秦 蕾 梁 燕（西北農(nóng)林科技大學(xué)園藝學(xué)院，陜西楊凌 712100）

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辣椒抗煙草花葉病毒相關(guān)基因研究進(jìn)展

秦 蕾 梁 燕*
（西北農(nóng)林科技大學(xué)園藝學(xué)院，陜西楊凌 712100）

摘 要：煙草花葉病毒（TMV）可侵染番茄、辣椒等多種作物，研究表明辣椒TMV抗性主要由L基因控制，通過L基因與病毒CP互作觸發(fā)植物防御反應(yīng)，引起植物抗病相關(guān)基因的表達(dá)。本文綜述了近年來辣椒抗TMV的相關(guān)研究，總結(jié)了辣椒TMV抗性基因及其功能的研究進(jìn)展。

關(guān)鍵詞：辣椒；煙草花葉病毒；抗病基因；綜述

秦蕾，女，博士研究生，專業(yè)方向：辣椒TMV抗性基因挖掘與功能研究，E-mail：qinlei@nwsuaf.edu.cn

辣椒（Capsicum spp.）為茄科辣椒屬一年生或多年生植物，其果實(shí)VC含量豐富，具有獨(dú)特的辣香味，既是一種重要的蔬菜作物，也是重要的調(diào)味品，兼具經(jīng)濟(jì)價(jià)值和食療保健作用，在全國20多個(gè)省、市、自治區(qū)都有栽培。病毒病一直是威脅辣椒生產(chǎn)的重要因素，常引起辣椒葉片壞死、枯斑、褪綠，植株矮化，致落花、落果，對辣椒生產(chǎn)造成嚴(yán)重?fù)p失。目前，世界各地鑒定出侵染辣椒的病毒30余種，其中煙草花葉病毒（Tobacco mosaic virus，TMV）是威脅辣椒生產(chǎn)的主要病毒，常用于研究病毒與植物的互作機(jī)制。本文對國內(nèi)外辣椒抗TMV防御反應(yīng)中的抗病基因——L基因、編碼抗病相關(guān)蛋白（pathogenesis-related protein，PR）基因及相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子等研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，為明確辣椒TMV抗病機(jī)理，挖掘抗病種質(zhì)，選育抗性材料提供理論基礎(chǔ)。

1 煙　草花葉病毒

1.1 煙草花葉病毒的發(fā)現(xiàn)

Mayer（1886）首次發(fā)現(xiàn)TMV，它屬于煙草花葉病毒屬單鏈RNA病毒，基因組長6 395 bp，病毒RNA進(jìn)入宿主細(xì)胞后既可以復(fù)制也可以編碼病毒的復(fù)制酶、外殼蛋白（coat protein，CP）、運(yùn)動蛋白（movement protein，MP）（Wittmann & Wittmann，1967；Goelet et al.，1982）。TMV在世界范圍內(nèi)普遍發(fā)生，至少感染30個(gè)科的99種植物，尤其是煙草、番茄、辣椒等茄科作物。TMV主要通過植物種子和汁液摩擦傳毒，通過植物的微管組織，迅速侵染植株幼嫩組織，在植物葉片上產(chǎn)生淺綠或深綠色的病斑，影響植物的生長發(fā)育（程秉銓和彭湘儒，1994；Cheng et al.，2000；李明福 等，2012）。

1.2 煙草花葉病毒的分類

目前主要以血清學(xué)及病毒的氨基酸、核苷酸序列等為依據(jù)區(qū)分TMV的不同株系。Lartey等（1996）根據(jù)宿主不同，將煙草花葉病毒屬病毒分為侵染茄科植物、侵染葫蘆科與豆科植物、侵染十字花科植物等3類。辣椒TMV根據(jù)其與抗病基因L的互作被分為5個(gè)致病型：P0、P1、P1，2、P1，2，3、P1，2，3，4，PO致病型觸發(fā)L1、L2、L3、L4抗性，P1觸發(fā)L2、L3、L4的抗性，P1，2觸發(fā)L3、L4的抗性，P1，2，3觸發(fā)L4的抗性，P1，2，3，4侵染L4抗性植株（Boukema，1982；Genda et al.，2007）。番茄花葉病毒（ToMV）屬于煙草花葉病毒的P0致病型，辣椒輕斑駁病毒（PMMoV）已經(jīng)先后發(fā)現(xiàn)P1，2、P1，2，3、P1，2，3，43種致病型（Meshi et al.，1986；Genda et al.，2007；Hamada et al.，2007）。實(shí)際生產(chǎn)過程中，TMV經(jīng)常會與其他同屬病毒共同感染植物，有效區(qū)分病原物對于病害的防治和抗病育種有重要意義，Kumar等（2011）建立了多重反轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)，可以分別鑒定出TMV和ToMV。

2 辣椒對TMV的抗性機(jī)制

2.1 辣椒抗TMV基因——L基因

2.1.1 辣椒L基因的挖掘 辣椒TMV抗性主要由L基因控制，L也是辣椒對煙草花葉病毒屬最有效的抗病基因之一（Holmes，1937）。Holmes（1937）提出L基因及其等位基因Li和L+控制辣椒TMV抗性，它們之間表現(xiàn)為不完全顯性，且L＞Li＞L+。20世紀(jì)80年代，Boukema（1980，1982）發(fā)現(xiàn)了L的其他等位基因，并進(jìn)一步將L基因座上不同的等位基因表示為L1、L2、L3、L4，抗性表現(xiàn)為L4＞L3＞L2＞L1，但是L1～L4是溫敏型基因，在高溫下會失去抗性，這影響了L基因在辣椒抗病育種中的應(yīng)用。Sawada等（2004）發(fā)現(xiàn)了非溫敏型的辣椒抗TMV-P0基因L1a，盡管L1a的非溫敏性僅表現(xiàn)在對TMV-P0的抗性中，但是一定程度上克服了L基因?qū)Ω邷孛舾卸斐傻膽?yīng)用的局限性。L基因定位于辣椒11號染色體，與TG36分子標(biāo)記連鎖（Lefebvre et al.，1995，2002）。Sugita等（2004）利用群體分離分析法（bulked segregant analysis，BSA）以辣椒雙單倍體為作圖群體開發(fā)了2個(gè)與L3連鎖的RAPD（random amplified polymorphic DNA）分子標(biāo)記，并將其轉(zhuǎn)化為穩(wěn)定性更好的與L3相距4 cM的SCAR（sequence-characterized amplified region）標(biāo)記。Sugita等（2005）又開發(fā)了與L3連鎖的3個(gè)AFLP（amplified fragment-length polymorphism）標(biāo)記和1個(gè)RAPD標(biāo)記。Matsunaga等（2003）和Kim等（2008）分別開發(fā)了與L4基因連鎖的 RAPD（1.5 cM）和AFLP（0.9 cM）標(biāo)記并轉(zhuǎn)化為SCAR標(biāo)記。Tomita等（2008）利用辣椒BAC（bacterial artificial chromosome）將L3基因定位在染色體400 kb范圍內(nèi)。Yang等（2009）將L在染色體上的位置縮小在224 kb范圍內(nèi)并開發(fā)了與L4分別相距1.2 cM和0.8 cM的SNP（single nucleotide polymorphism）。利用與L緊密連鎖的分子標(biāo)記可以快速篩選鑒定含有L基因的辣椒種質(zhì)并應(yīng)用于育種當(dāng)中，也成為L基因成功克隆的基礎(chǔ)。Tomita等（2011）首次通過圖位克隆獲得L3基因，并利用同源克隆的方法獲得了L的其他6個(gè)等位基因：L1、L1a、L1c、L2、L2b、L4，并揭示了不同基因同TMV-CP的相互作用機(jī)理。

2.1.2 辣椒L基因與TMV相互作用 L基因與TMV互作符合植物抗病基因與病原物互作的基因?qū)蚰Ｊ?，病毒CP蛋白是誘導(dǎo)L基因表達(dá)的效應(yīng)子，CP單獨(dú)或是與其他蛋白構(gòu)成復(fù)合體觸發(fā)L基因的表達(dá)（Berzal et al.，1995；Gilardi et al.，2004；Matsumoto et al.，2008；Tomita et al.，2011）。P1型和P1，2，3型病毒的CP分別可以引起L2/L2和L4/L4基因型辣椒材料的HR（hypersensitive response，HR）反應(yīng)，但P1，2型病毒的CP蛋白卻不能觸發(fā)L2/L2的HR反應(yīng)，說明TMV的CP與L基因相互作用（Gilardi et al.，2004）。Matsumoto等（2008）也證實(shí)與L1a相互作用的效應(yīng)子是P0病毒CP蛋白。序列分析表明，煙草花葉病毒屬病毒CP氨基酸序列同源性＜60%，但是同一種病毒不同致病型的CP氨基酸序列只是1～2個(gè)氨基酸的區(qū)別，P1，2，3，4致病型PMMoV在外殼蛋白上與P1，2致病型僅有2個(gè)氨基酸的差別，這種差別影響病毒與L基因的互作（Genda et al.，2007）。L基因含有NBS-LRR （nucleotide-binding site-leucine-rich repeat，NBSLRR）結(jié)構(gòu)域，屬于CC-NBS-LRR型植物抗病基因，每個(gè)L基因等位基因編碼不同的蛋白質(zhì)，它們有不同的TMV-CP識別區(qū)域與不同TMV致病型相互作用。LRR結(jié)構(gòu)域尤其是N-端LRR區(qū)域是L基因與CP相互作用的關(guān)鍵區(qū)域，同時(shí)，L蛋白的第1 127個(gè)氨基酸殘基對L基因與TMV-CP互作有重要意義（Tomita et al.，2011）。一個(gè)PMMoV弱致病型的分離物L(fēng)3-163可以與L3基因互作，提高辣椒對其他致病型TMV的抗性，田間接種L3-163，可以減少辣椒TMV發(fā)病率，提高辣椒產(chǎn)量（Rie et al.，2013）。明確L基因與病毒CP間的互作模式為研究辣椒L基因的進(jìn)化及辣椒抗TMV育種提供理論基礎(chǔ)。

2.2 辣椒抗TMV相關(guān)基因

辣椒L基因與TMV-CP相互作用觸發(fā)辣椒抗TMV的HR反應(yīng)，其后多種基因共同作用使辣椒獲得對TMV的系統(tǒng)獲得性抗性（systemic acquired resistance，SAR），其中植物病程相關(guān)蛋白（pathogenesis-related protein，PR）起重要作用。病程相關(guān)蛋白在植物抗病過程中有以下幾種作用：抑制病原物的生長復(fù)制，如：β-1，3葡聚糖酶、蛋白酶抑制劑、幾丁質(zhì)酶Ⅲ、核糖核酸酶等；加強(qiáng)植物自身對病原物的抵御能力，如：細(xì)胞結(jié)構(gòu)蛋白、過氧化物酶等；編碼植物抗毒素，包括防衛(wèi)素、硫素、脂轉(zhuǎn)移蛋白等，目前發(fā)現(xiàn)了抑制病毒復(fù)制和加固細(xì)胞壁的辣椒抗TMV的PR基因。CaPR-10具有核糖核酸酶活性，它通過降解病毒RNA抑制病毒復(fù)制，在辣椒抗TMV材料中特異表達(dá)（Park et al.，2004a）。CaPinⅡ編碼的辣椒蛋白酶抑制劑則是通過抑制TMV中蛋白質(zhì)的合成，從而抑制病毒合成（Shin et al.，2001）。CaGLP1編碼小麥萌發(fā)素類似蛋白，是首次發(fā)現(xiàn)小麥萌發(fā)素類似蛋白在辣椒抗病毒病中起作用，它通過加固辣椒細(xì)胞壁來抵御TMV對辣椒的侵害（Park et al.，2004b）。CaLTP1，辣椒脂轉(zhuǎn)移蛋白相關(guān)基因，編碼PR-14類病程相關(guān)蛋白，在辣椒抗TMV反應(yīng)中特異表達(dá)，但是具體作用機(jī)制還不清楚（Park et al.，2002）。目前發(fā)現(xiàn)的參與辣椒抗TMV反應(yīng)的病程相關(guān)蛋白不多，挖掘參與辣椒TMV的PR基因有利于明確辣椒與TMV的互作機(jī)制。

2.3 辣椒抗TMV相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子

植物抗病性是一系列防衛(wèi)反應(yīng)基因協(xié)同表達(dá)的結(jié)果，轉(zhuǎn)錄調(diào)控是植物防衛(wèi)反應(yīng)基因表達(dá)調(diào)控的主要方式，其中轉(zhuǎn)錄因子起重要作用。植物中參與抗病反應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子有：bZIP家族中的TGA/ OBF型轉(zhuǎn)錄因子、AP2/EREBP家族的ERF型轉(zhuǎn)錄因子、WRKY家族轉(zhuǎn)錄因子、MYB家族R2R3型轉(zhuǎn)錄因子及HSF轉(zhuǎn)錄因子，目前發(fā)現(xiàn)WRKY型轉(zhuǎn)錄因子參與辣椒抗TMV反應(yīng)。WRKY蛋白是一類鋅指結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)錄因子，N-端含有高度保守的WRKYGQK氨基酸序列，專一結(jié)合W-box序列，與植物在面對生物或非生物脅迫時(shí)的應(yīng)激反應(yīng)密切相關(guān)。CaWRKYb在辣椒抗TMV信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中與CaPR-10基因的啟動子結(jié)合，對辣椒抗TMV反應(yīng)起正向調(diào)節(jié)作用（Lim et al.，2011）。CaWRKYa則通過參與水楊酸（SA）、乙烯（ET）信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，增強(qiáng)辣椒對TMV的抗性（Park et al.，2006；Huh et al.，2015）。Huh等（2012a）克隆到1個(gè)新的辣椒WRKY類轉(zhuǎn)錄因子——CaWRKYd，屬于WRKYIIa 類蛋白，是WRKY亞家族中的一個(gè)小類，在TMV侵染辣椒引起的辣椒抗TMV反應(yīng)中表達(dá)量提高，也在植物抗病相關(guān)激素SA、茉莉酸甲酯（MeJA）、ET誘導(dǎo)下表達(dá)，可能參與SA、茉莉酸（JA）、ET介導(dǎo)的植物抗病信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中。CaBtf3（basic transcription factor 3），也被發(fā)現(xiàn)參與辣椒抗TMV反應(yīng)，它編碼b-新生肽鏈關(guān)聯(lián)復(fù)合體（NAC）的亞結(jié)構(gòu)，NAC可以保護(hù)新合成的肽鏈不被降解，CaBtf3在辣椒抗TMV反應(yīng)中介導(dǎo)細(xì)胞程序性死亡（Huh et al.，2012b）。植物轉(zhuǎn)錄因子通過與基因啟動子區(qū)域的順式作用元件結(jié)合，調(diào)節(jié)基因在特定的時(shí)間、空間表達(dá)。當(dāng)TMV侵染辣椒觸發(fā)其防御反應(yīng)，植物中多種防御基因及代謝相關(guān)基因在轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)作用下表達(dá)，1個(gè)轉(zhuǎn)錄因子可以調(diào)控下游多個(gè)與同類性狀有關(guān)基因的表達(dá)，因此挖掘辣椒抗TMV相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子，通過增強(qiáng)1個(gè)關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控能力來提高辣椒抗病性將非常有效。

2.4 參與辣椒TMV防御反應(yīng)的代謝相關(guān)基因

除了PR蛋白和轉(zhuǎn)錄因子，編碼糖代謝、蛋白質(zhì)代謝、脂肪酸合成等途徑中的關(guān)鍵酶基因被發(fā)現(xiàn)在辣椒抗TMV防御反應(yīng)中起作用。丙酮酸激酶（PK）催化磷酸烯醇式丙酮酸和ADP變?yōu)锳TP和丙酮酸，是糖酵解過程中的主要限速酶之一，Kim （2006）獲得1個(gè)編碼辣椒胞質(zhì)丙酮酸激酶基因CaPKc1，主要參與乙烯和水楊酸誘導(dǎo)的植物抗病信號途徑，在辣椒抗TMV的HR反應(yīng)中表達(dá)。SA是參與植物抗病反應(yīng)的重要信號分子，植物抗病過程中SA會大量與葡萄糖共軛形成SAG（SA-葡萄糖苷）。UDP-葡萄糖苷轉(zhuǎn)移酶則是該過程中1個(gè)重要的酶，Lee等（2009）分離到1個(gè)CaUGTs基因，通過調(diào)節(jié)SA的積累調(diào)節(jié)辣椒對TMV的抗性。植物中丙氨酸轉(zhuǎn)移酶可以催化丙氨酸和丙酮酸間的轉(zhuǎn)氨作用，CaAlaAT1編碼辣椒丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶，通過為辣椒在抵御病毒侵害時(shí)提供能量參與辣椒抗TMV的防御反應(yīng)（Kim et al.，2005）。CaRPN7是26 S蛋白酶調(diào)節(jié)因子，通過與蛋白酶結(jié)合調(diào)節(jié)蛋白酶活性參與辣椒抗TMV HR反應(yīng)中的細(xì)胞程序性死亡（Lee et al.，2006）。CaTin1和CaTin2編碼與細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)相關(guān)蛋白，在辣椒抗TMV的反應(yīng)和ET的誘導(dǎo)下表達(dá)，參與ET調(diào)控的植物抗逆反應(yīng)（Shin et al.，2003，2004）。通常由R基因介導(dǎo)的抗性中植物脂肪酸的含量會發(fā)生變化，辣椒脂肪酸去飽和酶CaFAD1在辣椒抗TMV反應(yīng)中表達(dá)量提高，沉默CaFAD1可以降低辣椒TMV抗性（Kim et al.，2007）。脂氧合酶（LOX）催化不飽和脂肪酸的加氧反應(yīng)，在植物的生長發(fā)育及脅迫反應(yīng)中起重要作用，在辣椒與煙草花葉病毒的非親和互作中，CaLOX1/2/3表達(dá)量明顯提高，參與辣椒抗病途徑（Madhusudhan et al.，2009；Gábor et al.，2010）。除了以上增強(qiáng)辣椒TMV抗性的基因外，煙草花葉病毒屬病毒增殖蛋白1（TOM1）和蛋白3（TOM3）對辣椒TMV抗性起負(fù)調(diào)控作用，它定位于細(xì)胞液泡膜上，與TMV病毒復(fù)制酶相互作用形成病毒復(fù)制復(fù)合體在TMV感染初期協(xié)助病毒復(fù)制（Hagiwara et al.，2003）。Kumar等（2012）通過RNA干擾在煙草中沉默辣椒的TOM1和TOM3基因，使煙草獲得TMV抗性，因此也可以通過沉默辣椒中TOM1 和TOM3基因，提高辣椒TMV抗性。植物抗病信號途徑中的各類抗病基因及不同信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑之間形成復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，盡管分離鑒定出一些參與辣椒TMV防御反應(yīng)中的基因，但是這些基因之間的相互作用還不明確?？寺∨c抗病調(diào)節(jié)有關(guān)的基因，并研究其功能及各基因間的相互作用對于明確辣椒抗TMV信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，提高辣椒抗病性有重要作用。

3 展望

國外研究普遍認(rèn)為辣椒抗TMV是由復(fù)等位基因控制的，抗病對感病表現(xiàn)完全顯性到部分顯性，但是國內(nèi)對辣椒抗TMV的遺傳規(guī)律及抗病基因與病毒互作機(jī)制的研究較少。辣椒在受到TMV侵染后，抗病基因L與病毒CP蛋白相互作用引起辣椒HR反應(yīng)，進(jìn)而引發(fā)病程相關(guān)基因表達(dá)，觸發(fā)辣椒的SAR。多個(gè)基因共同作用使辣椒具有TMV抗性，但是TMV侵染辣椒過程中的物質(zhì)代謝和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑還不明確，亟待進(jìn)一步研究。通過多種途徑的深入研究，揭示辣椒抗TMV機(jī)制，明確抗病相關(guān)基因誘導(dǎo)表達(dá)的觸發(fā)方式及在抗病反應(yīng)中的生理生化過程對辣椒抗TMV育種有重要意義。經(jīng)過與番茄、馬鈴薯的比較作圖分析，發(fā)現(xiàn)L基因在辣椒染色體上所處的位置與番茄抗病基因I2和馬鈴薯抗病基因R3在各自染色體上的位置同源，且在該位置上有許多R基因相關(guān)的QTL（Grube et al.，2000；Yoo et al.，2003）。番茄全基因組測序完成及生物信息學(xué)的發(fā)展，為克隆新的辣椒抗病相關(guān)基因提供了有利條件。隨著植株基因高通量測序技術(shù)的快速發(fā)展，比較抗感材料在轉(zhuǎn)錄水平上的基因表達(dá)差異，獲得差異表達(dá)基因，利用生物信息學(xué)手段分析差異表達(dá)基因，并預(yù)測其功能，再結(jié)合基因工程技術(shù)驗(yàn)證基因功能，可以更有效獲得辣椒抗TMV相關(guān)基因。隨著植物抗性的提高，病毒分離物也在變異與進(jìn)化，在研究辣椒與病毒互作機(jī)制的同時(shí)，利用分子標(biāo)記輔助育種技術(shù)，篩選辣椒抗TMV抗原材料應(yīng)用于育種中，可以解決實(shí)際生產(chǎn)問題。

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Research Progress on Genes Resistant to Tobaco mosaic virus in Pepper（Capsicum spp.）

QIN Lei，LIANG Yan*
（College of Horticulture，Northwest A&F University，Yangling 712100，Shaanxi，China）

Abstract：Tobacco mosaic virus（TMV）can infect many crops such as pepper and tomato. Studies have found that TMV resistance was mainly controlled by L gene in Capsicum plants，and the CP of TMV was the factor required for the induction of host resistant response mediated by L gene. This paper summarized the research progresses achieved recently about pepper resistance to TMV，and on the function of this resistance gene.

Key words：Hot pepper；TMV；Disease resistant gene；Review

*通訊作者（

Corresponding author）：梁燕，教授，博士生導(dǎo)師，專業(yè)方向：番茄遺傳育種及蔬菜種質(zhì)資源研究，E-mail：liangyan@nwsuaf.edu.cn

收稿日期：2015-12-01；接受日期：2016-02-25

基金項(xiàng)目：“十二五”國家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（2013BAD01B04-14）