潘怡宏王 平

補(bǔ)元清腦顆粒對(duì)APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠學(xué)習(xí)記憶及Bax、Bcl-2表達(dá)的影響

潘怡宏1王 平2

目的觀察補(bǔ)元清腦顆粒對(duì)APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠學(xué)習(xí)記憶能力及Bax、Bcl-2表達(dá)的影響。方法將40只APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠隨機(jī)分為模型組、多奈哌齊組、補(bǔ)元清腦顆粒高劑量組和低劑量組，每組10只，同月齡相同遺傳背景C57BL/6J小鼠10只為空白組。從5月齡開始分別灌胃，1天1次?？瞻捉M、模型組均給予等容積生理鹽水灌胃。連續(xù)灌胃30天后進(jìn)行Morris水迷宮測試評(píng)定各組小鼠學(xué)習(xí)記憶能力；采用Western Blot法檢測小鼠海馬組織Bax、Bcl-2蛋白的表達(dá)。結(jié)果與模型組比較，補(bǔ)元清腦顆粒高、低劑量組均可減少小鼠Morris水迷宮測試的上平臺(tái)潛伏期[（37.90±20.10）s比（66.98±21.00）s，P＜0.01；（47.65±22.93）s比（66.98±21.00）s，P＜0.05]、減少游泳總路程[（414.94±171.10）cm、（559.72±178.76）cm比（1032.12±118.66）cm，P＜0.01]和第一次抵原平臺(tái)時(shí)間[（21.36±20.22）s、（27.82±21.96）s比（51.71±20.96）s，P＜0.01]，增加穿越平臺(tái)次數(shù)[（5.90±1.60）次比（1.80±1.41）次，P＜0.01；（4.60±1.71）次比（1.80±1.41）次，P＜0.05]和目標(biāo)象限時(shí)間[（17.71±7.58）s、（14.07±7.08）s比（5.55±4.42）s，P＜0.01]，增加小鼠海馬組織Bcl-2蛋白相對(duì)表達(dá)量（0.52±0.07比0.15±0.06，P＜0.01；0.42±0.06比0.15±0.06，P＜0.05）。結(jié)論補(bǔ)元清腦顆粒對(duì)APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力具有改善作用，及有一定的抗神經(jīng)元凋亡作用。

小鼠；阿爾茨海默?。谎a(bǔ)元清腦顆粒；Morris水迷宮；Western Blot

阿爾茨海默病（alzheimer's disease,AD）是老年人常見的一種與衰老相關(guān)的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，起病隱匿，呈進(jìn)行性發(fā)展。隨著全球人口老齡化的發(fā)展，AD的發(fā)病率不斷上升，為家庭和社會(huì)帶來沉重的負(fù)擔(dān)。研究如何延緩衰老和防治老年病，通過預(yù)見其發(fā)生而進(jìn)行有針對(duì)性、個(gè)體化的防治，使“健康老齡化”成為一種醫(yī)學(xué)發(fā)展的方向。中醫(yī)認(rèn)為，AD的病因病機(jī)多為年邁體衰，元?dú)馓澨?，髓海不足，腦失所養(yǎng)，神機(jī)失用，清竅不明。研究元?dú)馀cAD病因病機(jī)的關(guān)系及培元固本法對(duì)AD的治療作用對(duì)于AD的防治具有重要意義。本研究選用APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠作為AD動(dòng)物模型，從行為學(xué)、Bax及Bcl-2蛋白的表達(dá)入手，研究補(bǔ)元清腦顆粒對(duì)APP/ PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠學(xué)習(xí)記憶及Bax、Bcl-2表達(dá)的影響。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)5月齡APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠40只，雄性，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所訂購，許可證號(hào)：SCXK（京）2013-0002。SPF級(jí)5月齡相同遺傳背景C57BL/6J小鼠10只，雄性，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所訂購，許可證號(hào)：SCXK（京）2012-0001。

1.2 藥 品 補(bǔ)元清腦顆粒（由石菖蒲、遠(yuǎn)志、人參、茯苓、熟地等組成，湖北虎泉藥業(yè)有限公司加工成為中藥顆粒中試產(chǎn)品，批號(hào)201305。純水配成0.39g/ mL，冰箱4℃儲(chǔ)存?zhèn)溆茫６嗄芜啐R（鹽酸多奈哌齊片，衛(wèi)材藥業(yè)有限公司，批號(hào)H20050978）。

1.3 儀器與試劑 小鼠獨(dú)立通氣系統(tǒng)（型號(hào)：S8智能型，蘇州市蘇杭科技器材有限公司）。Morris水迷宮（型號(hào)：DMS-2，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所）。蛋白電泳儀（美國Bio-Rad公司）。凝膠圖像成像分析儀（美國Bio-Rad公司）。SDS-PAGE凝膠配制試劑盒（批號(hào)P0012A，上海碧云天生物技術(shù)有限公司）。一抗（兔抗鼠GAPDH抗體，批號(hào)ABS16；兔抗鼠Bax抗體，批號(hào)AB2915；兔抗鼠Bcl-2抗體，批號(hào)AB10546，均購自美國millipore公司）。二抗（羊抗兔二抗，購自武漢科瑞生物技術(shù)有限公司）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 動(dòng)物分組及給藥 用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件產(chǎn)生一組隨機(jī)數(shù)字表，將5月齡APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠隨機(jī)分成5組，即模型組、多奈哌齊組、補(bǔ)元清腦顆粒高劑量組（以下簡稱高劑量組）和補(bǔ)元清腦顆粒低劑量組（以下簡稱低劑量組），每組10只。同月齡C57BL/6J小鼠10只作為空白組?？瞻捉M和模型組每天灌胃生理鹽水，其余各組分別灌胃相應(yīng)藥物，多奈哌齊組0.65mg/（kg·d），補(bǔ)元清腦顆粒高劑量組15.6g/（kg·d），補(bǔ)元清腦顆粒低劑量組7.8g/（kg·d）。正常適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后開始灌胃，各組小鼠均灌胃20mL/kg，每天灌胃1次，連續(xù)灌胃30天。

2.2 Morris水迷宮測試 各組小鼠均進(jìn)行Morris水迷宮測試，末次給藥結(jié)束后24h進(jìn)行。參照文獻(xiàn)Morris水迷宮[1]方法。Morris水迷宮主要由一個(gè)圓形水池、一個(gè)圓形平臺(tái)和自動(dòng)錄像及分析系統(tǒng)三部分組成。水池高70cm，直徑100cm，由于APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠皮毛為黑色，為了使自動(dòng)錄像及分析系統(tǒng)能夠識(shí)別小鼠游泳軌跡，預(yù)先在水池中加入奶粉-清水混懸液，攪拌均勻，使池水呈乳白色，平臺(tái)位于第一象限中央。調(diào)整水池上方的攝像機(jī)位置，使其能拍攝到整個(gè)水池，同步采集記錄小鼠游泳軌跡。通過定位航行試驗(yàn)（place navigation）和空間探索試驗(yàn)（spatial probe）來分析小鼠的學(xué)習(xí)獲取能力和空間記憶能力。

2.2.1 定位航行試驗(yàn) 將小鼠面向池壁，每天分別從平臺(tái)對(duì)側(cè)象限（第四象限）的兩個(gè)頂點(diǎn)處放入水中，記錄其在90s內(nèi)尋找到平臺(tái)的時(shí)間(即上平臺(tái)潛伏期)，歷時(shí)2天。當(dāng)小鼠在設(shè)定的訓(xùn)練時(shí)間90s內(nèi)找到并爬上平臺(tái)，且停留時(shí)間達(dá)3s時(shí)，計(jì)算機(jī)停止跟蹤，記錄下游泳軌跡，并自動(dòng)計(jì)算出動(dòng)物的上平臺(tái)潛伏期及游泳總路程等指標(biāo)；若小鼠在90s之內(nèi)尚未找到平臺(tái)，則上平臺(tái)潛伏期按90s記錄，同時(shí)將小鼠引至平臺(tái)停留20s引導(dǎo)其學(xué)習(xí)與記憶。第3天隨機(jī)選取其中一個(gè)點(diǎn)入水，訓(xùn)練成績即為定位航行試驗(yàn)結(jié)果，以上平臺(tái)潛伏期和游泳總路程作為衡量其學(xué)習(xí)記憶能力的指標(biāo)。

2.2.2 空間探索試驗(yàn) 第4天將平臺(tái)撤除，進(jìn)行空間探索試驗(yàn)，任選平臺(tái)對(duì)側(cè)象限（第四象限）的一個(gè)入水點(diǎn)將小鼠放入水中，開始90s的空間探索試驗(yàn)。記錄動(dòng)物在90s內(nèi)穿越平臺(tái)次數(shù)、目標(biāo)象限時(shí)間和第1次抵原平臺(tái)時(shí)間，以此作為空間記憶的檢測指標(biāo)。

2.3 Western Blot法檢測Bax及Bcl-2蛋白的表達(dá) 小鼠Morris水迷宮測試結(jié)束后立即頸椎脫臼法處死，冰上斷頭，剝開頭頸部皮毛，暴露顱骨，沿枕骨大孔剪開，取出鼠腦，分離兩側(cè)海馬組織，放入凍存管，浸入液氮急凍，立即放入超低溫冰箱-80℃凍存。RIPA法提取小鼠海馬總蛋白，BCA法測定蛋白濃度，進(jìn)行蛋白凝膠電泳，運(yùn)行Bio-Rad凝膠圖像成像分析系統(tǒng)，曝光獲得各組蛋白條帶，拍照，采用Bio-Rad凝膠圖像成像分析系統(tǒng)分析各組條帶灰度值，并作統(tǒng)計(jì)分析。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，結(jié)果以（±s） 表示，兩組比較采用t檢驗(yàn)，多重比較采用單因素方差分析。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 Morris水迷宮測試

3.1.1 各組小鼠定位航行試驗(yàn)結(jié)果 與空白組比較，模型組小鼠上平臺(tái)潛伏期明顯延長（P＜0.01），游泳總路程明顯增加（P＜0.01）；與模型組比較，各組小鼠的上平臺(tái)潛伏期均縮短（P＜0.01，P＜0.05），游泳總路程均減少（P＜0.01，P＜0.05），且補(bǔ)元清腦顆粒高劑量組和低劑量組間呈現(xiàn)出一定的量效關(guān)系；與多奈哌齊組比較，補(bǔ)元清腦顆粒高劑量組和低劑量組小鼠的游泳總路程明顯減少（P＜0.01）見表1。

表1 各組小鼠定位航行試驗(yàn)結(jié)果比較（±s）

表1 各組小鼠定位航行試驗(yàn)結(jié)果比較（±s）

注：與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與多奈哌齊組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01

組別空白組模型組多奈哌齊組補(bǔ)元清腦顆粒高劑量組補(bǔ)元清腦顆粒低劑量組只數(shù)10 10 10上平臺(tái)潛伏期（s）24.93±20.85** 66.98±21.00 46.72±18.83*游泳總路程（cm）125.68±63.50** 1032.12±118.66△753.57±185.59** 1037.90±20.10**414.94±171.10**△△1047.65±22.93*559.72±178.76**△△

3.1.2 各組小鼠空間探索試驗(yàn) 與空白組比較，模型組小鼠的穿越平臺(tái)次數(shù)、目標(biāo)象限時(shí)間均明顯減少（P＜0.01），第1次抵原平臺(tái)時(shí)間明顯延長（P＜0.01）；與模型組比較，補(bǔ)元清腦顆粒高劑量組和低劑量組小鼠穿越平臺(tái)次數(shù)增加（P＜0.01，P＜0.05），各組小鼠的目標(biāo)象限時(shí)間增加（P＜0.01，P＜0.05），第1次抵原平臺(tái)時(shí)間縮短（P＜0.01，P＜0.05）見表2。

表2 各組小鼠空間探索試驗(yàn)結(jié)果比較（±s）

表2 各組小鼠空間探索試驗(yàn)結(jié)果比較（±s）

注：與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

組別空白組模型組多奈哌齊組補(bǔ)元清腦顆粒高劑量組補(bǔ)元清腦顆粒低劑量組只數(shù)10 10 10穿越平臺(tái)次數(shù)6.10±1.70** 1.80±1.41 3.70±1.72*目標(biāo)象限時(shí)間（s）17.83±6.96** 5.55±4.42 12.60±6.58* 第1次抵原平臺(tái)時(shí)間（s）6.87±3.72** 51.71±20.96 27.85±20.69** 105.90±1.60**17.71±7.58**21.36±20.22** 104.60±1.71*14.07±7.08**27.82±21.96**

3.2 Western Blot法檢測各組小鼠Bax及Bcl-2蛋白表達(dá) 與空白組比較，模型組小鼠海馬組織Bcl-2蛋白相對(duì)表達(dá)量減少（P＜0.05），Bcl-2/Bax比值增加（P＜0.01）；與模型組比較，各組小鼠海馬組織Bcl-2蛋白相對(duì)表達(dá)量增加（P＜0.01，P＜0.05），Bcl-2/Bax比值均增加（P＜0.01，P＜0.05）。補(bǔ)元清腦顆粒高、低劑量組各指標(biāo)與多奈哌齊組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）見表3，圖1。

表3 各組小鼠海馬組織Bax、Bcl-2蛋白相對(duì)表達(dá)量比較（s）

表3 各組小鼠海馬組織Bax、Bcl-2蛋白相對(duì)表達(dá)量比較（s）

注：與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

只數(shù)10 10 10 Bax 0.29±0.03 0.36±0.03 0.24±0.02 Bcl-2/Bax 1.07** 0.42 2.46** 0.52±0.07** Bcl-2 0.31±0.07* 0.15±0.06 0.59±0.07** 2.48** 0.21±0.05 10 0.24±0.04 100.42±0.06*1.75*組別空白組模型組多奈哌齊組補(bǔ)元清腦顆粒高劑量組補(bǔ)元清腦顆粒低劑量組

圖1 APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠海馬組織Western Blot結(jié)果

4 討論

AD是一種不可逆的神經(jīng)退行性疾病,臨床表現(xiàn)為進(jìn)行性記憶和認(rèn)知障礙。AD的發(fā)病原因尚不明確，其主要的病理表現(xiàn)為β-淀粉樣蛋白（β-Amyloid，Aβ）沉積，老年斑（senile plaque，SP）形成，tau蛋白過度磷酸化和神經(jīng)纖維纏結(jié)（neurofibrillary tangles，NFTs）[2]。AD的特征是大腦皮層及某些皮層下區(qū)域的神經(jīng)元和神經(jīng)突觸喪失，在AD早期就出現(xiàn)突觸和神經(jīng)元的大量丟失，中期AD病人內(nèi)嗅區(qū)皮質(zhì)神經(jīng)元丟失達(dá)50%。尸檢報(bào)告提示，AD患者腦中一些神經(jīng)元通過凋亡機(jī)制蛻變，在AD相當(dāng)早期階段，神經(jīng)元已經(jīng)普遍出現(xiàn)DNA損傷，這種損傷甚至也可在無神經(jīng)纖維纏結(jié)的神經(jīng)元見到，而且似乎在疾病全程中都存在[3]。最新的研究[4]表明，Aβ相關(guān)的神經(jīng)細(xì)胞凋亡是AD發(fā)病的重要環(huán)節(jié)。老年斑的主要成分Aβ是各種原因誘發(fā)AD的共同通路，聚集的Aβ是一種毒性蛋白，使細(xì)胞的鈣離子穩(wěn)態(tài)發(fā)生紊亂，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[5]。Bcl-2/Bax是凋亡的各種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的共同交匯點(diǎn)[6]。

Bax被認(rèn)為是線粒體損傷的重要誘導(dǎo)分子，當(dāng)死亡信號(hào)刺激后，激活的Bax移動(dòng)到線粒體的外膜上，改變線粒體膜的通透性，Bax還能直接結(jié)合到線粒體膜通透性轉(zhuǎn)運(yùn)孔（MPTP），增強(qiáng)線粒體膜的通透性，促進(jìn)凋亡因子（AIF）釋放，從而啟動(dòng)凋亡信號(hào)途徑。Bcl-2是一種抗細(xì)胞凋亡蛋白，與促凋亡蛋白Bax結(jié)合成異二聚體，具有抑制Bax的促凋亡作用[7]。實(shí)驗(yàn)證明，Aβ誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)元凋亡是通過下調(diào)Bcl-2表達(dá)和上調(diào)Bax的表達(dá)實(shí)現(xiàn)，通過Bax抑制劑的使用，或敲除Bax基因，可以顯著減少Aβ誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[8]。

研究指出，APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠在3月齡就出現(xiàn)認(rèn)知行為學(xué)變化，5月齡出現(xiàn)老年斑，6～7月齡的小鼠腦內(nèi)會(huì)形成Aβ沉淀，12月齡有大量老年斑形成，其空間學(xué)習(xí)能力明顯受損[9]。APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠作為AD動(dòng)物模型已被廣泛應(yīng)用于研究PS1 在Aβ沉積中的作用，以及Aβ在AD發(fā)病過程中的作用，是研究AD病情進(jìn)展和預(yù)防治療的理想動(dòng)物模型[10]。

補(bǔ)元清腦顆粒是導(dǎo)師王平教授根據(jù)老年性癡呆元?dú)馓澨摗⑻禎崦筛[的病機(jī)，結(jié)合多年臨床經(jīng)驗(yàn)組方而成，由石菖蒲、遠(yuǎn)志、人參、茯苓、熟地等中藥組成，具有培元固本，化痰清腦的作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，補(bǔ)元清腦顆?？梢悦黠@提高APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠學(xué)習(xí)記憶能力，提高APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠海馬組織Bcl-2蛋白相對(duì)表達(dá)量，且結(jié)果與多奈哌齊無明顯差別，說明補(bǔ)元清腦顆粒對(duì)AD模型小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力具有較好的改善作用，且具有一定的抗神經(jīng)元凋亡作用。

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（收稿：2016-04-09 修回：2016-06-22）

Effect of Buyuanqingnaokeli on the Ability of Learning and Memory and the Expression of Bax and Bcl-2 in APP/PS1DoubleTransgenicMice

PAN Yihong1,WANG Ping2. 1DepartmentofChineseMedicine,Hangzhou First People's Hospital,Hangzhou(310006),China;2 Institute of Geratology,Hubei University of Chinese Medicine,Wuhan(430065),China

ObjectiveTo investigate the effect of buyuanqingnaokeli on the ability of learning and memory and the expression of Bax and Bcl-2 in APP/PS1 double transgenic mice.MethodsForty APP/PS1 double transgenic mouse models were established and divided into 4 groups：model group,western medicine(donepezil)group, buyuanqingnaokeli (BYQNK)high-dose and low-dose groups,with 10 mice in each.Ten C57BL/6J mice with the same months of age and genetic background served as blank group.The equivalent volume of saline was given to model and blank groups.After gavage the corresponding drugs once a day for 30 days,Morris test was measured to assess the ability of learning and memory,and Bax and Bcl-2 in the hippocampus tissue of different groups were detected with Western Blot.ResultsCompared to model group,BYQNKL high-dose and low-dose groups had reduced platform latency(37.90±20.10s vs 66.98±21.00s,P＜0.01;47.65±22.93s vs 66.98±21.00s,P＜0.05),total swimming distance(414.94±171.10cm,559.72±178.76cm vs 1032.12±118.66cm,P＜0.01)and the time to reach the original platform for the first time(21.36±20.22s,27.82±21.96s vs 51.71±20.96s,P＜0.01),target quadrant time (17.71±7.58s,14.07±7.08s vs 5.55±4.42s,P＜0.01)and increased through platform number (5.90±1.60,4.60±1.71 vs 1.80±1.41,P＜0.01 or P＜0.05)and the relative transcript level of Bcl-2(0.52±0.07,0.42±0.06 vs 0.15±0.06,P＜0.01 or P＜0.05).ConclusionBYQNKL can improve the ability of learning and memory of APP/PS1 doubletransgenic mice,showing certain anti-apoptosis effects.

Mice;Buyuanqingnaokeli;Alzheimer's disease;Morris test;Western Blot

國家自然科學(xué)基金重點(diǎn)項(xiàng)目（No.81130064）

1杭州市第一人民醫(yī)院中醫(yī)科（杭州 310006）；2湖北中醫(yī)藥大學(xué)（武漢 430065）

王平，Tel：027-68890008；E-mail：pwang@aliyun.com