黃曉黎 陳益民 駱 豐

山楂總黃酮對(duì)人肝細(xì)胞低密度脂蛋白受體表達(dá)的影響

黃曉黎 陳益民 駱 豐

目的觀察山楂總黃酮對(duì)人肝細(xì)胞（HePG2）低密度脂蛋白受體表達(dá)的影響。方法用MTT法篩選出合適的山楂總黃酮作用濃度，用含不同濃度的山楂總黃酮培養(yǎng)液培養(yǎng)人肝細(xì)胞，基于細(xì)胞免疫技術(shù)，用熒光顯微鏡結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定人肝細(xì)胞膜低密度脂蛋白受體的表達(dá)量和表達(dá)活性。結(jié)果隨著山楂總黃酮濃度升高，人肝細(xì)胞低密度脂蛋白受體的表達(dá)量和表達(dá)活性增加。5、15、25μmol/L的山楂總黃酮在每10 000個(gè)人肝細(xì)胞中的肝細(xì)胞膜低密度脂蛋白受體表達(dá)量的平均熒光強(qiáng)度分別為11.21、14.39、19.67；每10 000個(gè)人肝細(xì)胞中的肝細(xì)胞膜低密度脂蛋白受體表達(dá)活性分別為6.34、10.11、16.77。結(jié)論山楂總黃酮能顯著增加人肝細(xì)胞膜低密度脂蛋白受體的表達(dá)。

山楂總黃酮；人肝細(xì)胞；低密度脂蛋白受體；細(xì)胞免疫；流式細(xì)胞術(shù)

低密度脂蛋白（LDL）是膽固醇在人體血清中的主要存在形式，低密度脂蛋白濃度異常升高是造成冠狀動(dòng)脈粥樣硬化的主要原因之一。位于肝細(xì)胞膜上的LDL受體通過受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用能夠吸收和降解血漿中的低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C），因此LDL受體在調(diào)節(jié)低密度脂蛋白代謝和維持血漿膽固醇平衡方面起著非常重要的作用[1]。研究[2]表明，從山楂葉中提取的山楂總黃酮，具有明顯的降膽固醇作用。人肝細(xì)胞（HePG2）LDL受體含量豐富，山楂總黃酮對(duì)人肝細(xì)胞（HePG2）的LDL受體表達(dá)的影響尚未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)通過研究山楂總黃酮對(duì)HePG2的LDL受體表達(dá)的影響，探討山楂總黃酮的調(diào)脂作用部位和機(jī)制，闡明山楂總黃酮的作用靶點(diǎn)。

1 材料與儀器

1.1 材料及試劑 HePG2：中科院上海細(xì)胞庫(kù)提供；山楂總黃酮標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥98%）：購(gòu)自安徽甙爾塔天然有機(jī)化合物信息中心，批號(hào)20130520?？贵w：一抗：兔抗牛LDLR-IgG（浙江中醫(yī)藥大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院制備），二抗：羊抗兔IgG-FITC（晶美生物工程公司）。DIL-LDL（浙江中醫(yī)藥大學(xué)制備）。

1.2 儀器及耗材 SW-CJ-IF層流超凈工作臺(tái)（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司），CO2培養(yǎng)箱（Heraeus），LDZ5-2型低速臺(tái)式離心機(jī)（北京醫(yī)用離心機(jī)廠），臺(tái)式微量高速離心機(jī)（Heraeus），倒置顯微鏡（XDS-1B，COIC），熒光顯微鏡（德國(guó)Leica公司），Labsystems Dragon Wellscan MK-3型全自動(dòng)多功能型酶標(biāo)儀（Thermo Labsystems），流式細(xì)胞儀（Coulter EPICS RXL）。

2 方法

2.1 MTT法測(cè)定山楂總黃酮測(cè)定對(duì)HePG2細(xì)胞增殖的影響 以山楂總黃酮濃度梯度0、5、15、25、30、35、40μmol/L分7組，每組5個(gè)復(fù)孔。選擇對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞HePG2，接種于96孔板；按照分組加入相應(yīng)濃度的山楂總黃酮；空白組只加培養(yǎng)液。每孔加入5mg/mL MTT溶液，在波長(zhǎng)為570nm處檢測(cè)每孔吸光度（A），根據(jù)（A）判定藥物對(duì)細(xì)胞增殖的影響。

2.2 LDL受體表達(dá)活性檢測(cè) 設(shè)山楂總黃酮0、5、15、25μmol/L 4個(gè)濃度組，選擇對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞HePG2，接種于96孔板；按分組加入山楂總黃酮，使其終濃度分別達(dá)到0、5、15、25μmol/L；收集細(xì)胞后加入DIL-LDL孵育；采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)。

2.3 LDL受體表達(dá)量的檢測(cè) 設(shè)山楂總黃酮0、5、15、25umol/L 4個(gè)濃度組，選擇對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞HePG2，接種于96孔板；按分組加入山楂總黃酮，使其終濃度分別達(dá)到0、5、15、25μmol/L；一抗孵育：將細(xì)胞收集清洗后加入兔抗牛LDLR IgG，孵育2h；二抗孵育：將細(xì)胞收集清洗加入羊抗兔IgG-FITC，繼續(xù)孵育2h；采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用Excel統(tǒng)計(jì)工具分析，對(duì)MTT的結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s） 表示，采用t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 山楂總黃酮對(duì)人肝細(xì)胞增殖的影響 MTT結(jié)果顯示，0～30μmol/L的山楂總黃酮對(duì)人肝細(xì)胞的增殖影響差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

表1 山楂總黃酮對(duì)人肝細(xì)胞增殖的影響（±s）

表1 山楂總黃酮對(duì)人肝細(xì)胞增殖的影響（±s）

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3.2 山楂總黃酮對(duì)人肝細(xì)胞HePG2 LDL受體表達(dá)活性的影響 因0～30μmol/L的山楂總黃酮對(duì)人肝細(xì)胞增殖影響差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），故選擇5、15、25μmol/L三個(gè)濃度。隨著山楂總黃酮以0、5、15、25μmol/L濃度遞增，其平均熒光強(qiáng)度也隨著逐漸增大，分別為3.11、6.34、10.11、16.77，表明HePG2 LDL受體表達(dá)活性隨著山楂總黃酮濃度的提高而增強(qiáng)。見圖1（封四）。

3.3 山楂總黃酮對(duì)人肝細(xì)胞HePG2 LDL受體表達(dá)量的影響 隨著山楂總黃酮0、5、15、25μmol/L濃度的增高，其平均熒光強(qiáng)度也隨著逐漸增大，分別為6.11、11.21、14.39、19.67，表明HePG2 LDL受體表達(dá)量隨著山楂總黃酮濃度的提高而增加。見圖2（封四）。

4 討 論

研究[2]表明，從山楂葉中提取的山楂總黃酮，具有明顯的降低膽固醇和甘油三酯作用。但至今較少?gòu)募?xì)胞和分子水平作研究。本實(shí)驗(yàn)通過分析山楂總黃酮對(duì)人肝癌細(xì)胞HePG2 LDL受體表達(dá)的影響，研究其降脂作用部位和作用機(jī)制。

MTT法是一種準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便、快速的測(cè)定細(xì)胞增殖與抑制的方法。本實(shí)驗(yàn)通過MTT法檢測(cè)0～40μmol/L的山楂總黃酮溶液對(duì)細(xì)胞增殖的影響。結(jié)果顯示，山楂總黃酮溶液濃度在0～30μmol/L范圍內(nèi)山楂總黃酮溶液對(duì)人肝細(xì)胞增殖的影響差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），說明對(duì)HePG2細(xì)胞生長(zhǎng)基本沒有影響。故本實(shí)驗(yàn)選擇5、15、25μmol/L三個(gè)藥物濃度。

熒光顯微鏡和流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果表明，隨著15～25μmol/L濃度的增加，山楂總黃酮溶液能顯著增加HePG2 LDL受體的表達(dá)活性。通過檢測(cè)抗體表達(dá)量而間接測(cè)定受體表達(dá)量，15～25μmol/L的山楂總黃酮溶液能顯著增加HePG2 LDL受體的表達(dá)量，顯示隨著山楂總黃酮濃度的增高，受體表達(dá)總量增多。綜上，15～25μmol/L的山楂總黃酮溶液能顯著增加HePG2 LDL受體的表達(dá)。由于LDL受體表達(dá)受又多種信號(hào)調(diào)控通路的影響（SREBP途徑，ERK途徑）[3-4]，對(duì)于其分子機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

［1］李月琴，張淑華.中國(guó)漢族人群LDL受體基因Nco I多態(tài)性及其與血清高膽固醇的相關(guān)性研究［J］.中華醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)雜志，2001，18（5）：406-407.

［2］王玲，吳軍林，吳清平，等.山楂降血脂作用和機(jī)理研究進(jìn)展［J］.食品科學(xué)，2015，36（15）：245-248.

［3］Wang YG，Yang TL.Liraglutide reduces oxidized LDL-inducedoxidative stress and fatty degeneration in Raw 264.7 cells involving the AMPK/SREBP1 pathway［J］.老年心臟病學(xué)雜志（英文版），2015，12（4）：410-416.

［4］Yu XH，Li XX，Zhao GJ，et al.MoOxLDL up-regulates Niemann-Pick type C1 expression through ERK1/2/COX-2/ PPARα-signaling pathway in macrophages［J］.生物化學(xué)與生物物理學(xué)報(bào)（英文版），2012，44（2）：119-128.

（收稿：2016-02-13 修回：2016-04-20）

Effect of Hawthorn Flavones on HePG2 Low-density Lipoprotein Receptors

HUANG Xiaoli,CHEN Yimin,LUO Feng Department of Clinical Laboratory,Zhejiang Chinese Medical Hospital,Hangzhou(310000),China

ObjectiveTo investigate the expression of HepG2 low-density lipoprotein（LDL）receptor affected by hawthorn flavones.MethodsMTT method was used to screen appropriate hawthorn flavone concentrations for culture of the HePG2 line.The numbers and activity of LDL receptorwere measured by cell immunity technology and flow cytometer technology.ResultsWith the increase in concentration of hawthorn flavones,the expression and activity of HepG2LDL receptorincreased.With 5-25 μmol/L amount of hawthorn flavone,the geometric mean of fluorescenevalue of LDL receptors on 10000 HepG2cellswas11.21,14.39,19.67 and the activity valuewas 6.34,10.11,16.77,respectively.ConclusionHawthorn flavones can up-regulate the expression of LDL receptorson HepG2.

hawthorn flavones;HepG2;lower-density lipoprotein receptor;cell immunity;flow cytometry

浙江省中醫(yī)院檢驗(yàn)科（杭州 310000）

黃曉黎，Tel：13758253131；E-mail：huangxiaoli8676@163.com