張弛,高東升,趙明哲,朱米家,姚俊

1.北京科技大學土木與環(huán)境工程學院,北京100083

2.山東農業(yè)大學園藝學院,山東泰安271018

3.北京中交橋宇科技有限公司,北京100102

銀山鉛鋅礦對土壤微生物代謝活性的影響

張弛1,高東升2*,趙明哲3,朱米家1,姚俊1

1.北京科技大學土木與環(huán)境工程學院,北京100083

2.山東農業(yè)大學園藝學院,山東泰安271018

3.北京中交橋宇科技有限公司,北京100102

本文以銀山鉛鋅礦為研究對象，土樣采自三個不同功能區(qū)(主采礦區(qū)，酸性廢水溝附近，農田土壤)，每個功能區(qū)采集3個不同深度的剖面樣品（0～20 cm，20～40 cm，40～60 cm），利用內梅羅土壤綜合污染指數法對土壤樣品進行重金屬污染評價。結果顯示：主采礦區(qū)由于長期重金屬開采污染情況較嚴重，內梅羅指數范圍為3.75～6.17，達到了中度污染以上水平。其他地區(qū)污染相對較輕，除了農田土壤20～40 cm土樣外，基本都處于輕度污染或安全水平。應用微量熱法和脲酶相結合的方法對土壤中的微生物活性進行研究發(fā)現，微生物代謝活性受到土壤重金屬污染的抑制，主采礦區(qū)土壤中總放熱量Q和生長速率常數k均為三個地區(qū)最低。用SPSS軟件進行相關性分析表明，生長速率常數k，總放熱量Q與內梅羅指數有顯著的相關性。生長速率常數k為微生物代謝中具有代表性的指標。

鉛鋅礦;土壤污染;微生物

鉛鋅礦產資源是國民經濟發(fā)展中的重要資源。我國鉛鋅礦無論在儲量、生產和消費能力上都處于世界前列。目前探明的全國鉛礦儲量約為4141萬t，居世界第2位。而鋅礦資源儲量為9711萬t，居世界第1位。但隨著我國鉛鋅礦產業(yè)的迅速發(fā)展，鉛鋅礦山大量開采，使得礦山周邊的環(huán)境污染日益嚴重[1]。鉛鋅礦區(qū)的重金屬污染常常表現為Pb、Zn、Cd、Cu等多種重金屬復合污染的特點。長期的礦業(yè)開采活動會造成重金屬的富集、造成地下水污染等環(huán)境問題，進而影響當地的土壤生態(tài)系統(tǒng)。不像水和空氣污染一樣，土壤重金屬難以降解，一旦污染，很難從土壤中清除，長期的重金屬累積，不僅對植物和微生物造成危害，還會通過食物鏈對人類的健康造成影響[2]。因此對于鉛鋅礦區(qū)的重金屬污染情況非常有必要進行研究和檢測[3,4]。

土壤中微生物群落占土壤生物量中很大一部分，因為跟土壤緊密接觸，所以對土壤中污染情況會有很好的響應。相對于土壤中的動植物，微生物對于重金屬的刺激要敏感的多[5,6]，已經被認為最有潛力評價土壤環(huán)境質量的指標[7]。傳統(tǒng)的監(jiān)測土壤微生物活性的方法包括土壤呼吸作用、土壤酶作用等，但這些方法都操作較繁瑣，不能實時在線的反映微生物群落活性[8]。微量熱法是近年來興起的一種實時、在線原位監(jiān)測土壤中微生物活性的方法?？梢杂行У谋O(jiān)測土壤中的污染物，被廣泛應用于土壤中污染物的毒性評價，前人對于微量熱的使用方法做了大量的報道。微量熱法對于研究重金屬對土壤中微生物代謝活性的影響有著非常好的作用[9,10]。

銀山鉛鋅礦位于江西省德興市，隸屬于江西銅業(yè)公司，有著40多年的開采歷史，常年的開采活動給周圍的生態(tài)環(huán)境造成了一定的影響。前人對銀山鉛鋅礦的重金屬污染情況做了一些研究，但大都集中于酸性礦坑水，對該礦區(qū)功能區(qū)域缺乏研究[11-13]。本文利用內梅羅指數法評價了銀山鉛鋅礦三個不同功能區(qū)域的重金屬污染情況，利用微量熱和脲酶相結合的方法，探討了重金屬污染與土壤中微生物群落活性之間的相互關系，以期為礦區(qū)重金屬生態(tài)風險評價提供一定的理論依據。

1 研究方法

1.1 采樣地點

銀山鉛鋅礦現在日產礦石2500多t，鉛鋅礦石1500多t，銅硫礦石1000 t。銀山鉛鋅礦位于汲水河附近。汲水河匯入樂安河，最終流入中國最大的淡水湖泊鄱陽湖。本次研究從銀山鉛鋅礦的3個不同的功能區(qū)域選取了3個典型點位，每個點位采集了3個不同深度的剖面樣品（0～20 cm，20～40 cm，40～60 cm），總共9個土壤樣品。YS1點（1～3號土樣）位于采礦中心區(qū)，YS2點（4～6號土樣）位于銀山鉛鋅礦的酸性廢水溝附近，YS3（7～9號土樣）位于下游汲水河農田附近。所有樣品均用塑料密封袋封存。其中一部分土壤樣品經風干，研磨，過篩后用于土壤理化性質和重金屬含量的測定。另外一部分土壤樣品立刻放入-20℃冰凍箱中保存，用于分子生物學的研究。其余所有樣品均放入4℃下保存。

1.2 土壤理化性質和重金屬含量的測定

采用常規(guī)方法測定土壤的基本理化性質。把土壤樣品放于105℃的烘箱中烘干，測定土壤的含水率。WC=（mw-md）/md×100%。WC為土壤含水率，%；mw為濕土質量；md為干土質量[14]。

土壤pH值采用pH計（OHAUS Starter 2C）測定。往10 g土樣加入25 mL蒸餾水，混勻后用pH計測定懸浮液中的pH值。土壤總氮（TN）通過凱氏定氮法進行測定。有機磷（AP）測定通過鉬銻抗比色法進行測定。測定有機碳（TOC）時先通過HCl酸化處理48 h去除無機碳，然后用CHNS/O元素分析儀（Perkin-Elmer，美國）進行測定。

所有的土壤樣品先用濃硝酸酸化，然后用ICP-OES法測定各種主要重金屬的含量（Cd，Cr，Zn，Mn，Pb和Ni）。

1.3 微量熱測定土壤中微生物活性

測定土壤中微生物的代謝活性采用TAM III多通道微量量熱儀（瑞典）。4.0 mL的不銹鋼安瓿瓶在滅菌鍋中高壓滅菌后置于100℃烘箱中烘干。稱取1.0 g土壤樣品置于安瓿瓶中，加入5.0 mg硫酸銨和5.0 mg的葡萄糖的混合溶液0.2 mL。安瓿瓶用不銹鋼蓋封裝好放入微量量熱計中，實驗室溫度保持28℃。微量熱儀會記錄下微生物生長過程的時間-熱功率曲線?？偡艧崃縌total，微生物生長速率常數k和微生物代謝焓ΔHmet可以從時間-熱功率曲線中計算得出。生長速率常數k可以從公式lnPt=lnP0+kt(1)中計算得出。t是時間，P是時間t時的熱功率，P0對數生長期開始的功率。從時間-熱功率曲線中可以直接得出達到最大輸出功率的時間（tmax）和最大輸出功率Pmax。

1.4 土壤脲酶活性的測定

取5 g土壤樣品放入50 mL離心管中，加入1 mL甲苯后混勻靜置15 min[5]。然后加入10 mL10%的尿素和20 mL的檸檬酸鹽緩沖液（pH=6.7），混勻，置于37℃的培養(yǎng)箱中放置24 h。之后用37℃的水稀釋混勻后，過濾。取3 mL濾液轉移到50 mL容量瓶中，加入10 mL蒸餾水，4 mL的苯酚鈉溶液（1.35 M）和3 mL的次氯酸鈉溶液，靜置20 min后稀釋到刻度。用紫外分光光度計測吸光度。測出數值用標準曲線換算成脲酶活性。

1.5 內梅羅指數法

本研究中，內梅羅指數法被用來評價土壤的環(huán)境質量。內梅羅綜合指數法是基于重金屬總量和中國環(huán)境質量標準所得出。計算公式為：P=｛[(piav)2-(pimax)2/2]｝1/2。piav是各重金屬單因子指數法的平均值，pimax是重金屬單因子指數法的最大值。

2 結果和討論

2.1 土壤理化性質分析

表1 土壤理化性質參數Table 1 Physical-chemical parameters of soil samples

從表1可以看出土壤樣品總體呈酸性，尤其是4～6號樣品位于酸性排水溝附近，pH值最低達到3，可見周圍土壤受到了酸性排水溝一定的影響。此外，土壤的總氮和有效磷含量會對微生物的生長產生一定影響。

2.2 重金屬污染評價

圖1 各土壤樣品重金屬含量（Cd）Fig.1 Cd content in soil sample sites

圖2 各土壤樣品重金屬含量（Cu,Pb,Zn）Fig.2 Cu,Pb,Zn contents in soil sample sites

圖3 各土壤樣品重金屬含量（Cr,Ni）Fig.3 Cr,Ni contents in soil sample sites

圖4 各采樣點內梅羅綜合污染指數Fig.4 Nemerow indexes in soil sample sites

本研究采用內梅羅指數法來評價銀山鉛鋅礦區(qū)的土壤重金屬綜合污染情況。內梅羅指數法（P值）被廣泛應用于土壤的環(huán)境污染評價。重金屬的污染程度越大，內梅羅綜合污染指數也就越大。基于這個指數，土壤被劃分為5個污染等級：清潔（P<0.7），預防（0.73.0）[15]。圖4表示本研究中土壤的內梅羅指數從0.71到6.17不等。圖4中可以明顯看出，采礦區(qū)的土壤重金屬污染情況最為嚴重，依據深度不同，分別為5.03，3.75和6.17。采礦區(qū)的污染程度均達到了重度污染水平。酸性排水溝附近的土壤污染具有較大差異。其中表層土樣4污染程度較高，達到了中等污染程度。中層和表層土壤只是受到了輕微的污染。洎水河附近的農田土壤則是表層受污染較輕，中層和底層土壤受污染較重。本文以GB15618-1995 II級標準作為污染程度的評價標準，同時參考江西省土壤環(huán)境背景值進行分析發(fā)現，三個采樣區(qū)中Cd均比較嚴重，其中采礦區(qū)的w（Cd）的平均值達到5.68，超出II級評價標準20倍之多，為造成當地重金屬污染的主要元素。另外的主要污染元素為Pb，Zn，Cu，這與銀山鉛鋅礦主產鉛鋅銅礦石相符合。污染情況中主采礦區(qū)的Pb，Zn，Cu污染均為最嚴重，分別超出II級標準的5倍，6倍和19倍。說明主采礦區(qū)的土壤由于長期的礦石采集，受到了嚴重的重金屬污染，急需治理。江西省土壤環(huán)境背景值均要低于GB15618-1995 II級標準。

2.2 微量熱代謝活性

圖5 各采樣點的微量熱時間-功率曲線Fig.5 Power-time curves of the soil samples

表2 各采樣點的微量熱熱代謝參數Table 2 Microcalorimetric parameters of soil sample sites

土壤微生物的活動會受到土壤性質的影響。當土壤的化學性質、物理性質和其他一些環(huán)境因素變化時，土壤的微生物代謝活動也相應受到影響，進而影響到微生物代謝熱的釋放程度。這些代謝熱的變化便可以通過微量熱儀器檢測出來[16]。

由圖3可知，除了樣品1，2，3之外，其余土樣都符合土壤微生物的典型生長曲線，大致可以分為延遲期、增殖期、對數生長期、延緩期、營養(yǎng)耗盡期、內源代謝期、典型衰亡期、潛伏期[17]。根據生長曲線的不同，大致可以分為三類：1.土壤樣品1、2、3，此三個土壤樣品采集于采礦集中區(qū)，通過熱功率曲線可見，此地土壤樣品放熱量非常低，一直處于延遲期，沒有呈現出典型的微生物生長曲線，說明此地受重金屬的污染程度較重，微生物的活性非常低。2.土壤樣品4、6、8達到最大輸出功率Pmax的時間較為接近，生長速率常數k相近，說明此三土樣的土壤微生物活性較為相似。3.土樣5、7、9延遲期較短，達到最大輸出Pmax的時間較短，其中9號土樣的最大輸出功率Pmax超過了800 μW，生長速率常數均大于0.17，說明此三個土樣的微生物代謝活性較高。值得注意的是，8號土樣時間熱功率曲線具有兩個峰值，說明當8號土樣中的微生物利用營養(yǎng)物質進行代謝完后，代謝活性降低，轉而轉入內源代謝期，利用其他營養(yǎng)源進行生長代謝（如土壤中的有機質等），這與前人的研究相一致[18]。

各個土壤的土壤微量熱代謝參數差別較大。但仍有一定的規(guī)律性，總放熱量Q受內梅羅土壤綜合污染指數的影響。在內梅羅指數較高的土壤1，2，3中總放熱量Q值較低。其他土壤樣品中，除了土樣8以外，其余樣品總放熱量差別不大。由此可見，在內梅羅指數低于3的情況下，重金屬污染對于微生物總放熱量影響不大。而高于3時，內梅羅指數隨著重金屬污染的加劇，逐漸降低。生長速率常數k隨著內梅羅指數的增加而下降。k的最高值出現在內梅羅指數較低的7號土樣中（0.216），而第二高的值出現在5號土樣中（0.177）。說明在低濃度重金屬污染下，土壤中微生物的代謝活性較高。對于污染較為嚴重的主采礦區(qū)1～3號土樣，生長速率常速k最低（0.045～0.086），說明在主采礦區(qū)的土壤樣品中，受土壤中重金屬的影響，基本觀測不到微生物的生長代謝情況。本研究說明，生長速率常數k能很好的表征微生物的生長代謝過程，由熱動力學方程計算得出的，可以定量的表征微生物生長活性的指標，此結論與前人研究相一致[19]。生長速率常數k是微量熱中最具代表性的代謝熱活性指標。

2.3 土壤脲酶活性分析

圖6 采樣點脲酶的活性Fig.6 Urease activity in sampling sites

脲酶活性可以看做是微生物向土壤中釋放氨的能力。當土壤受到污染物污染時，脲酶活性會受到抑制，所以脲酶活性可以看做是一個土壤中表征微生物狀態(tài)的一個指標。從圖4中可以看出，1，2，3號土樣由于高重金屬含量，嚴重抑制了脲酶的活性。而9號土樣位于農田土壤中，呈現了最高的脲酶的活性。酸性廢水溝附近的土樣則是表層土樣呈現最高活性，隨著深度加深，土壤脲酶活性依次降低。

2.4 相關性分析

采用SPSS軟件對內梅羅綜合污染指數法，脲酶活性以及微量熱各代謝參數之間的相關性進行分析。由表3中相關性分析可以得出對微生物代謝活性的最大影響因子。由表可見，內梅羅指數跟總放熱量之間呈顯著負相關，為-0.831（P<0.01），與生長速率常速k以及脲酶活性呈明顯負相關分別為-0.751（P<0.05），-0.710（P<0.05）。說明重金屬污染對土壤中的微生物代謝活性影響較大，顯著的影響了微生物的生長及代謝過程。內梅羅指數跟Pm和Tm并無顯著相關性，這與XING等[14]的研究相一致。

各微量熱參數之間，生長速率常數k與其他熱代謝參數相關性都很高，說明生長速率常數k是微生物生長代謝中最具代表性的參數[14]。

3 討論

通過內梅羅指數法可以看出，銀山鉛鋅礦主采礦區(qū)重金屬含量較高，屬于中度污染到重污染水平。其他區(qū)域中，隨著深度不同，土樣受到的污染程度不同，酸性廢水溝附近的土壤表層受到了重金屬輕度污染，而中層以下污染較輕。洎水河附近的農田土壤中下層為輕度污染水平。

微量熱法研究了重金屬污染土樣中的微生物代謝活性，發(fā)現微生物活性隨著重金屬污染程度的不同而改變。主采礦區(qū)因為重金屬污染程度高，所以微生物的活性非常低。生長速率常數k范圍只有0.044～0.086。酸性廢水溝附近k值明顯升高，而農田附近土樣最高?？偡艧崃縌顯示高重金屬濃度因為抑制了微生物的生長，而對放熱量有明顯抑制作用，在輕度污染水平及以下，對微生物放熱量影響不大。

相關性分析顯示，總放熱量Q，生長速率常速k和脲酶活性與內梅羅指數法有很好的相關性。可以對重金屬污染具有一定的指示作用。該不同區(qū)域中受到了不同程度的重金屬污染，應該采取相應措施對其進行防范，治理。

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Impacts ofPb and Zn fromYinshan Mine onthe MicrobialMetabolic ActivitiesinSoil

ZHANG Chi1,GAO Dong-sheng2*,ZHAO Ming-Zhe3,ZHU Mi-jia1,YAO Jun1
1.School of Civil&Environmental Engineering/Beijing University of Science and Technology,Beijing 100083,China
2.College of Horticulture/Shandong Agricultural University,Tai’an 271018,China
3.Beijing CCCC Qiaoyu Science and Technology Co.,Ltd,Beijing 100083,China

This study mainly focus on Yinshan mine.Soil samples were collected from three different areas(main mining area,area near acid mine drainage pipe,farmland near Jishui river).From each site,three different samples were collected from different depth(0-20 cm,20-40 cm,40-60 cm).Nemerow index was applied to assess the heavy metal pollution in soil samples.The results revealed that heavy metal pollution in main mining area was serious due to long-term mining activity. The nemerow index ranged from 3.75 to 6.17,which was above middle high pollution.The other areas had relatively lighter pollution,which were light or warning level except sample 8.The combination of microcalorimetry and urease method were used to study the microbial metabolism activity in soils.The results showed that microbial activity was inhibited by heavy metal pollution,the total released heat Q,the constant growth rate k were lowest among the three areas.The SPSS software was used to analyze correlation between different parameters,which showed that the total released heat Q,the constant growth rate k had high correlation with nemerow index.The constant growth rate k was representative indicator in microbial metabolism.

Pb and Zn mine;soil pollution;microbial

X53

A

1000-2324(2016)06-0814-06

2016-05-20

2016-05-29

中國國家自然科學基金重點項目(41430106);中國環(huán)保部公益項目(201509049)

張弛(1987-),男,博士研究生,主要從事重金屬污染土壤研究.E-mail:zhangchiustb@foxmail.com

*通訊作者:Author for correspondence.E-mail:dsgao@sdau.edu.cn