林思恒1, 2, 3, 4, 吳富村1, 3, 4, 張國(guó)范1, 3, 4

(1. 中國(guó)科學(xué)院 海洋研究所 實(shí)驗(yàn)海洋生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 山東 青島 266071; 2. 中國(guó)科學(xué)院大學(xué), 北京100049; 3. 海洋科學(xué)與技術(shù)國(guó)家實(shí)驗(yàn)室 海洋生物學(xué)與生物技術(shù)功能實(shí)驗(yàn)室, 山東 青島 266071; 4. 中國(guó)科學(xué)院 海洋研究所 海洋生態(tài)養(yǎng)殖技術(shù)國(guó)家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室, 山東 青島 266071)

高溫脅迫下皺紋盤鮑不同養(yǎng)殖群體心率變化比較

林思恒1, 2, 3, 4, 吳富村1, 3, 4, 張國(guó)范1, 3, 4

(1. 中國(guó)科學(xué)院 海洋研究所 實(shí)驗(yàn)海洋生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 山東 青島 266071; 2. 中國(guó)科學(xué)院大學(xué), 北京100049; 3. 海洋科學(xué)與技術(shù)國(guó)家實(shí)驗(yàn)室 海洋生物學(xué)與生物技術(shù)功能實(shí)驗(yàn)室, 山東 青島 266071; 4. 中國(guó)科學(xué)院 海洋研究所 海洋生態(tài)養(yǎng)殖技術(shù)國(guó)家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室, 山東 青島 266071)

高溫是海水貝類度夏死亡的環(huán)境誘因之一。本研究應(yīng)用一種非損傷性的心率檢測(cè)方法, 檢測(cè)兩個(gè)皺紋盤鮑養(yǎng)殖群體在高溫脅迫條件下心率等生理指標(biāo)的變化, 嘗試以心率變化指標(biāo)比較這兩個(gè)群體高溫耐受能力。由于高溫脅迫下皺紋盤鮑的心率隨溫度變化的關(guān)系符合阿倫尼烏斯(Arrhenius)公式, 且心率隨溫度上升呈先上升后下降趨勢(shì), 該研究通過計(jì)算兩者直線擬合拐點(diǎn)即阿倫尼烏斯拐點(diǎn)溫度(ABT, Arrhenius break temperatures)指標(biāo), 用以指示皺紋盤鮑溫度耐受程度。以此法對(duì)皺紋盤鮑兩個(gè)群體(高溫耐性, 對(duì)照)各17個(gè)個(gè)體進(jìn)行了測(cè)定分析, 結(jié)果表明: 兩個(gè)群體間的ABT存在顯著差異, 高溫耐性組的皺紋盤鮑的ABT顯著高于對(duì)照組(P＜0.05); 個(gè)體ABT指標(biāo)的高低與測(cè)定個(gè)體的殼高呈正相關(guān)(P＜0.05)。本研究首次將探討了高溫脅迫下皺紋盤鮑心率變化規(guī)律, 并以ABT為指標(biāo)分析比較了兩個(gè)皺紋盤鮑養(yǎng)殖群體間高溫耐受能力, 結(jié)果對(duì)研究皺紋盤鮑和其它貝類溫度脅迫下生理響應(yīng)及抗逆選育具一定借鑒意義。

皺紋盤鮑(Haliotis discus hannai); 心率測(cè)定; 高溫脅迫; ABT

鮑養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)隨著雜交技術(shù)的產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用及淺海養(yǎng)殖技術(shù)等的革新, 年產(chǎn)量已超過100000 t。近年來(lái),皺紋盤鮑(Haliotis discus hannai)已經(jīng)成為福建海區(qū)的主要養(yǎng)殖鮑物種, 且福建的養(yǎng)殖鮑產(chǎn)量約占全國(guó)總產(chǎn)量85%。然而皺紋盤鮑作為北方自然分布的物種, 在轉(zhuǎn)移到南方海區(qū)的養(yǎng)殖過程中, 尤其是近年來(lái)遭遇了度夏死亡的問題, 每年的度夏死亡造成了皺紋盤鮑養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的巨大損失[1-2]。

夏季大規(guī)模死亡一直是困擾經(jīng)濟(jì)貝類的主要問題之一, 雖然根本原因尚未有定論, 但學(xué)界普遍認(rèn)為是環(huán)境因素[3-4]、貝類生物的生理狀態(tài)[5-6]和病原微生物的富集[7-9]等交互作用引起的。高溫是導(dǎo)致海水貝類夏季死亡的重要原因, 目前海水貝類高溫脅迫的生理響應(yīng)及適應(yīng)機(jī)制已成為研究熱點(diǎn), 已有許多研究針對(duì)貝類動(dòng)物高溫耐受能力進(jìn)行初步研究, 如對(duì)近江牡蠣的致死溫度[10]、高溫下蝦夷扇貝存活率[11]以及皺紋盤鮑幼苗高溫存活率的研究[12]。然而這些研究都是采用對(duì)貝類動(dòng)物進(jìn)行高溫脅迫, 逐漸升高處理溫度, 當(dāng)出現(xiàn)死亡時(shí), 記錄致死溫度的方法, 其表型記錄僅為生存與否(二分類數(shù)據(jù)), 且存在溫度測(cè)定不夠準(zhǔn)確的問題。開發(fā)新型的測(cè)皺紋盤鮑個(gè)體的高溫耐受能力的檢測(cè)方法及表型評(píng)價(jià)方法將有效解決這一問題。

心率的測(cè)定是一種重要的反映生物代謝水平變化的方法。衡量高溫脅迫時(shí)皺紋盤鮑的心率變化可以用于評(píng)估皺紋盤鮑對(duì)高溫的耐受能力。早在1990年, 無(wú)脊椎動(dòng)物心率就能通過紅外線信號(hào)的方法被穩(wěn)定測(cè)定[13], 阿倫尼烏斯拐點(diǎn)溫度(Arrhenius break temperatures, ABT)指標(biāo)最早在1996年被用于表現(xiàn)潮間帶瓷蟹的高溫耐受程度[14]。根據(jù)阿倫尼烏斯方程,心率與溫度兩者之間存在線性關(guān)系。通常動(dòng)物體的心率會(huì)先隨著溫度上升而上升, 表現(xiàn)了代謝速率的加快; 當(dāng)溫度超過了動(dòng)物體的承受范圍時(shí), 心率會(huì)隨著溫度上升而下降, 意味著機(jī)體受到了影響。這兩個(gè)階段過程中心臟活動(dòng)急劇下降的溫度被稱為ABT指標(biāo), 可以用于量化機(jī)體的高溫耐受程度。該方法具有非損傷性、進(jìn)行原位測(cè)定的優(yōu)點(diǎn), 而且得到的指標(biāo)可以精準(zhǔn)量化, 已經(jīng)用于濱螺、帽貝和貽貝等動(dòng)物的心率測(cè)定[15-16]。本研究首次探討了高溫脅迫下皺紋盤鮑心率變化規(guī)律, 并以ABT指標(biāo)分析比較了兩個(gè)皺紋盤鮑養(yǎng)殖群體間高溫耐受能力。本文對(duì)鮑等溫度脅迫下生理響應(yīng)及抗逆選育等研究等具一定借鑒意義。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究選取來(lái)自寧德海區(qū)(26°69′N, 119°72′E)和青島海區(qū)(36°25′N, 120°69′E)的兩個(gè)皺紋盤鮑養(yǎng)殖群體(均為一齡個(gè)體)。其中寧德海區(qū)的皺紋盤鮑群體對(duì)度夏存活性狀經(jīng)三代選育, 且一直在南方海區(qū)飼養(yǎng),具有相對(duì)較強(qiáng)的溫度耐受性。而青島海區(qū)皺紋盤鮑群體作為對(duì)照, 未經(jīng)度夏存活性狀選育, 假定其不具備高溫耐受性, 稱為對(duì)照群體。兩個(gè)皺紋盤鮑群體分別從海區(qū)運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室后, 在實(shí)驗(yàn)養(yǎng)殖池內(nèi)暫養(yǎng)兩周, 期間每日更換海水, 常規(guī)方法投喂至實(shí)驗(yàn)開始。之后分別從兩個(gè)群體內(nèi)挑選17個(gè)個(gè)體進(jìn)行心率測(cè)定。實(shí)驗(yàn)于2014年12月至2015年2月進(jìn)行, 該階段實(shí)驗(yàn)室養(yǎng)殖池海水溫度為10～12℃。

1.2 方法

1.2.1 心率測(cè)定方法

心率測(cè)定采用一種非損傷性的方法[17-18], 將紅外傳感器用藍(lán)丁膠(Blu-Tack, Bostik Ltd, UK)固定在鮑魚心臟對(duì)應(yīng)的殼表面[19]。心跳產(chǎn)生的光電流信號(hào)經(jīng)放大器(AMP 03, Heartbeat monitor, Newshift, Portugal)放大過濾處理后, 被記錄并展示在簡(jiǎn)易示波器軟件(Powerlab 8/30, AD Instruments, Germany)上, 利用內(nèi)置軟件(LabChart Version 8.0)可以計(jì)算出每分鐘心率(bpm)。

1.2.2 升溫設(shè)備

開始測(cè)定時(shí)將待測(cè)定的皺紋盤鮑個(gè)體與設(shè)備連接完好后, 放入設(shè)定為15℃的控溫循環(huán)水浴鍋內(nèi)(鮑魚實(shí)際放置在水浴鍋內(nèi)的裝有海水的圓形玻璃槽(25 cm× 25 cm×20 cm)內(nèi), 所測(cè)溫度均為海水溫度, 下同)。當(dāng)個(gè)體心率信號(hào)穩(wěn)定后, 開始升高水浴溫度, 每次增加0.5℃。每增加一次溫度后至海水溫度也上升0.5℃后, 維持2 min后再繼續(xù)升溫, 直至皺紋盤鮑腹足從玻璃槽壁脫離。實(shí)驗(yàn)過程中通過溫度測(cè)定儀嚴(yán)格記錄溫度(Fluke 54II, Fluke, WA, USA)。結(jié)合持續(xù)收集的心跳信號(hào), 可以得出升溫過程中每個(gè)溫度對(duì)應(yīng)的心率, 通過計(jì)算求得每個(gè)個(gè)體的ABT(℃)。

1.2.3 不同群體皺紋盤鮑個(gè)體心率測(cè)定

隨機(jī)選取高溫耐性和對(duì)照組的皺紋盤鮑群體一齡個(gè)體各17個(gè), 進(jìn)行心率測(cè)定, 升溫區(qū)間為15～35℃,持續(xù)時(shí)間不超過2 h, 并對(duì)每個(gè)實(shí)驗(yàn)個(gè)體進(jìn)行生長(zhǎng)性狀測(cè)定, 包括殼長(zhǎng)(mm)、殼高(mm)、殼寬(mm)和體濕質(zhì)量(g)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

用示波器Powerlab內(nèi)置軟件LabChart分析不同時(shí)間點(diǎn)的心率數(shù)據(jù), 選取升溫過程中溫度穩(wěn)定階段期間的心率作為該溫度對(duì)應(yīng)心率。根據(jù)阿倫尼烏斯方程

式中, k為每分鐘周期數(shù)(bpm); T為絕對(duì)溫度(K); Ea為活化能與R為前因子均在該公式中被認(rèn)為常數(shù)。

對(duì)溫度與心率進(jìn)行變換后, 利用Excel 2013和SPSS20.0 (IBM SPSS Inc., Chicago, IL, USA)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行作圖與分析。使用Excel的線性回歸分析功能對(duì)每個(gè)皺紋盤鮑個(gè)體心率值上升與下降階段進(jìn)行直線擬合, 繼而求出交點(diǎn)溫度ABT指標(biāo)。利用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)方法分析兩個(gè)群體間的ABT指標(biāo)顯著性差異,顯著性差異表示為P＜0.05。為分析皺紋盤鮑體尺及個(gè)體質(zhì)量性狀對(duì)心率ABT指標(biāo)的影響, 對(duì)不同個(gè)體的生長(zhǎng)性狀與ABT指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)分析并計(jì)算Pearson相關(guān)系數(shù)分析, 顯著相關(guān)表示為P＜0.05。

2 結(jié)果

兩個(gè)皺紋盤鮑群體17個(gè)個(gè)體均獲得有效心率測(cè)定結(jié)果。圖1為個(gè)體心率隨溫度變化示意圖, 可以看出不同溫度下心率周期的明顯差異。圖2為高溫耐性和對(duì)照群體中的各一個(gè)個(gè)體心率變化曲線的直線擬合, 通過該直線擬合獲得該個(gè)體的ABT指標(biāo)。表1為34個(gè)個(gè)體心率測(cè)定結(jié)果與生長(zhǎng)性狀測(cè)定結(jié)果(部分個(gè)體因死亡未記錄)。計(jì)算獲得兩個(gè)群體的平均ABT指標(biāo), 高溫耐性群體為(28.18±0.45)℃; 對(duì)照群體為(27.75±0.56)℃。經(jīng)t檢驗(yàn), 兩個(gè)群體的ABT存在顯著性差異, 高溫耐性組皺紋盤鮑的ABT顯著高于對(duì)照組, P為0.019。分析檢測(cè)個(gè)體的生長(zhǎng)性狀與ABT的關(guān)系, 發(fā)現(xiàn)只有殼高與ABT呈顯著相關(guān), 相關(guān)系數(shù)為0.370, P為0.048。

圖1 心率變化示意圖Fig. 1 Variation in cardiac response to thermal stress in Pacific abalone

圖2 ABT計(jì)算示意圖Fig. 2 ABT calculation method

表1 高溫耐性與對(duì)照群體皺紋盤鮑ABT(℃)與生長(zhǎng)性狀Tab. 1 ABT and growth traits of resistant and contrast abalones

3 討論

3.1 皺紋盤鮑ABT指標(biāo)的可行性分析

ABT指標(biāo)在濱螺、帽貝和貽貝中已有廣泛研究。這些貝類大多都是潮間帶生物, 它們多具有廣溫性的特點(diǎn), 有利于ABT指標(biāo)的測(cè)定。以帽貝為例, 溫度適宜范圍從4～50℃, 且不同物種之間的差異明顯,相差可達(dá)5℃以上。ABT指標(biāo)對(duì)于帽貝而言, 不僅可以衡量其高溫耐受程度, 更可作為一個(gè)環(huán)境監(jiān)測(cè)指標(biāo)反映不同種帽貝所處環(huán)境條件的差異[20]。雖然皺紋盤鮑不具備廣溫性, 但本實(shí)驗(yàn)證明了該方法在皺紋盤鮑中的可行性。首先, 兩個(gè)群體的ABT指標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)差均不高說明ABT指標(biāo)的組內(nèi)個(gè)體間差異不大。其次, 高溫耐性組ABT顯著高于對(duì)照組, 因此用于比較兩個(gè)群體的高溫耐受程度是科學(xué)可行的。值得注意的是一齡個(gè)體是最適合開展心率測(cè)定的,由于一齡個(gè)體體積較小(平均殼長(zhǎng)為40 mm), 心臟對(duì)應(yīng)位置殼表面積小于紅外探頭截面(4 mm×5 mm),可以快速穩(wěn)定獲得心率信號(hào)。而藍(lán)丁膠的粘貼需要將鮑魚殼表面擦干以增加粘貼時(shí)長(zhǎng), 一齡個(gè)體有利于縮短捕獲心率的時(shí)間。所以一齡個(gè)體更適合進(jìn)行心率測(cè)定實(shí)驗(yàn)。通過紅外探頭粘貼在鮑魚殼表面以檢測(cè)心率的方法也是皺紋盤鮑的生長(zhǎng)指標(biāo)中只有殼高與心率存在顯著相關(guān)的主要原因, 殼高會(huì)直接影響到心率信號(hào)的獲取。

開展心率測(cè)定的時(shí)間是影響實(shí)驗(yàn)的重要因素。皺紋盤鮑的最適生長(zhǎng)溫度范圍是10～22℃[21], 監(jiān)測(cè)皺紋盤鮑心率的起始溫度必須在該溫度范圍內(nèi), 且起始溫度越低越好。因?yàn)橛?jì)算ABT指標(biāo)過程中, 心率隨溫度上升而上升的階段越長(zhǎng), 趨勢(shì)線的計(jì)算越準(zhǔn)確。所以在水溫低的時(shí)候, 如11月至2月, 是進(jìn)行心率測(cè)定的最佳時(shí)間。測(cè)定心率時(shí)還應(yīng)注意實(shí)驗(yàn)時(shí)長(zhǎng)的控制, 本實(shí)驗(yàn)每個(gè)個(gè)體的心率測(cè)定時(shí)間均控制在2 h以內(nèi), 畢竟是在水浴條件內(nèi)進(jìn)行實(shí)驗(yàn), 并且還會(huì)出現(xiàn)超過ABT后的心率驟降現(xiàn)象, 作為一種非損傷性的檢測(cè)方法, 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的存活是也關(guān)鍵的考量。雖然本實(shí)驗(yàn)有部分個(gè)體在測(cè)定心率后出現(xiàn)了死亡,但相比傳統(tǒng)的表型記錄為生存與否以評(píng)估高溫耐受程度的方法, 已經(jīng)大幅提高了實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的存活率。

然而并非所有貝類生物都適用這一方法。本實(shí)驗(yàn)室亦用這一方法對(duì)長(zhǎng)牡蠣(Crassostrea gigas)和蝦夷扇貝(Patinopecten yessoensis)進(jìn)行心率測(cè)定。結(jié)果扇貝可以得到有效結(jié)果, 而牡蠣難以得到有效的心率信號(hào), 可能與牡蠣表面粗糙有關(guān)。

3.2 皺紋盤鮑ABT指標(biāo)的實(shí)際應(yīng)用

本實(shí)驗(yàn)選取的是兩個(gè)來(lái)源清晰, 能夠區(qū)分高溫抗性與對(duì)照的群體進(jìn)行ABT指標(biāo)的測(cè)定。結(jié)果與實(shí)際相符不僅說明了方法的可行性, 也為該方法作為比較群體或家系的高溫耐受程度的標(biāo)準(zhǔn)提供可能。很多品系的皺紋盤鮑經(jīng)過雜交育種后, 品質(zhì)得到改良[22-23], 但高溫耐受能力作為存活率的關(guān)鍵指標(biāo)卻無(wú)法合理科學(xué)的量化。心率測(cè)定ABT指標(biāo)的方法有效的改善這一問題, 比較多個(gè)家系間皺紋盤鮑的ABT指標(biāo)就可以比較這些家系的高溫耐受程度, 以此作為一種篩選手段, 亦可作為育種值, 針對(duì)高溫耐性進(jìn)行選育。該方法不僅快速有效, 還對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物具有較低致死性, 可以解決傳統(tǒng)的脅迫致死檢測(cè)法對(duì)一些珍貴的家系無(wú)法測(cè)定高溫耐受能力的困擾。

目前主要養(yǎng)殖海區(qū)的水溫監(jiān)測(cè)系統(tǒng)已經(jīng)開始使用, 結(jié)合皺紋盤鮑ABT指標(biāo)的推廣, 可以在海水溫度迫近養(yǎng)殖鮑魚耐受臨界溫度時(shí)及時(shí)調(diào)整養(yǎng)殖活動(dòng),降低皺紋盤鮑出現(xiàn)嚴(yán)重的度夏死亡的風(fēng)險(xiǎn)。

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Received: Feb.10, 2016

Variation in cardiac response to thermal stress in two different cultured populations of Pacific abalones

LIN Si-heng1,2,3,4, WU Fu-cun1,3,4, ZHANG Guo-fan1,3,4
(1. Key Laboratory of Experimental Marine Biology, Institute of Oceanology, Chinese Academy of Sciences, 7 Nanhai Road, Qingdao 266071, China; 2. University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China; 3. Laboratory for Marine Biology and Biotechnology, Qingdao National Laboratory for Marine Science and Technology, Qingdao 266071, China; 4. National & Local Joint Engineering Laboratory of Ecological Mariculture, Institute of Oceanology, Chinese Academy of Sciences, Qingdao 266071, China)

Haliotis discus hannai; measuring heart rate; thermal stress; Arrhenius break temperatures

High water temperature is one of the most important reasons for the low summer survival rate of Pacific abalones (Haliotis discus hannai). The temperature that induces cardiac failure in abalone is known as the Arrhenius break temperature (ABT). Survival indicators of Pacific abalones can be obtained by measuring their heart rate. In this study, heart rates were measured using a non-invasive method. We then obtained ABTs as biomarkers and used them to determine the heat resistance of abalones with high accuracy and speed. Abalone heart rates rose as the temperature increased and then dropped abruptly. In this study, we measured the heart rate in 17 resistant abalones and 17 contrast abalones from two different groups. The results indicate that the ABT of the resistant abalones seemed higher (P＜0.05) than that of the contrast abalones. In addition, there was a significant (P＜0.05) positive correlation between abalone shell height and ABT. For the first time, we determined the heat resistance of Pacific abalones by measuring heart rate and verified the feasibility of the method.

S917.4

A

1000-3096(2016)11-0084-07

10.11759/hykx20160328003

(本文編輯: 梁德海)

2016-02-10;

2016-04-08

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31302184); 貝類產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系項(xiàng)目(CARS-48); 泰山攀登計(jì)劃項(xiàng)目

[Foundation: National Natural Science Foundation of China, No. 31302184; The Earmarked Fund for Modern Agro-industry Technology Research System (CARS-48); Taishan Scholars Climbing Program of Shandong]

林思恒(1991-), 男, 福建廈門人, 碩士研究生, 研究方向:海洋貝類遺傳育種, E-mail: linsiheng@qq.com; 張國(guó)范, 通信作者,研究員, 博士研究生導(dǎo)師, E-mail: gfzhang@qdio.ac.cn