周星星徐賢達阮曉琳宣桂琪陳 健

中藥氣陰雙補對緩解期哮喘模型大鼠氣道重塑及ERK信號分子表達的影響

周星星1徐賢達2阮曉琳1宣桂琪3陳 健3

目的研究中藥氣陰雙補對緩解期哮喘模型大鼠氣道重塑及細胞外信號調(diào)節(jié)蛋白激酶（ERK）信號分子表達的影響。方法6周齡健康雄性SD大鼠48只，隨機分為正常組、模型組、中藥低劑量組、中藥中劑量組、中藥高劑量組及地塞米松組，每組8只。用卵清蛋白（OVA）致敏和激發(fā)建立哮喘氣道重塑大鼠模型，肺組織病理圖像分析氣道重塑，RT-PCR檢測ERK、ERK2mRNA在肺組織表達，免疫印跡檢測P-ERK蛋白在氣道平滑肌表達。結(jié)果模型組肺組織切片平滑肌標化面積（WAm/Pbm）為（17.34±0.63）μm2/μm、內(nèi)管壁標化面積（WAi/Pbm）為（42.35±3.31）μm2/μm，顯著高于正常組的（7.63±0.32）μm2/μm和（26.73±1.50）μm2/μm（P＜0.05）；中藥低劑量組WAm/Pbm為（13.68±0.52）μm2/μm，WAi/Pbm為（37.53±2.57）μm2/μm，中劑量組分別為（10.75±0.72）μm2/μm、（33.74±1.21）μm2/μm，高劑量組分別為（9.33±0.92）μm2/μm、（30.62±1.34）μm2/μm，均較模型組顯著降低（P＜0.05），但仍高于正常組（P＜0.05）；模型組ERK1mRNA（4.26±0.52）、ERK2mRNA（3.54± 0.37）、p-ERK（3.288±0.641）表達均顯著高于正常組（1.02±0.11、0.96±0.13、0.703±0.338，P＜0.05）；中藥低劑量組ERK1mRNA（3.23±0.45）、ERK2mRNA（2.72±0.21），中劑量組ERK1mRNA（1.65± 0.26）、ERK2mRNA（1.36±0.14）、p-ERK（2.172±0.221），中藥高劑量組ERK1mRNA（2.37±0.23）、ERK2mRNA（2.03±0.12）、p-ERK（1.127±0.631）均明顯低于模型組（P＜0.05），但仍高于正常組（P＜0.05）。結(jié)論中藥氣陰雙補可改善緩解期哮喘大鼠氣道重塑，抑制ERKl/2mRNA及P-ERKl/2蛋白在氣道中的表達。

大鼠；哮喘；氣道重塑；細胞外信號調(diào)節(jié)蛋白激酶（ERK）；氣陰雙補

支氣管哮喘（bronchial asthma）是一種以慢性氣道炎癥為特征的異質(zhì)性疾病；具有喘息、氣促、胸悶和咳嗽等呼吸道癥狀病史，呼吸道癥狀和強度可隨時間變化，伴有可變的呼氣氣流受限[1]。氣道重塑、慢性炎癥、氣道高反應(yīng)性是哮喘的主要特征，而氣道重塑主要表現(xiàn)為炎癥細胞浸潤和腺體增生肥大，細胞外基質(zhì)沉積、基底膜增厚及氣道平滑肌增厚，同時伴有非特異性的氣道高反應(yīng)性[2]。細胞外信號調(diào)節(jié)蛋白激酶（ERK）信號通路是多種細胞因子和炎癥介質(zhì)調(diào)控氣道平滑肌增殖的關(guān)鍵途徑[3]，在平滑肌中主要有ERK1、ERK2兩種亞型。前期臨床實踐證明中藥氣陰雙補治療緩解期哮喘有較好療效，可顯著減少小兒哮喘發(fā)作頻率，對小兒哮喘的防治具有較好的臨床意義，但具體作用機制尚不清楚。本實驗通過觀察氣陰雙補對緩解期哮喘模型大鼠氣道重塑以及對ERK1、ERK2信號分子表達的影響,探討其治療緩解期哮喘，減少哮喘復(fù)發(fā)的作用機制。

1 實驗材料

1.1 動 物 6周齡SPF級SD大鼠48只，雄性，體質(zhì)量（150±20）g，中科院上海斯萊克實驗動物有限公司，實驗動物合格證號：SCXK（滬）2012-0002；實驗動物飼養(yǎng)于浙江中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗研究中心屏障環(huán)境中，合格證號：SYXK（浙）2008-0116；飼喂普通飼料，自由飲食。

1.2 藥 物 中藥處方：南沙參、北沙參各6g，麥冬、地骨皮各9g，生白芍6g，生石決明10g，黨參6g，白術(shù)9g，茯苓10g，陳皮5g，姜半夏6g（購自浙江中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院）。委托浙江中醫(yī)藥大學(xué)制劑室專業(yè)人員制劑，按低、中、高劑量分別濃縮至每毫升含生藥0.4g、0.8g、1.6g藥液，分裝，置4℃冰箱備用。醋酸地塞米松片（批號1410202）：仙琚制藥股份有限公司。

1.3 試 劑 卵清蛋白（OVA）、氫氧化鋁凝膠（AL （OH）3）：美國Sigma；RNAiso Plus（總RNA提取試劑）、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量試劑盒：大連Takara公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒（增強型）：碧云天生物技術(shù)研究所；10×組織裂解液（9803s-007）、兔抗PERK多克隆抗體（4370s-003）、二抗：美國 CST；ERK1、ERK2mRNA、β-actin引物由上海生工生物工程有限公司合成，見表1。

表1 大鼠相關(guān)基因引物序列

2 實驗方法

2.1 分組、造模、給藥及標本采集 48只SPF級SD大鼠，適應(yīng)性飼養(yǎng)7天后隨機分為正常組、模型組、中藥低劑量組、中藥中劑量組、中藥高劑量組、地塞米松組6組，每組8只。造模方法[4-5]：致敏、激發(fā)處理：（1）致敏階段：除正常組外，各組大鼠在實驗的第1、8天腹腔注射1mL卵清蛋白（OVA）致敏液（含OVA 10mg和AL（OH）3200mg）致敏，每只大鼠前后腿內(nèi)側(cè)共4點，每點注射0.2mL，腹腔注射0.2mL。正常對照組于第1、8天注射等量0.9%生理鹽水代替OVA。（2）激發(fā)階段：第15天開始，用泵霧化器于自制簡易的霧化箱中以一定濃度的OVA生理鹽水溶液霧化激發(fā)大鼠，每次30min，隔天1次，持續(xù)8周。激發(fā)的濃度分別為第1、2周1%，第3、4周1.5%，第5、6周2%,第7、8周2.5%。正常組予以等量生理鹽水霧化吸入。給藥方法：第9周開始，模型組予以生理鹽水代替藥物灌胃，10mL/（kg·d），1天1次，連續(xù)2周；中藥低、中、高劑量組予中藥4g/kg、8g/kg、16g/ kg灌胃，1天1次，連續(xù)2周，地塞米松組以0.5mg/ kg地塞米松灌胃，1天1次，連續(xù)2周。治療結(jié)束后麻醉開胸留取肺組織標本。

2.2 大鼠肺組織顯微鏡下觀察 取大鼠肺組織用磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗后用10%中性甲醛液固定，常規(guī)石蠟包埋、切片、HE染色后顯微鏡下觀察[6]。將肺組織切片在顯微鏡下放大100倍，找到完整的細支氣管橫斷面，采用圖像采集軟件采集圖像，用醫(yī)學(xué)圖像分析軟件測定支氣管基底膜周徑（Pbm）、氣道平滑肌面積（WAm）、內(nèi)管壁面積（WAi）的數(shù)值。將測得的WAm、WAi用Pbm進行標化，得出氣道平滑肌標化面積（WAm/Pbm）、內(nèi)管壁標化面積（WAi/Pbm）。

2.3 RT-PCR檢測肺組織ERK mRNA表達 取部分大鼠肺組織提取總RNA，RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，進行PCR反應(yīng)，具體操作步驟按TAKARA公司產(chǎn)品說明進行。

2.4 Western-blot檢測p-ERK蛋白表達 取部分肺組織提取總蛋白，進行蛋白定量，電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，進行免疫反應(yīng)，掃膜。

3 實驗結(jié)果

3.1 大鼠氣道平滑肌標化面積（WAm/Pbm）和內(nèi)管壁標化面積（WAi/Pbm）變化 與正常組比較，模型組肺組織切片平滑肌標化面積、內(nèi)管壁標化面積明顯增高（P＜0.05）；各治療組與模型組比較，WAm/ Pbm、WAi/Pbm明顯降低（P＜0.05），但仍高于正常組（P＜0.05）；中藥高劑量組WAm/Pbm、WAi/Pbm與地塞米松組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；中藥低劑量、中劑量組明顯高于地塞米松組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表2。

3.2 肺組織ERKmRNA表達 正常組、模型組和各治療組肺組織ERK基因擴增良好，引物特異性好。以正常組表達量作為參照，其余各組ERK mRNA相對表達量都有所升高，與正常組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；與模型組比較，各治療組表達量均明顯下降（P＜0.05）；中藥中劑量組與地塞米松組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表3。

表2 各組大鼠氣道平滑肌標化面積和內(nèi)管壁標化面積比較（μm2/μm±s）

表2 各組大鼠氣道平滑肌標化面積和內(nèi)管壁標化面積比較（μm2/μm±s）

注：與正常組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與地塞米松組比較，△P＜0.05

組別正常組模型組中藥低劑量組中藥中劑量組中藥高劑量組地塞米松組只數(shù)8 8 8 8 8 8平滑肌標化面積（WAm/Pbm）7.63±0.32 17.34±0.63* 13.68±0.52*#△10.75±0.72*#△9.33±0.92*#9.62±0.87*#內(nèi)管壁標化面積（WAi/Pbm）26.73±1.50 42.35±3.31* 37.53±2.57*#△33.74±1.21*#△30.62±1.34*#31.45±1.76*#

表3 各組大鼠肺組織ERK mRNA相對表達量比較（±s）

表3 各組大鼠肺組織ERK mRNA相對表達量比較（±s）

注：與正常組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與地塞米松組比較，△P＜0.05；ERK：細胞外信號調(diào)節(jié)蛋白激酶

組別正常組模型組中藥低劑量組中藥中劑量組中藥高劑量組地塞米松組只數(shù)8 8 8 8 8 8 ERK1 mRNA （2-△△CT）1.02±0.11 4.26±0.52* 3.23±0.45*#△1.65±0.26*#2.37±0.23*#△1.46±0.14*#ERK2 mRNA （2-△△CT）0.96±0.13 3.54±0.37* 2.72±0.21*#△1.36±0.14*#2.03±0.12*#△1.16±0.96*#

3.3 大鼠肺組織p-ERK蛋白表達 與正常組比較，模型組p-ERK蛋白表達明顯增加（P＜0.05）；與模型組比較，中藥中劑量、高劑量組p-ERK蛋白表達明顯降低（P＜0.05），與地塞米松組比較，中藥高劑量組p-ERK蛋白表達明顯降低（P＜0.05），而中藥低劑量、中劑量組無明顯差異（P＞0.05），見表4、圖1。

表4 各組大鼠肺組織p-ERK表達量比較（±s）

表4 各組大鼠肺組織p-ERK表達量比較（±s）

注：與正常組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與地塞米松組比較，△P＜0.05；ERK：細胞外信號調(diào)節(jié)蛋白激酶

4 討 論

支氣管哮喘屬中醫(yī)“哮病”、“喘證”范疇。近年來，運用中醫(yī)藥治療哮喘氣道重塑的研究逐漸增多。研究發(fā)現(xiàn)小青龍湯[7]、射干麻黃湯[8]、定喘湯[9]、丹龍定喘湯[10]、桑蘇飲[11]、柴樸湯[12-13]等都能夠抑制哮喘氣道重塑。但現(xiàn)代醫(yī)家也有伏痰論、痰瘀阻滯論[14]、體質(zhì)因素論[15-16]、肝氣上逆論[17]之別。全國名老中醫(yī)專家宣桂琪教授在治療緩解期哮喘時有獨特的見解[18]，他認為小兒“陽常有余、陰常不足”，小兒哮喘緩解期在臨床上以陰虛為多，氣虛也有，但陽虛較少。小兒肺臟嬌嫩，具有“肝常有余，脾常不足，腎常虛”的生理特點，哮喘反復(fù)發(fā)作患兒，體虛肝旺的體質(zhì)較多。哮喘日久不愈，耗傷肺陰，木旺侮金，使肺氣上逆而喘鳴。陰虛生內(nèi)熱，感邪后易熱化，邪熱留戀，更傷陰血，虛火上灼致咽紅日久不消，痰熱不清，形成小兒哮喘愈后咳嗽難清的現(xiàn)象。所以宣教授常以肺陰虛及氣陰兩虛分型，在治療中佐以平肝之品，目的是調(diào)整臟腑功能，祛除生痰之根本，減輕、控制發(fā)作，以圖根治哮喘頑疾。方中南沙參清肺金止咳，潤燥生津，北沙參、麥冬滋養(yǎng)胃陰為主以生肺陰，有培土生金之意；加以六君子湯益氣健脾燥濕化痰，亦是培土生金之法；地骨皮滋陰清虛熱，白芍配以石決明養(yǎng)肝陰平肝熱，以防木火刑金而肺熱難清。全方益氣健脾燥濕，養(yǎng)陰潤燥止咳，令氣陰兩復(fù)，肺潤津生，則諸證可平，進而達到改善氣道重塑的目的。

圖1 Western blot檢測各組大鼠肺組織磷酸化ERK蛋白表達

本研究通過氣道形態(tài)學(xué)測量結(jié)果顯示，哮喘模型組肺組織切片平滑肌標化面積、內(nèi)管壁標化面積數(shù)值均明顯增高，表示造模成功。中藥各組WAm/ Pbm、WAi/Pbm與模型組比較均顯著減輕，中藥高劑量組與地塞米松組比較無顯著差異，效果相仿。提示氣陰雙補中藥能夠改善氣道重塑。

細胞外信號調(diào)節(jié)蛋白激酶（extracellular signalregulated kinase，ERK）通道是一種細胞內(nèi)重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通道，能夠參與多種細胞異常增殖與分化的信號調(diào)控，聯(lián)系著細胞外信號與細胞核反應(yīng)間的信息轉(zhuǎn)導(dǎo)。ERK信號通路是多種細胞因子和炎癥介質(zhì)調(diào)控氣道平滑肌增殖的關(guān)鍵途徑[19]。各種生長因子、炎癥因子和神經(jīng)遞質(zhì)都可以通過相應(yīng)的受體途徑激活胞漿內(nèi)的ERK信號通路。實驗研究[19]表明，ERK1、ERK2信號通道在慢性哮喘模型大鼠氣道重塑的發(fā)生機制中發(fā)揮重要作用。本研究發(fā)現(xiàn)，模型組ERK1、ERK2在肺組織中的表達水平與正常組相比明顯升高（P＜0.05），說明哮喘氣道重塑大鼠肺組織中ERK信號通路處于激活狀態(tài)，從而使氣道平滑肌增殖肥厚。與模型組比較，各治療組ERKmRNA的表達水平明顯減少（P＜0.05），而且中藥中劑量組與地塞米松組相比無顯著差異（P＞0.05）。本研究發(fā)現(xiàn)，與正常組比較，模型組p-ERK蛋白表達明顯升高（P＜0.05），說明ERK信號通路在哮喘氣道重塑中具有重要的地位。與模型組比較，中藥高劑量組p-ERK蛋白的表達明顯降低（P＜0.05）。RT-PCR與Westernblot檢測結(jié)果提示，氣陰雙補能夠改善氣道重塑，可能是通過抑制ERKmRNA及磷酸化ERK蛋白的表達，抑制ERK信號通路的激活實現(xiàn)的。

綜上所述，氣道重塑可導(dǎo)致不可逆或可逆性的氣流阻塞和氣道高反應(yīng)性，是目前哮喘慢性化和難治化的重要原因之一。本研究結(jié)果表明，氣陰雙補能夠抑制氣道平滑肌的增殖，抑制ERK信號通路的激活，從而有效的控制氣道炎癥，改善氣道重塑，為臨床實踐提供依據(jù)。

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（收稿：2015-11-02 修回：2015-12-17）

Effects of Chinese Medical Qi and Yin Method on Airway Remodeling and ERK Signal Molecule Expres- sion in Asthmatic Rats

ZHOU Xingxing1,XU Xianda2,RUAN Xiaolin1,XUAN Guiqi3,CHEN Jian3.1 The FirstClinical College of Zhejiang Chinese Medical University,Hangzhou(310053),China;2 Department of Pediatrics, Xuzhou Chinese Medical Hospital,Xuzhou(221000),China;3 Department of Pediatrics,the First Hospital Affiliated to Zhejiang Chinese Medical University,Hangzhou(310006),China

ObjectiveTo investigate the influence of traditional Chinese medicine Qi-Yin method on trachea remodeling and the expression of extracellular signal adjust the protein kinase（ERK）signal molecules in stable asthmatic rats.MethodsForty-eight weight 180-200g healthy male Wistar rats were randomly divided into blank control group,asthma model group,traditional Chinese medicine low-dose group,traditional Chinese medicine middle-dose group,traditional Chinese medicine high-dose groupand dexamethasone group,with 8 rats in each group. The asthma trachea remodeling rat model was set up with ovalbumin（OVA）sensitization and activation.Lung tissue pathology image analysis was used to analyze trachea remodeling,RT-PCR to detect ERK1/2mRNA expression in trachea,western blot to determine p-ERK protein expression in trachea smooth muscle.ResultsCompared with normal group,asthma model group had higher lung tissue section smooth muscle standardized area（WAm/Pbm）and inside tube wall standardized area（WAi/Pbm）（17.34±0.63μm2/μm vs 7.63±0.32μm2/μm;42.35±3.31μm2/μm vs26.73±1.50μm2/μm;all P＜0.05）.The WAm/Pbm and WAi/Pbm were 13.68±0.52μm2/μm and 37.53±2.57μm2/μm in traditional Chinese medicine low-dose group,10.57±0.72μm2/μm and 33.74±1.21μm2/μm in traditional Chinese medicine middle-dose group,9.33±0.92μm2/μm and 30.62±1.34μm2/μm in traditional Chinese medicine high-dose group,which were significantly reduced compared to asthma model group,but still higher than those in blank control group（all P＜0.05）.ERK1mRNA,ERK2mRNA,and p-ERK protein expression were significantly higher in asthma model group than those in blank control group（4.26±0.52,3.54±0.37,3.288±0.641 vs 1.02±0.11,0.96±0.13, 0.703±0.338;all P＜0.05）.The ERK1/2mRNA in traditional Chinese medicine low-dose group were 3.23±0.45 and 2.72±0.21,in traditional Chinese medicine middle-dose group were 1.65±0.26 and 1.36±0.14,in traditional Chinese medicine high-dose group were 2.37±0.23 and 2.03±0.12;p-ERK in traditional Chinese medicine middle-and high-dose groups were 2.172±0.221 and 1.127±0.631,which were lower than those in asthma model group but still higher than those in blank control group（all P＜0.05）.ConclusionThe traditional Chinese medicine of Qi&Yin double repair method is good for trachea remodeling in stable asthmatic rat,by inhibiting expression of ERKl/2mRNA and p-ERKl/2 protein in trachea.

rats;asthma;trachea remodeling;ERK;Qi&Yin double repair method

浙江省自然科學(xué)基金資助項目（No.LY15H270004）

1浙江中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院（杭州 310053）；2江蘇省徐州市中醫(yī)院兒科（徐州 221000）；3浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院兒科（杭州 310006）

陳健，Tel：13634199868；E-mail：chenj670@163.com