章艷斐

桔梗皂苷D對(duì)腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體抗肺癌細(xì)胞活性的影響

章艷斐

目的探討中藥活性成分桔梗皂苷D對(duì)腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體（TRAIL）抗肺癌細(xì)胞活性的影響及其機(jī)制。方法將人肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549分為對(duì)照組、桔梗皂苷D組、TRAIL組及桔梗皂苷D聯(lián)合TRAIL組，MTT法檢測(cè)A549細(xì)胞活力，Annexin V/PI染色檢測(cè)A549細(xì)胞凋亡，免疫共沉淀法檢測(cè)A549細(xì)胞RIP1-FADD-caspase-8復(fù)合物的形成，Western blot法檢測(cè)A549細(xì)胞caspase-8的活化。結(jié)果對(duì)照組、桔梗皂苷D組、TRAIL組、桔梗皂苷D+TRAIL組對(duì)A549細(xì)胞活力的抑制率分別為0、（7.6±0.7）%、（13.4±1.0）%、（60.3±4.2）%，桔梗皂苷D組、TRAIL組、桔梗皂苷D+TRAIL組的細(xì)胞活力抑制率與對(duì)照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。對(duì)照組、桔梗皂苷D組、TRAIL組、桔梗皂苷D+TRAIL組對(duì)A549細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)率分別為（1.6±0.2）%、（4.5±0.3）%、（7.2±0.5）%、（40.2±2.8）%，TRAIL組、桔梗皂苷D+TRAIL組的細(xì)胞凋亡率較對(duì)照組有明顯提高（P＜0.05）。桔梗皂苷D+TRAIL組A549細(xì)胞內(nèi)的RIP1-FADD-caspase-8復(fù)合物水平及caspase-8的活化程度顯著提高。RIP1 siRNA及z-IETD-fmk能顯著抑制桔梗皂苷D對(duì)TRAIL的協(xié)同作用。對(duì)照組、桔梗皂苷D+TRAIL組、桔梗皂苷D+TRAIL+RIP1 siRNA組、桔梗皂苷D+TRAIL+z-IETD-fmk組對(duì)A549細(xì)胞活力的抑制率分別為0、（61.2±5.0）%、（24.5±1.9）%、（17.5±1.7）%，與桔梗皂苷D+ TRAIL組比較，桔梗皂苷D+TRAIL+RIP1 siRNA組、桔梗皂苷D+TRAIL+z-IETD-fmk組的細(xì)胞活力抑制率明顯降低（P＜0.05）。對(duì)照組、桔梗皂苷D+TRAIL組、桔梗皂苷D+TRAIL+RIP1 siRNA組、桔梗皂苷D+TRAIL+z-IETD-fmk組對(duì)A549細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)率分別為（1.8±0.2）%、（39.5±2.6）%、（12.3±1.1）%、（9.4±0.8）%，與桔梗皂苷D+TRAIL組比較，桔梗皂苷D+TRAIL+RIP1 siRNA組、桔梗皂苷D+TRAIL+z-IETD-fmk組的細(xì)胞凋亡率明顯降低（P＜0.05）。結(jié)論桔梗皂苷D可能通過促進(jìn)死亡受體復(fù)合物的形成，增強(qiáng)TRAIL對(duì)肺癌細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)效應(yīng)。

人肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549；桔梗皂苷D；TRAIL；caspase-8；凋亡

肺癌是危害人類健康的世界性難題，死亡率居所有惡性腫瘤的首位，我國(guó)肺癌的5年存活率不足15%[1]。腫瘤壞死因子相關(guān)的凋亡誘導(dǎo)配體（TNF-related apoptosis-inducing ligand，TRAIL）是TNF家族的成員，能與死亡受體4（DR4）或死亡受體5 （DR5）結(jié)合，從而激活半胱天冬酶-8（caspase-8）并誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡[2]。研究發(fā)現(xiàn)，很多腫瘤細(xì)胞對(duì)TRAIL的抗腫瘤作用不敏感，并能抵抗TRAIL依賴的凋亡效應(yīng)[3-4]。因此研究如何提高腫瘤細(xì)胞對(duì)TRAIL的敏感性是目前研究工作的重點(diǎn)。本文探討桔梗皂苷D是否能提高肺癌細(xì)胞對(duì)TRAIL治療的敏感性并研究其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材 料 噻唑藍(lán)（3-（4，5-dimethylthiazol-2-yl）-2，5-diphenyltetrazolium bromide，MTT），桔梗皂苷D(osthole)，z-IETD-fmk，Annexin V/PI凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)于美國(guó)Sigma-Aldrich。腫瘤壞死因子凋亡誘導(dǎo)配體（TRAIL）購(gòu)于美國(guó)R&D Systems。細(xì)胞蛋白提取液、RIP1（受體相互作用蛋白激酶1）、FADD（Fas相關(guān)死亡域蛋白）、caspase-8、cIAP2（細(xì)胞凋亡抑制蛋白2）和β-肌動(dòng)蛋白（β-actin）抗人抗體購(gòu)于美國(guó)Cell Signa-ling。蛋白G免疫共沉淀瓊脂糖珠購(gòu)于美國(guó)Santa Cruz。RIP1 siRNA購(gòu)于上海吉瑪生物，序列為：正向：5’-GGGCGAUAUUUGCAAAUAAUU-3’，反向：5’-UUAUUUGCAAAUAUCGCCCUU-3’。Lipofectamine 2000購(gòu)于美國(guó)Invitrogen。ECL（增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光底物）試劑盒購(gòu)于美國(guó)Pierce。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 人肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549購(gòu)于美國(guó)ATCC（美國(guó)模式菌種收集中心）。細(xì)胞系培養(yǎng)在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，在37°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，通入5%CO2。

1.3 細(xì)胞活力檢測(cè) 將A549細(xì)胞按5×103/孔接種在96孔板上，對(duì)照組為A549細(xì)胞不加藥物培養(yǎng)48h，桔梗皂苷D組為在A549細(xì)胞培養(yǎng)體系中加入5μmol/L的桔梗皂苷 D培養(yǎng) 48h，TRAIL組為在A549細(xì)胞培養(yǎng)體系中加入5pg/L的TRAIL培養(yǎng)48h，桔梗皂苷D聯(lián)合TRAIL組為在A549細(xì)胞培養(yǎng)體系中加入5μmol/L的桔梗皂苷 D和 5pg/L的TRAIL培養(yǎng)48h。培養(yǎng)完畢后加20μL的5g/L MTT再培養(yǎng)4h。棄上清，往孔中加入150μL二甲亞砜，570nm波長(zhǎng)下用酶標(biāo)儀檢測(cè)OD值，細(xì)胞活力抑制率用以下公式計(jì)算：抑制率=（OD對(duì)照組-OD實(shí)驗(yàn)組）/ OD對(duì)照組×100%。

1.4 免疫共沉淀 將A549細(xì)胞按5×105/孔接種在6孔板上，對(duì)照組為A549細(xì)胞不加藥物培養(yǎng)48h，桔梗皂苷D組在A549細(xì)胞培養(yǎng)體系中加入5μmol/L的桔梗皂苷D培養(yǎng)48h，TRAIL組為在A549細(xì)胞培養(yǎng)體系中加入5pg/L的TRAIL培養(yǎng)48h，桔梗皂苷D聯(lián)合 TRAIL組為在A549細(xì)胞培養(yǎng)體系中加入5μmol/L的桔梗皂苷D和5pg/L的TRAIL培養(yǎng)48h。之后將細(xì)胞用免疫沉淀緩沖液裂解。緩沖液成分：50 mmol/L Tris–HCl（pH7.4），1%NP-40細(xì)胞裂解液，150mmol/L NaCl，1mmol/L EDTA，1%混合蛋白酶抑制劑（Sigma-Aldrich）。裂解后的細(xì)胞在12 000g下離心10min，收取上清液加入RIP1抗體孵育過夜，之后加入蛋白G瓊脂糖珠孵育2h。免疫沉淀反應(yīng)后，在1200g速度下離心5min，將瓊脂糖珠離心至管底，之后將上清小心吸去，瓊脂糖珠用免疫沉淀緩沖液洗滌2次后加入western blot上樣緩沖液，沸水浴煮5min。

1.5 Western blot實(shí)驗(yàn) 將A549細(xì)胞按5×105/孔接種在6孔板上，對(duì)照組為A549細(xì)胞不加藥物培養(yǎng)48h，桔梗皂苷D組為在A549細(xì)胞培養(yǎng)體系中加入5μmol/L的桔梗皂苷 D培養(yǎng) 48h，TRAIL組為在A549細(xì)胞培養(yǎng)體系中加入5pg/L的TRAIL培養(yǎng)48h，桔梗皂苷D聯(lián)合TRAIL組為在A549細(xì)胞培養(yǎng)體系中加入 5μmol/L的桔梗皂苷D和5pg/L的TRAIL培養(yǎng)48h。之后將細(xì)胞用生理鹽水洗滌兩遍后提取總蛋白質(zhì)。將蛋白提取液或免疫共沉淀處理樣品用12.5%SDS-PAGE進(jìn)行電泳分離。分離完畢后通過電轉(zhuǎn)方法將蛋白質(zhì)從分離膠上轉(zhuǎn)到PVDF膜上，用RIP1、FADD、caspase-8、cIAP2、β-actin抗體孵育過夜，之后再用帶辣根過氧化物酶的二抗孵育2h，蛋白條帶用ECL試劑盒顯色發(fā)光。目的蛋白的相對(duì)表達(dá)用目標(biāo)蛋白灰度值與β-actin灰度值的比值表示，蛋白灰度值分析用Image J軟件處理。對(duì)于免疫共沉淀結(jié)果，Input表示在加入RIP1抗體和瓊脂糖珠之前，預(yù)先留取的相同含量的樣品蛋白作為對(duì)照。IP：RIP1表示加入RIP1抗體和瓊脂糖珠之后的免疫共沉淀蛋白。

表1 桔梗皂苷D促進(jìn)TRAIL對(duì)肺癌細(xì)胞的抗腫瘤活性（±s）

表1 桔梗皂苷D促進(jìn)TRAIL對(duì)肺癌細(xì)胞的抗腫瘤活性（±s）

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.05；與TRAIL組比較，△P＜0.05

組別對(duì)照組桔梗皂苷D組TRAIL組桔梗皂苷D+TRAIL組孔數(shù) 桔梗皂苷D濃度（μmol/L）TRAL濃度（pg/L）3 3 3 3 0 5 0 5 0 0 5 5細(xì)胞活力抑制率（%）0 7.6±0.7* 13.4±1.0* 60.3±4.2*△凋亡誘導(dǎo)率（%）1.6±0.2 4.5±0.3 7.2±0.5* 40.2±2.8*△

2 結(jié)果

2.1 桔梗皂苷D促進(jìn)TRAIL對(duì)肺癌細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)效應(yīng) MTT細(xì)胞活力實(shí)驗(yàn)及細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)顯示，桔梗皂苷D顯著提高TRAIL對(duì)A549細(xì)胞的殺傷活性和凋亡誘導(dǎo)活性，見表1。

2.2 桔梗皂苷D促進(jìn)TRAIL依賴的DISC的形成免疫共沉淀及Western blot實(shí)驗(yàn)顯示，桔梗皂苷D能顯著促進(jìn)TRAIL依賴的RIP1-FADD-caspase-8這一死亡受體復(fù)合物（DISC）的形成（圖1），進(jìn)而顯著激活細(xì)胞內(nèi)的caspase-8（圖2）。

圖1 桔梗皂苷D促進(jìn)TRAIL依賴的RIP1-FADD-caspase-8復(fù)合物的形成

圖2 桔梗皂苷D促進(jìn)TRAIL依賴的caspase-8的活化

2.3 桔梗皂苷D通過DISC-caspase-8途徑增強(qiáng)肺癌細(xì)胞對(duì)TRAIL的敏感性 轉(zhuǎn)染RIP1 siRNA或用caspase-8特異性抑制劑z-IETD-fmk[5]預(yù)處理后，桔梗皂苷D對(duì)TRAIL的協(xié)同抗腫瘤作用受到抑制，見表2。

3 討 論

研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤壞死因子相關(guān)的凋亡誘導(dǎo)配體（TRAIL）能選擇性誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡，卻不影響

1.6 細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn) 將A549細(xì)胞按5×105/孔接種在6孔板上，對(duì)照組為A549細(xì)胞不加藥物培養(yǎng)48h，桔梗皂苷D組為在A549細(xì)胞培養(yǎng)體系中加入5μmol/L的桔梗皂苷 D培養(yǎng) 48h，TRAIL組為在A549細(xì)胞培養(yǎng)體系中加入 5pg/L的TRAIL培養(yǎng)48h，桔梗皂苷D聯(lián)合TRAIL組為在A549細(xì)胞培養(yǎng)體系中加入 5μmol/L的桔梗皂苷D和5pg/L的TRAIL培養(yǎng)48h。之后將細(xì)胞用生理鹽水洗滌2次，按照凋亡試劑盒說明書步驟將PI（碘化丙啶）和Annexin-V加入細(xì)胞中孵育20min，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)腫瘤細(xì)胞的凋亡，凋亡率用annexin-V陽(yáng)性、PI陰性細(xì)胞數(shù)占總細(xì)胞數(shù)的百分比表示。正常組織細(xì)胞的功能，因此，TRAIL被認(rèn)為是一種有很好前景的低毒抗腫瘤藥物[6-7]。然而一些腫瘤細(xì)胞對(duì)TRAIL的抵抗性限制了TRAIL的臨床應(yīng)用，因此研究如何提高腫瘤細(xì)胞對(duì)TRAIL的敏感性是目前研究工作的重點(diǎn)。桔梗皂苷D是桔?？傇碥盏闹饕钚猿煞?，具有抗炎、鎮(zhèn)痛和免疫調(diào)節(jié)的作用，最近也有文獻(xiàn)報(bào)道，桔梗皂苷D具有一定的抗腫瘤活性，如桔梗皂苷D能抑制肝癌細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移和細(xì)胞周期[8-9]。然而，桔梗皂苷D對(duì)肺癌的輔助治療作用卻很少報(bào)道。本研究發(fā)現(xiàn)桔梗皂苷D能顯著提高TRAIL對(duì)肺癌細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)能力。

表2 桔梗皂苷D通過DISC-caspase-8途徑增強(qiáng)肺癌細(xì)胞對(duì)TRAIL的敏感性（±s）

表2 桔梗皂苷D通過DISC-caspase-8途徑增強(qiáng)肺癌細(xì)胞對(duì)TRAIL的敏感性（±s）

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.05；與桔梗皂苷D+TRAIL組比較，△P＜0.05

組別對(duì)照組桔梗皂苷D+TRAIL組桔梗皂苷D+TRAIL+RIP1 siRNA組桔梗皂苷D+TRAIL+z-IETD-fmk組孔數(shù)桔梗皂苷D濃度（μmol/L）TRAL濃度（pg/L）RIP1 siRNA濃度（pmol/ml）z-IETD-fmk濃度（μmol/L）3 3 3 3 0 5 5 5 0 5 5 5 0 0 5 0 0 0 0 0 2 0細(xì)胞活力抑制率（%）0 61.2±5.0* 24.5±1.9△17.5±1.7△凋亡誘導(dǎo)率（%）1.8±0.2 39.5±2.6* 12.3±1.1△9.4±0.8△

當(dāng)TRAIL與其細(xì)胞表面的DR4和DR5受體結(jié)合后，能募集RIP1，進(jìn)而形成RIP1-FADD-caspase-8這一死亡受體復(fù)合物（death-inducing signaling complex，DISC），最后激活caspase-8依賴的凋亡途徑[10]。因此，為了研究桔梗皂苷D提高A549細(xì)胞對(duì)TRAIL敏感性的機(jī)制，筆者采用免疫共沉淀技術(shù)研究DISC的形成。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，桔梗皂苷D能顯著增加FADD蛋白、前體caspase-8蛋白與RIP1蛋白的結(jié)合，并且桔梗皂苷D也能促進(jìn)caspase-8的活化。而當(dāng)用RIP1 siRNA沉默RIP1的表達(dá)，以減少RIP1-FADD-caspase-8復(fù)合物的水平，或用z-IETD-fmk阻斷caspase-8的活化后，桔梗皂苷D對(duì)TRAIL的協(xié)同作用喪失，顯示桔梗皂苷D通過促進(jìn)死亡受體復(fù)合物的形成，增強(qiáng)TRAIL對(duì)肺癌細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)效應(yīng)。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，桔梗皂苷D能顯著提高肺癌細(xì)胞對(duì)TRAIL的敏感性。通過機(jī)制研究我們發(fā)現(xiàn)桔梗皂苷D能使肺癌細(xì)胞在TRAIL的治療下易于形成死亡受體復(fù)合物，進(jìn)而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞進(jìn)入凋亡程序。這些研究為如何提高TRAIL的抗腫瘤活性提供了新的思路和理論依據(jù)。

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（收稿：2015-12-23 修回：2016-03-03）

Platycodin-DPromotes TRAIL-induced Apoptosis in Lung Cancer

ZHANG Yanfei.Department of Pathology,Central Hospital of Jinhua City,Jinhua(321000),China

ObjectiveTo investigate the role of platycodin-Din TNF-related apoptosis-inducing ligand（TRAIL）-induced cell death in lung cancer.MethodsThe A549 cells were divided into control group,platycodin-D group, TRAIL group,and platycodin-D+TRAIL group,then the cell death,cell apoptosis,and the formation of RIP1-FADD-caspase-8 complex were detected by MTT assay,AnnexinⅤ/PI staining,and co-immunoprecipitation,respectively.The activation of caspase-8 in A549 cells was evaluated by western blot assay.ResultsThe cell viability inhibitory rate of A549 cells in control group,platycodin-D group,TRAIL group,and platycodin-D+TRAIL group was as follows：0,（7.6±0.7）%,（13.4±1.0）%,and（60.3±4.2）%;significant differences in the cell viability inhibitory ratewas found between control group and platycodin-D group,TRAIL group,and platycodin-D+TRAIL group（all P＜0.05）.The apoptotic ratio of A549 cells in control group,platycodin-D group,TRAIL group,and platycodin-D+TRAIL group was as follows：（1.6±0.2）%,（4.5±0.3）%,（7.2±0.5）%,and（40.2±2.8）%,with significant differences between control group and TRAIL group and platycodin-D+TRAIL group（all P＜0.05）.The formation of RIP1-FADD-caspase-8 complex and the activation of caspase-8 in TRAIL-treated A549 cells were signifi-cantly increased in platycodin-D+TRAIL group.Treatment of RIP1 siRNA and z-IETD-fmk significantly impaired the synergistic effect of platycodin-D on TRAIL-induced cell death.The cell viability inhibitory rate of A549 cells in control group,platycodin-D+TRAIL group,platycodin-D+TRAIL+RIP1 siRNA group,and platycodin-D+TRAIL+z-IETD-fmk group was as follows：0,（61.2±5.0）%,（24.5±1.9）%,（17.5±1.7）%;significant differences in the cell viability inhibitory ratewas noted between platycodin-D+TRAIL groupandplatycodin-D+TRAIL+RIP1 siRNA groupand platycodin-D+TRAIL+z-IETD-fmk group（all P＜0.05）.The apoptotic rate of A549 cells in control group,platycodin-D+TRAIL group,platycodin-D+TRAIL+RIP1 siRNA group,and platycodin-D+TRAIL+z-IETD-fmk group was as follows：（1.8±0.2）%,（39.5±2.6）%,（12.3±1.1）%,and（9.4±0.8）%,with significant differences betweenplatycodin-D+TRAIL groupand platycodin-D+TRAIL+RIP1 siRNA groupand platycodin-D+TRAIL+z-IETD-fmk group（all P＜0.05）.Conclusionplatycodin-D promotes TRAIL-induced apoptosis by the formation of RIP1-FADD-caspase-8 complex in lung cancer.

human lung cancer cell line A549;platycodin-D;TRAIL;caspase-8;apoptosis

浙江省金華市中心醫(yī)院病理科（金華 321000）