侯 凈，任智晶，魏 娜，倪 青，郭小毛

1.貴州省人民醫(yī)院乳腺外科，貴州 貴陽 550002；

2.復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院放療科，復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院腫瘤學(xué)系，上海 200032；

3.貴州省人民醫(yī)院檢驗科，貴州 貴陽 550002

HER-2通過ZEB1促進乳腺癌細胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化

侯 凈1,2，任智晶3，魏 娜1，倪 青1，郭小毛2

1.貴州省人民醫(yī)院乳腺外科，貴州 貴陽 550002；

2.復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院放療科，復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院腫瘤學(xué)系，上海 200032；

3.貴州省人民醫(yī)院檢驗科，貴州 貴陽 550002

背景與目的：人類表皮生長因子受體2(human epidermal growth factor receptor-2，HER-2)是表皮生長因子受體家族中的一員，它參與細胞多個生物過程，如細胞增殖、侵襲和凋亡等。有研究表明，HER-2與細胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)過程相關(guān)，但具體機制有待進一步探討，本研究旨在探討HER-2對EMT的調(diào)節(jié)機制。方法：用Transwell小室模擬細胞的遷徙侵襲能力；采用實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction，RTFQ-PCR)檢測目的基因的表達；用活性氧檢測試劑盒檢測細胞活性氧的水平。結(jié)果：Transwell小室模擬實驗發(fā)現(xiàn)，HER-2過表達能促進乳腺癌細胞的侵襲轉(zhuǎn)移；機制研究表明，HER-2能上調(diào)ZEB1，用siRNA降低ZEB1表達使HER-2過表達細胞的侵襲能力受損；此外，HER-2過表達乳腺癌細胞中活性氧水平較低。結(jié)論：HER-2可以上調(diào)ZEB1的表達而賦予乳腺癌細胞EMT相關(guān)特性，ZEB1可作為進一步研究HER-2與EMT調(diào)節(jié)關(guān)系的靶點。

乳腺癌；人類表皮生長因子受體2；ZEB1；細胞侵襲；上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化

［Key words］Breast cancer; Human epidermal growth factor receptor-2; ZEB1; Cell invasion; Epithelial-mesenchymal transition

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤，世界范圍內(nèi)其發(fā)病率居第1位，死亡率居第2位［1］，嚴重影響女性健康。近年來，隨著乳腺癌的綜合治療手段發(fā)展，乳腺癌患者的預(yù)后得到極大改善，但腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移問題仍是乳腺癌治療中面臨的重要問題［2］，是影響乳腺癌治療效果的重要因素，因此，研究乳腺癌侵襲轉(zhuǎn)移的機制有重要的臨床意義。根據(jù)雌激素受體(estrogen receptor，ER)、孕激素受體(progesterone receptor，PR)和人類表皮生長因子受體2(human epidermal growth factor receptor-2，HER-2)的表達不同，乳腺癌可主要分為三種不同的亞型［ER+和(或)PR+型、HER-2陽性型及三陰型］。有研究表明，三種亞型的乳腺癌治療手段有所不同，預(yù)后也有差別［3］，其中，HER-2過表達型局部復(fù)發(fā)危險性明顯高于ER+和(或) PR+型(luminal型)，雖然HER-2基因的靶向治療藥物赫賽汀可以顯著改善HER-2過表達型乳腺癌的預(yù)后，但耐藥及腫瘤轉(zhuǎn)移問題也普遍存在［4］。有研究表明，HER-2過表達乳腺癌與其他類型的乳腺癌相比，腦轉(zhuǎn)移的概率較高［5-6］，說明HER-2過表達與乳腺癌的轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，探討HER-2對乳腺癌細胞的侵襲轉(zhuǎn)移機制有助于了解其引起腦轉(zhuǎn)移的原因，并為解決乳腺癌轉(zhuǎn)移問題提供一定思路。

上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)是近年來腫瘤研究的熱點，是指上皮細胞通過特定程序轉(zhuǎn)化為具有間質(zhì)表型細胞的生物學(xué)過程［7］。EMT參與腫瘤細胞侵襲轉(zhuǎn)移過程調(diào)節(jié)，此外，EMT與癌細胞的放化療耐受及腫瘤干細胞特性等密切相關(guān)［8］。已有研究表明，HER-2與EMT過程密切相關(guān)［9］，但HER-2與影響EMT過程中的特定基因如ZEB1、Snail、Slug和Twist等的具體關(guān)系目前研究還較少，本研究通過Transwell小室模擬細胞的運動能力，為揭示HER-2與EMT關(guān)系及其對乳腺癌侵襲轉(zhuǎn)移的機制提供進一步依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 細胞培養(yǎng)

MCF-7、MDA-MB-231、SK-BR-3和293T培養(yǎng)在DMEM培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基含有l(wèi)0%的胎牛血清、1 mmol/L非必需氨基酸、2 mmol/L L-谷氨酰胺，100 U/mL的青霉素和100 mg/mL的鏈霉素，在37 ℃、CO2體積分數(shù)為5%的飽和濕度的環(huán)境中培養(yǎng)。

1.2HER-2過表達及敲低細胞系的構(gòu)建

首先構(gòu)建HER-2過表達質(zhì)粒，其慢病毒載體為pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro，用TRIzol裂解法從SK-BR-3細胞中提取總RNA，通過反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，然后通過實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction，RTFQ-PCR)擴增HER-2基因，HER-2的PCR上游引物序列：5’-AATTGCTAG CGCCACCATGGAGCTGGCGGCCTTGT-3’，下游引物序列：5’-ATAAGAATGCGGCCGCTC ACACTGGCACGTCCAGAC-3’。NheⅠ限制性內(nèi)切酶位點：GCTAGC；NotⅠ限制性內(nèi)切酶位點：GCGGCCGC；Kozak序列：GCCACC。

用NheⅠ、NotⅠ雙酶切系統(tǒng)處理HER-2擴增片段及載體，再利用T4 DNA連接酶連接，最后通過大腸桿菌轉(zhuǎn)化、篩選、DNA抽提、酶切驗證及DNA測序驗證完成HER-2過表達質(zhì)粒的構(gòu)建。HER-2干擾質(zhì)粒shRNA的構(gòu)建過程基本同過表達質(zhì)粒構(gòu)建，靶向HER-2的shRNA序列參考TRCN0000039878：正向5’-CCGGTGTCAG TATCCAGGCTTTGTACTCGAGTACAAAGCCT GGATACTGACATTTTTG-3’；反向5’-AATTCA AAAATGTCAGTATCCAGGCTTTGTACTCGA GTACAAAGCCTGGATACTGACA-3’。shRNA片段由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。具體的構(gòu)建步驟參考pLKO.1 puro質(zhì)粒使用操作手冊(http://www.addgene.org/tools/protocols/plko/)。將構(gòu)建好的質(zhì)粒通過慢病毒包裝系統(tǒng)制備慢病毒液，再利用病毒液感染靶細胞，通過嘌呤霉素(1～5 μg/mL)篩選陽性細胞，最終得到HER-2過表達的乳腺癌細胞。

1.3 Transwell實驗

用Transwell小室模擬體外細胞遷移(侵襲)實驗，遷移實驗和侵襲實驗步驟基本相同，不同的是侵襲實驗需要在Transwell小室底部鋪基質(zhì)膠，以基質(zhì)膠侵襲實驗為例簡述其方法步驟：鋪膠前將所用的槍頭、24孔板和EP管預(yù)冷；將基質(zhì)膠取出，無菌條件下在冰上融化，將Transwell小室置于24孔板中；將基質(zhì)膠與無血清培養(yǎng)基以1∶3～1∶5的比例混勻，然后取60 μL混合液鋪于Transwell小室，37 ℃放置1 h使膠凝固；細胞準備，常規(guī)消化細胞，PBS洗滌1次，然后用無血清的培養(yǎng)基重懸，計數(shù)，將細胞數(shù)目調(diào)節(jié)至(2～5)×105個/mL(不同細胞接種數(shù)目需要預(yù)實驗確定)；取200 μL細胞懸液加入Transwell小室，在小室下(24孔板中)加入500 μL含2%～10%FBS的培養(yǎng)基；在37 ℃下培養(yǎng)24 h(不同細胞培養(yǎng)時間不同)；取出小室，用4%多聚甲醛固定30 min，然后用結(jié)晶紫進行染色；用棉棒擦去小室上面未穿膜的細胞及基質(zhì)膠；在倒置顯微鏡下直接觀察計數(shù)穿過的細胞，觀察計數(shù)時中央和周圍各隨機取3個視野，然后計算每個視野的平均數(shù)；分析數(shù)據(jù)。

1.4 活性氧檢測

利用上海碧云天生物技術(shù)有限公司的活性氧檢測試劑盒檢測細胞中的活性氧水平，實驗步驟參考試劑盒說明書：按照1∶1 000用無血清培養(yǎng)液稀釋DCFH-DA，使終濃度為10 μmol/L。細胞收集后懸浮于稀釋好的DCFH-DA中，細胞濃度為(1～20)×106/mL，在37 ℃下溫育20 min。每隔3～5 min顛倒混勻一下，使探針和細胞充分接觸。用無血清細胞培養(yǎng)液洗滌細胞3次，以充分去除未進入細胞內(nèi)的DCFH-DA，流式細胞儀分析活性氧水平。

1.5 RTFQ-PCR

用TRIzol裂解法提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄體系為Takara-PrimeScriptTM RT reagent Kit；RTFQPCR反應(yīng)體系為LightCycler 480 SYBR Green I Master(購自瑞士Roche公司) ；數(shù)據(jù)分析采用2-ΔΔCt法，所有實驗重復(fù)3次，每次設(shè)置3個平行孔，用GAPDH作為內(nèi)參，數(shù)據(jù)分析用柱狀圖表示，部分基因的RTFQ-PCR引物序列見表1。

表 1 相關(guān)基因的RTFQ-PCR引物序列Tab. 1 RTFQ-PCR primer sequences of related genes

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理

應(yīng)用Graphpad prism 6軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 HER-2促進乳腺癌細胞的侵襲轉(zhuǎn)移

本研究選擇HER-2低表達或不表達的乳腺癌細胞系MCF-7和MDA-MB-231(231)構(gòu)建HER-2過表達細胞系；選擇HER-2高表達的乳腺癌細胞系ZR-7530(7530)和SK-BR-3構(gòu)建HER-2沉默細胞系。用RTFQ-PCR和蛋白［質(zhì)］印跡法(Western blot)驗證細胞構(gòu)建成功后，直接采用Transwell小室檢測細胞的運動能力，發(fā)現(xiàn)HER-2過表達后的MCF-7 PCDH HER-2細胞、231 PCDH HER-2細胞與對照細胞相比，遷移能力與侵襲能力都增強；而HER-2沉默后的7530 PLKO HER-2i、SK-BR-3 PLKO HER-2i細胞與對照細胞相比，遷移能力與侵襲能力都減弱(圖1、2)。證明HER-2能調(diào)節(jié)乳腺癌細胞的遷移侵襲能力。

圖 1 HER-2促進乳腺癌細胞遷移Fig. 1 HER-2 promotes breast cancer cell migration

圖 2 HER-2調(diào)節(jié)乳腺癌細胞的侵襲能力Fig. 2 HER-2 promotes breast cancer cell invasion

2.2 HER-2調(diào)節(jié)EMT相關(guān)基因的表達

為了解HER-2調(diào)節(jié)細胞侵襲的機制，我們用RTFQ-PCR檢測了HER-2表達干預(yù)后乳腺癌細胞系中EMT相關(guān)基因的mRNA表達情況。結(jié)果表明，當HER-2沉默后，7530 PLKO HER-2i細胞中EMT相關(guān)的基因如Snail、Slug、ZEB1、ZEB2、N-cadherin(N-cad)、Fibronectin(FN)和Vimentin等的mRNA表達量跟對照細胞7530 PLKO NC相比都有不同程度的下調(diào)；而HER-2過表達后的231 PCDH HER-2和MCF-7 PCDH HER-2細胞與對照細胞相比，上述基因中大部分的mRNA表達也有不同程度的上調(diào)(圖3)。說明HER-2通過調(diào)節(jié)部分EMT相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄而參與EMT過程的調(diào)節(jié)。

2.3 HER-2通過ZEB1調(diào)節(jié)乳腺癌細胞侵襲轉(zhuǎn)移

為進一步探索HER-2調(diào)節(jié)乳腺癌細胞侵襲的機制，選取上述EMT相關(guān)基因中變化較明顯的ZEB1作進一步研究，用靶向ZEB1的兩個siRNA處理231 PCDH HER-2細胞，兩個靶向ZEB1的siRNA能有效降低ZEB1的轉(zhuǎn)錄水平(圖4A)。然后檢測ZEB1干擾后細胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力變化，發(fā)現(xiàn)當231 PCDH HER-2細胞中的ZEB1表達下調(diào)后，細胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力減弱，基本恢復(fù)到基線水平，說明ZEB1可以介導(dǎo)HER-2對細胞運動能力的調(diào)節(jié)(圖4B、C)。

圖 3 HER-2調(diào)節(jié)EMT相關(guān)基因的表達Fig. 3 HER-2 regulates the expression of EMT related genes

2.4 HER-2調(diào)節(jié)乳腺癌細胞中活性氧水平

EMT與細胞的代謝過程密切相關(guān)，為進一步證實HER-2通過調(diào)節(jié)ZEB1參與EMT過程，我們檢測了HER-2干預(yù)后的乳腺癌細胞中活性氧的水平，發(fā)現(xiàn)HER-2過表達后，MCF-7 PCDH HER-2細胞中的活性氧水平較對照細胞水平低，而HER-2沉默后的SK-BR-3細胞較對照細胞中的活性氧水平高(圖5)。說明HER-2過表達能調(diào)節(jié)乳腺癌細胞的代謝水平，表現(xiàn)出EMT特性，可降低活性氧水平，避免細胞受活性氧的傷害。

圖 4 HER-2通過ZEB1調(diào)節(jié)乳腺癌細胞侵襲轉(zhuǎn)移Fig. 4 HER-2 regulates breast cancer cell migration and invasion through ZEB1

圖 5 HER-2調(diào)節(jié)乳腺癌細胞中活性氧水平Fig. 5 HER-2 regulates reactive oxygen species production in breast cancer cells

3 討 論

約25%～30%的乳腺癌病例伴有HER-2基因的擴增，在低惡度的乳腺導(dǎo)管原位癌中HER-2基因擴增比例更高，可達50%～70%，說明HER-2在乳腺癌發(fā)生、發(fā)展過程中有重要的作用［10-11］。有研究發(fā)現(xiàn)，HER-2可參與細胞增殖、凋亡、周期及侵襲轉(zhuǎn)移等過程的調(diào)節(jié)，其機制主要涉及Ras/MAPK通路和PI3K/AKT通路［12］。近年來，隨著研究的深入，HER-2調(diào)節(jié)細胞侵襲轉(zhuǎn)移的機制不斷得到拓展，有研究發(fā)現(xiàn)，HER-2與EMT有密切關(guān)系［9］，為解釋HER-2與細胞侵襲轉(zhuǎn)移和細胞耐藥等機制提供了更多的理論基礎(chǔ)，但HER-2與EMT相關(guān)基因的具體關(guān)系還有待更多的研究探索。EMT的發(fā)生與細胞上皮標志物E-鈣黏蛋白(E-cadherin)的缺失或表達減弱，而獲得間皮標志物如N-鈣黏蛋白(N-cadherin)、波形蛋白(vimentin)和纖連蛋白(fibronectin)等相關(guān)［13］。ZEB1是一種鋅指蛋白，可以作為轉(zhuǎn)錄因子識別E-cadherin蛋白啟動子區(qū)的E盒，下調(diào)E-cadherin的表達，同時導(dǎo)致vimentin和fibronectin等的表達上調(diào)而誘導(dǎo)EMT的發(fā)生［14］；同時，ZEB1可以抑制miR-200家族，招募SWI和(或)SNF染色質(zhì)重構(gòu)蛋白BRG1加速EMT過程［15-16］。近年來的研究還發(fā)現(xiàn)，ZEB1與細胞頂-底極性的喪失有關(guān)，而該過程與EMT密切相關(guān)［17］。本研究在細胞水平上驗證了HER-2過表達能促進乳腺癌細胞侵襲轉(zhuǎn)移，同時能上調(diào)EMT相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平。我們進一步選擇變化較為明顯的基因ZEB1進行后續(xù)研究，通過siRNA干擾證實ZEB1在HER-2過表達對乳腺癌細胞的侵襲轉(zhuǎn)移調(diào)節(jié)過程中有重要作用，該結(jié)果也表明HER-2能通過調(diào)節(jié)ZEB1的表達而賦予HER-2過表達細胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化的能力，使HER-2過表達細胞具有更強的侵襲轉(zhuǎn)移能力，同時能減少細胞中活性氧的產(chǎn)生使細胞具有更強的存活能力，本研究結(jié)果為進一步了解HER-2與乳腺癌細胞侵襲轉(zhuǎn)移和EMT之間的調(diào)節(jié)機制提供了一定的理論基礎(chǔ)，但HER-2與ZEB1的具體調(diào)節(jié)機制有待進一步研究。

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HER-2 promotes breast cancer cell epithelial-mesenchymal transition by regulating ZEB1

HOU Jing1,2, REN Zhijing3, WEI Na1, NI Qing1, GUO Xiaomao2(1. Department of Breast Surgery, Guizhou Provincial People’s Hospital, Guiyang 550002, Guizhou Province, China; 2. Department of Radiation Oncology, Fudan University Shanghai Cancer Center, Department of Oncology, Shanghai Medical College, Fudan University, Shanghai 200032, China; 3. Department of Laboratory, Guizhou Provincial People’s Hospital, Guiyang 550002, Guizhou Province, China)

Background and purpose:Human epidermal growth factor receptor-2 (HER-2), a member of epidermal growth factor receptor family, initiates a diverse set of signaling pathways that ultimately affect such fundamental processes as cell proliferation, cell motility and cell apoptosis. It is reported that HER-2 was associated with epithelial-mesenchymal transition (EMT) process. However, the mechanism needs further investigation. The purpose of this study was to investigate the mechanism of HER-2 on regulating EMT process.Methods:Transwell assay was used to determine the motility of breast cancer cells; Real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction (RTFQ-PCR) was employed to determine the expression of genes of interest, and reactive oxygen species production was measured by reactive oxygen species detection kit.Results:HER-2 overexpression in breast cancer cells could promote cell migration and invasion. Mechanistic study showed that HER-2 overexpression could upregulate ZEB1 expression. ZEB1 silencing by siRNA reduced cell motility of HER-2-overexpressing breast cancer cells. Furthermore, reactive oxygen species produced in HER-2-overexpressing breast cancer cells were less than those produced in corresponding control cells.Conclusion:Our study demonstrated that HER-2 overexpression endowed breast cancer cells with EMT related properties by upregulating ZEB1 expression. ZEB1 could be a candidate target for further study of the relationship between HER-2 and EMT.

10.19401/j.cnki.1007-3639.2016.12.002

R737.9

A

1007-3639(2016)12-0968-06

2016-06-17

2016-09-07）

郭小毛 E-mail: guoxm1800@126.com