免疫試劑盒，武漢華美生物工程有限公司；大鼠IgE ELISA試劑盒，日本Shibayagi公司。酶標(biāo)儀，美國(guó)Thermo Scientific公司。

1.2動(dòng)物

SPF級(jí)SD大鼠，雌雄兼用，體質(zhì)量為130 ～150 g，由廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供〔動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（粵）2013-0020〕，飼養(yǎng)于廣東藥科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)室〔場(chǎng)地設(shè)施使用許可證號(hào)：SYXK（粵）2012-0125〕。

1.3大鼠OVA致敏血清最佳致敏時(shí)間的考察

本實(shí)驗(yàn)共設(shè)2組，分別為正常對(duì)照組（4只大鼠）和OVA組（36只大鼠）。OVA組大鼠隔日ip給予OVA和弗氏完全佐劑混合乳液，每只5.0 mg OVA，給藥體積為每只1 mL（含OVA 0.5 mL，弗氏完全佐劑0.5 mL），共致敏3次。于末次致敏后1，3，5，7，10，12，14，16和18 d分別隨機(jī)取4只大鼠，用戊巴比妥鈉與賽拉嗪（xylazine）聯(lián)合麻醉后，頸動(dòng)脈采血，分離血清。正常對(duì)照組大鼠則以生理鹽水替代OVA，于末次注射后1 d采血，分離血清。嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說(shuō)明書操作，測(cè)定血清總IgE（total IgE，T-IgE）和OVA-sIgE水平。

1.4大鼠OVA致敏血清中T-IgE與OVA-sIgE檢測(cè)

大鼠隔日ip給予OVA進(jìn)行致敏，劑量為每只0.2，1.0和5.0 mg，給藥體積為每只1 mL（含OVA 0.5 mL，弗氏完全佐劑0.5 mL）。分別于末次致敏后3和12 d采血，分離血清。末次致敏后3 d分離的血清用于測(cè)定T-IgE水平，末次致敏后12 d分離的血清用于測(cè)定OVA-sIgE水平。

1.5最佳OVA劑量及皮內(nèi)注射致敏血清后最佳激發(fā)時(shí)間考察

大鼠分別隔日ip給予OVA，劑量為每只0.2，1.0和5.0 mg，給藥體積為每只1 mL（含OVA 0.5 mL，弗氏完全佐劑0.5 mL）。末次致敏后12 d制備致敏血清。將各組大鼠的致敏血清進(jìn)行組內(nèi)等體積混合后，以生理鹽水按1∶0，1∶4和1∶16稀釋。各大鼠背部皮內(nèi)注射對(duì)應(yīng)致敏血清0.1 mL進(jìn)行被動(dòng)致敏。分別在皮膚被動(dòng)致敏0.5，1.5，3，6，12，24，36，48和60 h后，靜脈注射與致敏劑量相同的OVA加等體積的1%伊文思藍(lán)染料共1 mL進(jìn)行激發(fā)，激發(fā)后30 min用5倍麻醉劑量戊巴比妥鈉活殺大鼠，測(cè)量皮膚內(nèi)層的斑點(diǎn)大小，直徑大>5 mm者為陽(yáng)性。

1.6最佳PCA檢測(cè)時(shí)間考察

大鼠隔日ip給予OVA，每只5.0 mg，給藥體積為每只1 mL（含OVA 0.5 mL，弗氏完全佐劑0.5 mL）。末次致敏后12 d制備致敏血清。將各組大鼠的致敏血清進(jìn)行組內(nèi)等體積混合后，以生理鹽水按1∶0，1∶4，1∶16和1∶32稀釋，各大鼠背部皮內(nèi)注射對(duì)應(yīng)致敏血清0.1 mL進(jìn)行被動(dòng)致敏。在皮膚被動(dòng)致敏30 min后，各大鼠靜脈注射與致敏劑量相同的OVA加等體積的1%伊文思藍(lán)染料共1 mL進(jìn)行激發(fā)，分別在激發(fā)后10，30和60 min用5倍麻醉劑量戊巴比妥鈉活殺大鼠，測(cè)量皮膚內(nèi)層的藍(lán)色斑點(diǎn)直徑。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)用x±s表示，采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用單因素方差分析，多組間兩兩比較用LSD法，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1制備大鼠OVA致敏血清的最佳時(shí)間

由圖1可知，與正常對(duì)照組比較，末次致敏后3 ～14 d大鼠血清T-IgE水平顯著升高（P<0.01）；末次致敏后3 d，血清OVA-sIgE水平顯著增加（P< 0.01），12 ～16 d達(dá)到最高。因此，檢測(cè)致敏血清中T-IgE水平的時(shí)間應(yīng)在末次致敏后3 ～7 d。致敏血清制備的時(shí)間則根據(jù)OVA-sIgE水平，結(jié)合2010年版《原則》中化學(xué)藥物刺激性、過(guò)敏性和溶血性研究技術(shù)指導(dǎo)原則，以末次致敏后12 ～16 d為宜。

Fig.1 Total IgE（T-IgE）（A）and ovalbumin（OVA）-specific IgE（OVA-sIgE）（B）levels in serum of rats after final immunization with OVA.The rats were ip given OVA 5.0 mg per rat，once every other day，for 3 times，and then serum T-IgE and OVA-sIgE were detected at indicated time after final immunization.x±s，n=4.**P<0.01，compared with normal control group.

2.2大鼠OVA致敏血清中T-IgE與OVA-sIgE水平的關(guān)聯(lián)性

由圖2可知，與正常對(duì)照組比較，OVA各劑量組的T-IgE（P<0.05）和OVA-sIgE（P<0.01）水平均顯著提高。在OVA每只0.2 ～5.0 mg劑量范圍內(nèi)，兩者水平與OVA劑量均無(wú)明顯相關(guān)性，兩者水平無(wú)明顯關(guān)聯(lián)性。

Fig.2 Levels of serum T-IgE（A）and OVA-sIgE（B）in rats after final immunization with OVA.The rats were ip given OVA 0，0.2，1.0 and 5.0 mg per rat，respectively，once every other day，for 3 times.Serum IgE was detected on the 3rdday（T-IgE）and the 12thday（OVA-sIgE）after final immuni?zation，respectively.x±s，n=3-4.*P<0.05，**P<0.01，compared with normal control group.

2.3最佳OVA致敏劑量及皮內(nèi)注射致敏血清后最佳激發(fā)時(shí)間

由圖3、表1和表2可知，正常對(duì)照組大鼠激發(fā)后背部皮膚均未出現(xiàn)藍(lán)斑（圖3A），PCA發(fā)生率為0。OVA每只1.0和5.0 mg劑量組0.5 ～3 h激發(fā)大鼠背部皮膚均出現(xiàn)直徑>5 mm藍(lán)斑，藍(lán)斑界線清晰，形狀規(guī)則，且著色較深（圖3B1 ～3，圖3C1 ～3），PCA發(fā)生率為100%。OVA每只1.0 mg和5.0 mg劑量組6 h激發(fā)大鼠均發(fā)生PCA，背部皮膚均出現(xiàn)直徑>5 mm的藍(lán)斑，藍(lán)斑界線不清晰，形狀不規(guī)則（圖3B4，圖3C4）。OVA每只1.0 mg劑量組12 ～24 h激發(fā)大鼠和每只5.0 mg劑量組12 ～48 h激發(fā)大鼠背部皮膚可出現(xiàn)直徑>5 mm的藍(lán)斑，但大部分藍(lán)斑呈彌漫狀，著色隨皮內(nèi)注射時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸變淡（圖B5 ～6，圖3C5 ～8），PCA發(fā)生率未達(dá)100%。每只1.0 mg劑量組48 h激發(fā)大鼠背部皮膚均未出現(xiàn)直徑>5 mm的藍(lán)斑（圖3B7），PCA發(fā)生率為0。每只0.2 mg劑量組激發(fā)后僅小部分大鼠背部皮膚出現(xiàn)直徑>5 mm藍(lán)斑（圖略）。由此可見(jiàn)，OVA劑量為每只1.0和5.0 mg能誘發(fā)大鼠PCA反應(yīng)，最佳激發(fā)時(shí)間為皮內(nèi)注射致敏后0.5 ～3 h。

Fig.3 Blue spots in skin of rats stimulated by OVA 1.0 mg(B)and 5.0 mg(C)per rat.The rats were ip given OVA 1.0 and 5.0 mg per rat respectively,once every other day，for 3 times.Serum was collected on the 12thday after final immunization and diluted at the ratio of 1∶0,1∶4 and 1∶16.The rats were sensitized by different diluted serum 0.1 mL，and then stimulated by the same dose of OVA 0.5-60 h later.A:normal control;B1-B7:0.5,1.5,3,6,12,24 and 48 h stimulation;C1-C9:0.5,1.5,3,6,12,24,36,48 and 60 h stimulation.

Tab.1 Diameters of skin blue spot induced by OVA stimulation in rats

Tab.2 Positive rate of passive cutaneous anaphylaxis（PCA）induced by OVA stimulation in rats

2.4大鼠OVA激發(fā)后最佳PCA檢測(cè)時(shí)間

由表3可知，OVA激發(fā)后10，30和60 min，大鼠背部皮膚均出現(xiàn)直徑>5 mm藍(lán)斑，藍(lán)斑大小無(wú)明顯差異。但10 min組大鼠皮膚藍(lán)斑界線不清晰，顏色過(guò)淺；30和60 min組則藍(lán)斑界線清晰，形狀規(guī)則，著色較深。因此，宜在抗原激發(fā)后30 ～60 min進(jìn)行PCA檢測(cè)。

Tab.3 Diameter of blue spots in skin of rats after dif?ferent time of stimulation

3 討論

一般認(rèn)為，PCA的敏感動(dòng)物依次是BN大鼠、豚鼠和SD大鼠。雖然BN大鼠是最易產(chǎn)生IgE的大鼠品系［5］，但因繁殖率低，自發(fā)腫瘤率高，價(jià)格昂貴，限制了其在藥物安全性評(píng)價(jià)中的應(yīng)用。豚鼠的Ⅰ型過(guò)敏反應(yīng)可由IgE和IgG介導(dǎo)［6］，后者起主要作用，而這兩種Ig所介導(dǎo)的過(guò)敏反應(yīng)出現(xiàn)的時(shí)間和程度不一致，影響PCA結(jié)果。SD大鼠多次接觸致敏原也能產(chǎn)生抗體［7-8］，而該品系大鼠在我國(guó)最易購(gòu)買，且價(jià)格相對(duì)低廉，越來(lái)越受到藥物安全評(píng)價(jià)工作者的重視和使用。此外，大鼠年齡與IgE產(chǎn)生有一定關(guān)系，1 ～2月齡大鼠多次致敏產(chǎn)生的IgE水平最高，而3 ～12月齡大鼠致敏后產(chǎn)生IgE能力顯著減?。?］。因此，本研究選用1 ～2月齡，體質(zhì)量為150 ～ 170 g的SD大鼠進(jìn)行研究。

OVA比牛血清白蛋白和鑰孔血藍(lán)蛋白更易產(chǎn)生IgE抗體［5，8］。研究發(fā)現(xiàn)，使用大鼠進(jìn)行PCA的前提條件是加用佐劑［8，10］。常見(jiàn)佐劑主要有Al（OH）3、卡介苗、弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑。配制方法、實(shí)驗(yàn)重復(fù)性和試劑來(lái)源等問(wèn)題限制了Al（OH）3和卡介苗的使用。而Sigma等公司提供的市售弗氏完全佐劑質(zhì)量穩(wěn)定，使用方便。弗氏完全佐劑致敏大鼠后可產(chǎn)生體液免疫和細(xì)胞免疫反應(yīng)。因此，本研究選用了OVA和弗氏完全佐劑進(jìn)行研究。此外，盡管大鼠皮下注射和腹腔注射致敏可獲得等效的PCA結(jié)果，但腹腔注射致敏的動(dòng)物由于佐劑的慢性刺激，普遍出現(xiàn)腹腔內(nèi)腸黏膜炎性粘連和體質(zhì)量下降，個(gè)別出現(xiàn)睪丸紅腫［8］。所以，本研究若采用皮下注射致敏途徑進(jìn)行研究則更為可靠。

血清IgE水平與遺傳有關(guān)，受年齡、性別和種族影響［9］。本研究預(yù)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)血清T-IgE水平明顯受性別影響，雄性SD大鼠體內(nèi)的T-IgE水平較雌性高，對(duì)OVA刺激的反應(yīng)程度相近，而雌性大鼠對(duì)于OVA刺激所產(chǎn)生的IgE水平則存在明顯的個(gè)體差異。但是，雌雄大鼠受OVA刺激后所產(chǎn)生的sIgE并無(wú)明顯差異。

本研究結(jié)果表明，免疫后大鼠血清T-IgE水平和OVA-sIgE水平與過(guò)敏原的劑量無(wú)關(guān)，且同一劑量致敏后血清T-IgE水平和OVA-sIgE水平也無(wú)關(guān)聯(lián)性，這與之前的文獻(xiàn)報(bào)道一致［5］。這說(shuō)明不能通過(guò)檢測(cè)血清T-IgE水平來(lái)預(yù)測(cè)sIgE的水平。此外，研究中也發(fā)現(xiàn)，OVA每只0.2 mg劑量致敏產(chǎn)生的致敏血清中T-IgE和OVA-sIgE雖與OVA每只1.0和5.0 mg劑量無(wú)顯著差異，但在藍(lán)斑形成能力上明顯不如后兩者。其原因可能如下：①IgE的生成量與組胺釋放量無(wú)關(guān)聯(lián)性［11］；②血清sIgE檢測(cè)的是游離sIgE，而與過(guò)敏癥狀最直接相關(guān)的是與細(xì)胞結(jié)合的sIgE。也就是說(shuō)，血清sIgE水平并不能反映與細(xì)胞結(jié)合的sIgE的量。

經(jīng)過(guò)反復(fù)驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，皮內(nèi)注射OVA后最佳的激發(fā)時(shí)間為0.5 ～3 h，藍(lán)斑形狀規(guī)則，顏色反差明顯，范圍最大。此外，過(guò)敏發(fā)生陽(yáng)性率可達(dá)100%。皮內(nèi)注射6 ～48 h后再用OVA致敏原激發(fā)，則藍(lán)斑彌散，很難準(zhǔn)確測(cè)定藍(lán)斑范圍。這與之前大量的文獻(xiàn)報(bào)道不符。皮內(nèi)局部注射后會(huì)有一定的注射損傷，這可能會(huì)導(dǎo)致發(fā)生局部炎癥，致使血管通透性增加，產(chǎn)生假性藍(lán)斑。但是，本研究以同樣的操作重復(fù)多次，并未發(fā)現(xiàn)正常對(duì)照組大鼠出現(xiàn)藍(lán)斑。這證實(shí)了皮內(nèi)注射后0.5 ～3 h激發(fā)所出現(xiàn)的藍(lán)斑并非假陽(yáng)性結(jié)果。OVA致敏大鼠后產(chǎn)生的抗體有兩種亞型，即IgE和IgGa。如是IgE，則最佳致敏期長(zhǎng)，一般為24 ～48 h甚至更長(zhǎng)；如是IgGa，則最佳致敏期短，一般為1.5 ～16 h［12］。OVA聯(lián)合弗氏完全佐劑致敏大鼠產(chǎn)生的抗體中，IgE會(huì)與肥大細(xì)胞或嗜堿性粒細(xì)胞膜上的特異受體結(jié)合，使機(jī)體處于致敏狀態(tài)。當(dāng)相同過(guò)敏原再次進(jìn)入機(jī)體，接觸到結(jié)合了IgE的肥大細(xì)胞或嗜堿性粒細(xì)胞，則后者會(huì)“脫顆粒”釋放出過(guò)敏介質(zhì)如組胺和白三烯等，從而引起血管擴(kuò)張、支氣管平滑肌收縮等。因此，如是IgE介導(dǎo)的藍(lán)斑形成，則需要在皮內(nèi)致敏后24 h才能明顯出現(xiàn)。該致敏血清致敏時(shí)間與文獻(xiàn)報(bào)道不相符的原因可能為：①IgG也能介導(dǎo)肥大細(xì)胞脫顆粒，釋放組胺。Woolhiser等［13］通過(guò)聚合的IgG刺激人肥大細(xì)胞可引起脫顆粒。這可能也是造成T-IgE和sIgE的水平與PCA結(jié)果不平行的原因。②佐劑的選擇。Dahlb?ck等通過(guò)ip給予OVA免疫SD大鼠后僅以鋁和百日咳桿菌疫苗激發(fā)大鼠，發(fā)現(xiàn)鋁和百日咳桿菌疫苗分別通過(guò)刺激sIgE和IgG2a的產(chǎn)生增強(qiáng)或沉淀過(guò)敏反應(yīng)強(qiáng)度［14］。

綜上，對(duì)PCA進(jìn)行以下條件優(yōu)化：對(duì)1 ～2月齡SD大鼠采用易產(chǎn)生抗體的給藥方法如皮內(nèi)或ip給予OVA與弗氏完全佐劑的混合乳液，隔日1次，共免疫3次；末次致敏后12 ～16 d制備致敏血清。激發(fā)采用大鼠背部皮膚皮內(nèi)注射梯度稀釋度的致敏血清0.1 mL，0.5 ～3 h后iv給予與致敏劑量相同的OVA加等體積的1%伊文思藍(lán)染料共1 mL。激發(fā)注射0.5 ～1 h后測(cè)量皮膚的藍(lán)色斑點(diǎn)，直徑>5 mm者為陽(yáng)性。其中，“皮內(nèi)注射后最佳的激發(fā)時(shí)間為0.5 ～3 h”與現(xiàn)行傳統(tǒng)方法和文獻(xiàn)報(bào)道不同，能否作為預(yù)測(cè)新藥致敏性的改進(jìn)方法加以推廣并應(yīng)用于新藥安全性評(píng)價(jià)尚待進(jìn)一步驗(yàn)證。

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Optimization of parameters of passive cutaneous anaphylaxis in rats

CHEN Wen-pei，ZHANG Zi-yang，ZHOU Cheng-hao，LIU Han，XU Tong，GUO Yu-lin，LIN Bao-qin
（School of Chinese Materia Medica，Guangzhou University of Chinese Medicine，Guangzhou 510006，China）

OBJECTIVE To optimize the parameters of passive cutaneous anaphylaxis（PCA）in rats immunized by ovalbumin（OVA）.METHODS 1-2 month-old Sprague-Dawley rats were immu?nized by ip injection of OVA（0.2，1.0 and 5.0 mg per rat）mixed with complete Freund′s adjuvant once every other day 3 times.Serum was collected on the 12th-16thdays after final immunization.Then the rats were intracutaneously injected with sensitized serum and then stimulated by iv injection of the same dose of OVA mixed with Evans blue after a latent period of 0.5，1.5，3，6，12，24，36，48 and 60 h.Finally，the diameters of blue spots in the skin were measured at stimulation.RESULTS Serumtotal-IgE（T-IgE）and OVA-specific IgE（sIgE）levels increased significantly and reached the peak on the 3rd-7thdays and 12th-16thdays after final immunization，respectively.There was no correlation between the serum T-IgE level and OVA-sIgE level when the rats were immunized with OVA at OVA 0.2-5.0 mg per rat.The rats experienced PCA after injection of OVA 1.0 and 5.0 mg per rat.Diameters of blue spots in the skin reached the maximum value after rats were sensitized for 0.5-3 h.Moreover，the shape，color and size of blue spots were better 30-60 min after stimulation.CONCLUSION Optimized PCA is as follows：1-2 month-old rats are immunized on the 1st，3rdand 5thdays by ip injection of OVA 1.0-5.0 mg.The immunizing serum is collected at 12-16 d after final immunization.The rats are stimulated by OVA and Evans blue after a latent period of 0.5-3 h.Diameters of blue spots in rats′skin are then measured 30-60 min after stimulation.

ovalbumin；typeⅠhypersensitivity；IgE；passive cutaneous anaphylaxis；rats

LIN Bao-qin，Tel：(020)39358085，E-mail：linbqcpu@126.com

R965.2

：A

：1000-3002-（2016）07-0747-07

10.3867/j.issn.1000-3002.2016.07.007

2015-08-31接受日期：2016-06-29）

（本文編輯：齊春會(huì)）

陳文培，碩士研究生，主要從事新藥研究。

林寶琴，E-mail：linbqcpu@126.com，Tel：（020）39358085