孫小怡，李艷博，郭彩霞

納米材料誘導肺部疾病及其機制研究進展

孫小怡，李艷博△，郭彩霞△

隨著納米科技的飛速發(fā)展，納米材料憑借其獨特的理化性能在材料、工業(yè)、環(huán)保、軍事、醫(yī)藥等多個領域扮演著重要的角色。納米材料的生產(chǎn)和使用，使其不可避免地進入生態(tài)系統(tǒng)，人們可通過環(huán)境暴露、職業(yè)暴露和醫(yī)源性暴露接觸到納米材料。呼吸系統(tǒng)是納米材料進入人體的最主要途徑。大量研究證實，吸入的納米材料主要通過氧化應激、炎癥反應和離子紊亂等毒性機制對肺造成損傷，誘導肉芽腫病變、肺纖維化、哮喘、慢性阻塞性肺疾病，甚至肺癌等肺部疾病的發(fā)生。本文對納米材料暴露與肺部疾病的關系及其肺毒性作用機制進行簡要綜述。

納米結(jié)構(gòu)；環(huán)境暴露；毒性試驗；肺疾??；納米材料；肺毒性

納米材料是指在三維空間中至少有一維處于1～100 nm，介于典型宏觀物質(zhì)和微觀原子、分子的過渡區(qū)域，即介觀范疇。憑借著納米尺寸賦予材料的小尺寸效應、表面效應、量子尺寸效應以及宏觀量子隧道效應，納米材料已被廣泛地應用于材料、電子、化妝品、紡織、食品包裝、醫(yī)學診斷和治療等領域，被科學家譽為“21世紀最有前途的材料”。其中尺寸效應使單位質(zhì)量濃度的納米材料含有超高的數(shù)量濃度和更高的比表面積；表面效應使納米材料的化學活性、催化能力顯著增高；量子效應產(chǎn)生的離散能級使納米材料獲得較強的氧化還原能力。也正是由于這些特性的存在，納米材料更易與生物體內(nèi)的蛋白質(zhì)、DNA、膜結(jié)構(gòu)等發(fā)生結(jié)合或催化反應，改變其正常結(jié)構(gòu)和功能。大量研究已證實，納米材料在與細胞、亞細胞成分及生物大分子相互作用時具有明顯的毒效應。納米材料可通過呼吸道、消化道和皮膚進入到體內(nèi)，而呼吸道是其最主要的暴露途徑。研究發(fā)現(xiàn)，顆粒大小和表面積是影響顆粒物在肺部沉積效率的主要因素，如5～30 μm顆粒由于黏膜的攔截作用而沉積在鼻咽部，1～5 μm的顆粒則沉降在氣管和支氣管，而小于1 μm或者100 nm的顆粒則會到達肺泡［1］。因此，即使吸入的納米材料的質(zhì)量濃度不高，但由于其粒徑小、數(shù)量大，且易于進入肺臟深部甚至肺泡這些特點，為納米材料導致肺臟損傷，引發(fā)肺部疾病提供了可能。本文從肺部疾病出發(fā)，綜述納米材料的肺毒性及其可能的作用機制。

1 與納米材料毒性有關的肺部疾病

肺由氣道和肺泡組成。氣道是相對堅硬的屏障，納米材料難以通過有黏液保護的上皮細胞，然而肺泡壁和動脈血管之間的氣血屏障則非常薄，這為納米材料進入肺組織提供了生理學基礎［2］。氣血屏障難以抵擋外界的刺激，是肺部疾病的好發(fā)部位。當納米材料在肺部的沉積速率大于清除速率時，沉積的納米材料可能破壞肺泡巨噬細胞介導的清除功能或者延長清除時間，進一步破壞肺上皮細胞，造成一系列的肺部損傷。

1.1 肉芽腫病變?nèi)庋磕[病變是炎癥細胞集聚和增生造成的慢性炎癥反應，能夠?qū)Ψ谓M織造成損傷，且與其他肺部疾病的發(fā)生密切相關。Song等［3］報道的7例18～47歲年輕女職工胸膜中出現(xiàn)異物肉芽腫，同時伴有纖維細胞和炎癥細胞的集聚；電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，在死者肺部上皮細胞、面部和手臂等皮膚細胞內(nèi)可觀察到直徑約為30 nm的顆粒。實驗室研究結(jié)合勞動衛(wèi)生現(xiàn)場調(diào)查證實，胸膜中出現(xiàn)肉芽腫的原因是吸入聚丙烯酸酯納米材料。單壁碳納米管（single-wall carbon nanotube，SWCNT）、多壁碳納米管（multi-wall carbon nanotube，MWCNT）等碳納米材料由于其纖維性狀，在肺部因難以清除而持續(xù)作用，較早被報道可導致動物肺臟發(fā)生肉芽腫反應，同時在肺臟間質(zhì)可引發(fā)肺纖維化反應［4-5］。而且，SWCNT暴露后，肺臟組織和支氣管肺泡灌洗液中可見碳橋結(jié)構(gòu)，表現(xiàn)為：在少數(shù)相鄰的2個巨噬細胞之間，SWCNT尾端沒入細胞質(zhì)內(nèi)［6］。體內(nèi)動物實驗研究也發(fā)現(xiàn)，除了碳納米材料之外，納米四氧化三鐵（ferroferric oxide，F(xiàn)e3O4）、納米二氧化硅（silica dioxide，SiO2）、納米二氧化鈦（titanium dioxide，TiO2）等納米材料均可誘導肺部肉芽腫病變［7］。當氣管內(nèi)注入納米Fe3O4后，無論是14 d的短時間還是52周的長時間噴注，小鼠肺部均出現(xiàn)了由吞噬納米粒子的巨噬細胞、炎癥細胞和膠原纖維聚集形成的肉芽腫病變［8-9］。而且，不僅采用氣管內(nèi)染毒的方式，納米材料誘導肺部肉芽腫，甚至腹腔內(nèi)注射納米TiO221 d，小鼠肺實質(zhì)也出現(xiàn)了肉芽腫性病變［10］。

1.2 肺纖維化肺纖維化是一種由于持續(xù)的炎癥反應而產(chǎn)生的進行性、致死性的疾病。研究發(fā)現(xiàn)，小鼠經(jīng)氣管內(nèi)吸入納米氧化鋅（zinc oxide，ZnO）肺內(nèi)出現(xiàn)了膠原蛋白的累積，即肺纖維化的出現(xiàn)［11］；Song等［3］報道的暴露在聚丙烯酸酯納米材料環(huán)境中工作的年輕女職工出現(xiàn)了肺纖維化，以及上述的碳納米材料暴露誘導肺組織纖維化的發(fā)生等，充分證實納米材料暴露可增加患肺纖維化的風險?；|(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）和組織金屬蛋白酶抑制劑（TIMP）的失衡在肺纖維化中發(fā)揮了重要的作用。MMPs和TIMP可以控制細胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）的合成和降解，這是組織修復的關鍵。正常情況下，TIMP的水平遠遠超過MMPs，抑制了ECM的降解。有研究顯示，小鼠腹腔注射納米二氧化鈰（cerium oxide，CeO2）后，肺組織內(nèi)出現(xiàn)肉芽腫和肺纖維化的病理改變，且肺內(nèi)MMPs的水平和活性均明顯升高，同時，該研究證明，在肺纖維化之前存在肺蛋白沉著癥的過渡階段，通過透射顯微鏡可觀察到肺表面活性物質(zhì)的積累［12］。納米材料誘導肺纖維化可能與其引發(fā)炎癥反應有關，但也存在非炎性細胞損傷，如細胞凋亡。大量研究證實，肺纖維化患者或動物模型中存在大量的肺臟細胞凋亡。細胞凋亡和細胞增殖失調(diào)可造成肺臟細胞組成紊亂而引發(fā)肺結(jié)構(gòu)紊亂，導致肺纖維化的發(fā)生［12-13］。近年來研究還發(fā)現(xiàn)，上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化也參與肺纖維化［13］，可能通過TGF-β/Smad［14］、TGF-β/Akt/GSK-3β/ SNAIL-1［15］等信號通路介導。

1.3 哮喘哮喘是一種由多種細胞（如嗜酸性粒細胞、肥大細胞、T淋巴細胞、中性粒細胞、氣道上皮細胞等）和細胞組分參與的氣道高反應性（airway hyperresponsiveness，AHR）慢性炎癥性疾病，主要特征表現(xiàn)為黏液分泌過多、嗜酸性粒細胞浸潤以及強烈的氣管反應，臨床表現(xiàn)為反復發(fā)作的喘息、氣急、胸悶或咳嗽等癥狀。卵蛋白（ovalbumin，OVA）誘導的小鼠哮喘模型揭示了過敏性哮喘的重要特性，包括嗜酸性粒細胞和Th2細胞因子如白細胞介素（IL）-4、IL-5、IL-13等的數(shù)量增加，該模型已被廣泛用于研究環(huán)境因素對哮喘的影響［16］。Huang等［17］的研究證實小鼠經(jīng)口咽途徑暴露納米ZnO后，嗜酸性粒細胞數(shù)量增多，暴露24 h后,IL-4、IL-5、IL-6、IL-13的表達顯著增加；Han等［18］在實驗中觀察到，暴露于納米SiO2的小鼠出現(xiàn)呼吸困難、氣道重塑和IL-4水平升高的現(xiàn)象，而且氣道暴露納米SiO2后，納米SiO2可作為佐劑增強機體對過敏原的敏感性，促進過敏性氣道疾病的發(fā)生［19］。這都證實了哮喘的發(fā)生與納米材料暴露密切相關。除誘導哮喘發(fā)生外，納米材料還可加重哮喘疾病。Park等［20］發(fā)現(xiàn)鼻內(nèi)滴注納米CuO可誘導小鼠氣道炎癥和黏液分泌，且絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）磷酸化與其氣道毒性密切相關，而且可增強OVA誘導的AHR，增加炎癥細胞數(shù)量、促炎因子表達和IgE水平，從而加重哮喘；SWCNTs也可加重OVA誘導的大鼠過敏性哮喘，但維生素E可拮抗該作用［21］。經(jīng)查閱文獻發(fā)現(xiàn)，金屬或非金屬氧化物納米材料（如納米ZnO、納米SiO2、納米TiO2、納米CuO）、納米金、納米銀以及SWCNTs等多種納米材料均被報道可誘發(fā)或加重動物哮喘發(fā)生［22-23］，主要表現(xiàn)為AHR、氣道重塑和氣道炎癥。不過，納米材料與哮喘方面的報道結(jié)論不一。有研究顯示，納米銀可減弱哮喘小鼠的氣道炎癥和AHR［24］。另外，機體的免疫狀態(tài)可影響納米材料對氣道炎癥的調(diào)節(jié)作用，影響哮喘的發(fā)生［25］。健康小鼠與OVA致敏小鼠相比，當氣道反復暴露納米TiO2后，前者表現(xiàn)為肺部中性粒細胞浸潤、趨化因子CXCL5（C-X-C motif ligand 5）表達升高，而后者肺部炎癥反應減弱，表現(xiàn)為與哮喘相關的白細胞水平、細胞因子、趨化因子等的表達顯著降低。

1.4 慢性阻塞性肺疾?。–OPD）COPD主要是由于氣道炎癥（如慢性支氣管炎）和肺泡上皮的連續(xù)性損傷（如肺氣腫引起的慢性氣道阻塞）所致［26］，其共同特征是管徑小于2 mm的小氣道阻塞和阻力升高。納米材料暴露與COPD發(fā)生有關。Chen等［27］發(fā)現(xiàn)，納米TiO2可通過增強胎盤生長因子和趨化因子CXCL1、CXCL5、CCL3（C-C motif ligand 3）等的表達，激活炎癥通路，造成肺氣腫、肺巨噬細胞增生、Ⅱ型肺細胞增生以及肺上皮細胞凋亡，肺泡隔遭到嚴重破壞。Sadeghi等［28］也發(fā)現(xiàn)，小鼠吸入納米三氧化二鐵（Fe2O3）后出現(xiàn)肺氣腫、肺間質(zhì)充血和炎癥等。同樣，氣管內(nèi)注入50 μg粒徑為14 nm的炭黑納米粒子可加重彈性蛋白酶誘導的小鼠肺氣腫，這與促進炎癥因子釋放有關［29］；但Roulet等［30］的研究卻顯示，納米和炭黑納米粒子不能加重彈性蛋白酶誘導的大鼠肺氣腫，實驗結(jié)論的不一致可能與粒子本身的特性、劑量和動物種屬等有關。

1.5 肺癌腫瘤的發(fā)生是遺傳與環(huán)境交互作用的結(jié)果。大量的體內(nèi)外研究證實，納米材料具有遺傳毒性［31-36］，表現(xiàn)為：誘導細胞或組織DNA損傷、染色體畸變，干擾基因組穩(wěn)定性。納米材料對肺細胞的遺傳毒性為納米材料暴露與肺癌的相關性提供了重要的線索［37］。差異基因表達分析結(jié)果顯示，納米ZnO暴露可誘導COPD和肺癌患者淋巴細胞中腫瘤抑制基因p53、原癌基因Ras p21和JNKs表達增加，且呈現(xiàn)明顯的劑量依賴性，提示納米ZnO具有遺傳毒性和致癌潛能［38］。細胞惡性轉(zhuǎn)化被認為是一種評價外源化合物致癌性的重要體外研究方法。Wang等［39］證實了慢性SWCNTs暴露可促進人肺上皮細胞惡性轉(zhuǎn)化，誘導肺癌的發(fā)生，且腫瘤抑制基因p53信號通路參與細胞惡性轉(zhuǎn)化。同時，動物實驗發(fā)現(xiàn)敲除p53基因的小鼠腹腔注射MWCNTs之后可以觀察到間皮瘤的發(fā)生［40-41］，這也為p53在碳納米材料致癌中的作用提供了支持。腫瘤的發(fā)生是一個多階段的過程，分為啟動、促進和發(fā)展3個階段，納米材料暴露究竟作用于哪個環(huán)節(jié)需待深入研究。不過已有研究指出，納米TiO2不能誘導Hras128轉(zhuǎn)基因大鼠的皮膚發(fā)生癌變，主要是由于納米TiO2不能穿透表皮，從而不能到達深層皮膚組織內(nèi)［42］，但可顯著促進N-亞硝基二（2-羥丙基）胺誘導Hras128轉(zhuǎn)基因大鼠肺泡細胞增生、肺腺癌的發(fā)生［43］。總而言之，納米材料暴露是否致癌受多種因素的影響，可能與納米材料的種類、劑量、處理方式、作用時間以及組織和細胞類型等有關。值得一提的是，非納米級TiO2長期吸入實驗中，僅250 mg/m3高劑量組大鼠出現(xiàn)肺腫瘤［44］；而粒徑為20 nm的TiO2僅10 mg/m3就可誘導腫瘤發(fā)生［45］；同樣，納米鈷可誘導體外培養(yǎng)的小鼠成纖維細胞惡性轉(zhuǎn)化，而氯化鈷則不能［46］。這反映出納米尺度材料由于其特殊的理化特性，在致癌方面不同于常規(guī)材料，可能表現(xiàn)出更強的致癌性。

2 納米材料肺毒性相關作用機制

2.1 氧化應激小鼠腹腔注射納米SiO2之后，在肺部可檢測到脂質(zhì)過氧化物酶（lipid peroxidation，LPO）水平顯著升高［47］；腹腔注射納米TiO2的小鼠肺組織中活性氧（ROS）水平是正常組的3倍［10］；吸入納米Fe2O3后，小鼠肺組織中ROS水平顯著上升而谷胱甘肽水平下降［28］，以上均證實了納米材料暴露可誘導機體發(fā)生氧化應激。氧化應激是納米材料發(fā)揮生物毒效應、損傷細胞的最普遍的機制，其重要性在于可通過氧化應激調(diào)節(jié)細胞活動，如細胞凋亡、DNA加合物的形成和促炎癥基因的表達等［48］。自由基產(chǎn)生系統(tǒng)和清除系統(tǒng)的失衡是氧化應激的主要原因。Wang等［49］認為，納米ZnO主要是通過產(chǎn)生ROS來抑制細胞增殖，促進細胞凋亡，發(fā)揮其細胞毒作用。

氧化應激主要是通過ROS來實現(xiàn)的。巨噬細胞和中性粒細胞的線粒體是ROS的主要來源［50］，在合成ATP的過程中，呼吸鏈電子傳遞異常導致電子漏出，生產(chǎn)大量ROS。在納米材料表面活化的自由基中間體和功能化的氧化還原活性基團也很有可能是氧化劑的內(nèi)在來源［51］。此外，對于缺乏表面活性基團的低毒性納米材料而言，直接或者間接作用于線粒體的生物相互作用是產(chǎn)生ROS的重要途徑［52-53］。ROS通過生物膜脂質(zhì)過氧化反應破壞細胞膜和細胞器膜的完整性，誘導細胞膜通透性增加，影響細胞代謝。ROS也可以與蛋白質(zhì)氨基酸殘基發(fā)生氧化反應導致蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)被破壞，引起酶的活性下降或喪失以及細胞信號轉(zhuǎn)導功能障礙，導致細胞功能障礙［54］、正常組織細胞損傷，引發(fā)急性和慢性炎癥應答，導致肉芽組織增生和慢性特異性肉芽腫反應，這也解釋了納米材料造成肉芽腫病變、肺纖維化等肺部疾病的原因。另外，氧化應激在肺癌發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。有研究表明，納米TiO2可通過產(chǎn)生ROS將致瘤性差、無轉(zhuǎn)移性的小鼠纖維肉瘤轉(zhuǎn)變?yōu)榍忠u性強的惡性腫瘤細胞［55］，這可能與納米材料產(chǎn)生的ROS可導致DNA鏈斷裂和染色體畸變有關［32］。

2.2 炎癥反應納米材料誘導肺部損傷的實驗中，?？捎^察到巨噬細胞、中性粒細胞和淋巴細胞等炎癥細胞浸潤，以及腫瘤壞死因子（TNF）-α、IL-6、IL-1β等炎性細胞因子分泌增多，證實了炎癥反應的存在。在哮喘、COPD、肺癌等與納米材料肺毒性相關的肺部疾病中都觀察到炎癥反應的出現(xiàn)。納米材料暴露可誘導炎癥細胞如嗜酸性粒細胞、肥大細胞等浸潤，炎癥細胞脫顆粒釋放組胺、前列腺素、白三烯等炎癥介質(zhì)，導致支氣管狹窄、阻塞、黏膜水腫以及黏液分泌過多，這與哮喘和COPD的發(fā)生密切相關。另外，巨噬細胞、T淋巴細胞可以釋放炎癥介質(zhì)，對腫瘤的形成和遷移有一定的作用。這都表明了炎癥反應是納米材料肺毒性的主要機制之一。雖然Li等［56］采用鼻腔滴注法將小鼠暴露在納米TiO290 d之后，觀察到了巨噬細胞、淋巴細胞、中性粒細胞和嗜酸性粒細胞數(shù)量增加的現(xiàn)象，即炎癥反應的出現(xiàn)，但是Mohammadi等［10］在小鼠腹腔內(nèi)注射納米TiO2之后并沒有觀察到炎癥的存在，這可能與實驗中使用的納米材料大小、形狀和來源等不同有關。同時，納米材料表面修飾影響其促炎作用。有研究顯示，非晶型SiO2包被物可以減輕納米CeO2誘導的肺部炎癥［57］。

Th1/Th2細胞失衡與炎癥密切相關。文獻報道，小鼠氣管內(nèi)滴注納米TiO2可通過Th2介導慢性炎癥反應的發(fā)生［58］。而且，氧化應激和炎癥反應密不可分。ROS可啟動促炎癥反應，進而促進與炎癥相關的細胞因子、趨化因子和黏附分子的表達。促炎癥反應通過激活炎癥反應通路MAPK和轉(zhuǎn)錄因子核因子（NF）-κB實現(xiàn)。Capasso等［59］證實，在納米氧化鎳（NiO）致肺上皮細胞毒性的實驗中，炎癥因子的釋放依賴于NF-κB信號通路介導的MAPK級聯(lián)反應通路的活化。Nod樣受體蛋白3（Nod-like receptor protein 3，NLRP3）炎癥小體的激活也可能與納米材料引發(fā)的炎癥反應有關［60］。

2.3 其他除了氧化應激和炎癥反應之外，納米材料引發(fā)肺毒性過程中，還有其他機制參與其中。如細胞內(nèi)Ca2+濃度升高介導的細胞死亡參與了納米材料的肺毒性作用。Ca2+是調(diào)節(jié)細胞凋亡的第二信使，Ca2+的濃度受到離子通道、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+-ATP酶、質(zhì)膜Ca泵和線粒體Ca2+運輸?shù)鹊恼{(diào)節(jié)。納米材料可通過損傷Ca2+通道，增加細胞器膜通透性，導致細胞內(nèi)Ca2+超載，從而影響細胞的正常生理功能。Yu等［61］發(fā)現(xiàn)，納米TiO2可以破壞線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜的完整性，促進ROS釋放，進而ROS破壞Ca2+通道相關蛋白三磷酸肌醇受體（inositol triphosphate receptor，IP3R）、電壓依賴型陰離子通道蛋白1（voltage-dependent anion-selective channel protein 1，VDAC1）和葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白75（75-kDa glucose regulated protein，Grp75），導致Ca2+超載。當細胞內(nèi)的Ca2+濃度增加時，Ca2+會被轉(zhuǎn)移到線粒體，啟動細胞凋亡或細胞自噬性死亡等信號通路［62］。

3 展望

隨著納米科技的發(fā)展，納米材料在生活中越來越普及，其安全性問題也引起了廣泛的關注。雖然現(xiàn)在納米材料的毒性研究已經(jīng)取得不少進展，但仍是更多地停留于器官、組織和細胞層面，對于更能揭示本質(zhì)的分子水平的研究還存在嚴重的不足。在納米材料與肺部疾病的研究中，多集中在體內(nèi)外實驗研究，人群流行病學的研究相對缺乏。另外，納米材料特殊的理化特性，如表面積、形狀、結(jié)晶度、表面電荷、溶解率、聚集狀態(tài)等都會影響其毒性效應。同時，納米材料健康和安全方面的風險評估還沒有統(tǒng)一的評估程序和評估方法，相關部門缺乏對納米材料暴露的風險管理，也就是說納米材料暴露人群的風險評估、暴露環(huán)境安全限值的制定以及納米材料的安全生產(chǎn)和使用等方面均有待深入研究。

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（2016-06-28收稿2016-09-18修回）

（本文編輯陳麗潔）

Research advances in pulmonary diseases induced by nanomaterials and their mechanism

SUN Xiaoyi,LI Yanbo△,GUO Caixia△
School of Public Health,Capital Medical University,Beijing 100069,China△

With the rapid development of nanotechnology,nanomaterials play an important role in many fields,such as materials,industry,environmental protection,military,medicine and other fields with their unique physical and chemical properties.The production and use of nanomaterials make them inevitablely to enter the ecological system.People can be exposed to nanomaterials through environmental,occupational and medical approaches.Respiratory system is the most important way for nanoparticles to enter the human body.A number of studies have confirmed that nanomaterials can cause damage to lungs by oxidative stress,inflammation,and ion disorders,which can induce granulomatous lesions,pulmonary fibrosis,asthma,chronic obstructive pulmonary disease,and even lung cancer.The relationship between nanomaterial exposure and pulmonary diseases,and also the related mechanism in pulmonary toxicity of nanomaterials have been reviewed in this paper.

nanostructures;environmental exposure;toxicity tests;lung diseases;nanomaterial;pulmonary toxicity

R994.6

A

10.11958/20160580

國家自然科學基金項目（81202242，81573176）；北京市自然科學基金資助課題（7162022）；北京市教育委員會科技發(fā)展計劃面上項目（KM201510025005）

首都醫(yī)科大學公共衛(wèi)生學院（郵編100069）

孫小怡（1994），女，2013級七年制臨床醫(yī)學在讀，主要從事環(huán)境毒理方面研究

△通訊作者E-mail：guocx@ccmu.edu.cn；ybli@ccmu.edu.cn