朱阿楠方亞君許 紅王利峰陳洪宇俞艷雯

·論著·

2型糖尿病腎病CX3CR1基因多態(tài)性相關(guān)因素及中醫(yī)證型分析

朱阿楠1方亞君1許 紅1王利峰1陳洪宇2俞艷雯1

目的探討糖尿病腎?。―N）患者CX3CR1-V249I基因突變與中醫(yī)證型、尿微量白蛋白與肌酐比值（ACR）及炎癥因子之間的關(guān)系。方法應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)限制性片段長度多態(tài)性的方法及反向測序法檢測108例DN患者CX3CR1-V249I多態(tài)性情況，同時測定DN患者血漿同型半胱氨酸（Hcy）、糖化血紅蛋白（HbA1c）、ACR、低密度脂蛋白（LDL）、核因子-κB（NF-κB）、白介素-6 （IL-6）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、趨化因子Fractalkine（FKN）含量，并記錄患者的中醫(yī)證型。結(jié)果108例DN患者中CX3CR1基因VV型87例，Ⅵ型17例，Ⅱ型4例。中醫(yī)證型與CX3CR1-V249I基因型之間具有相關(guān)性（χ2=10.136，P＜0.05），VV型基因多辨證為氣陰兩虛型，Ⅵ和Ⅱ型以陰虛燥熱為主。與陰虛燥熱型和陰陽兩虛型比較，氣陰兩虛型患者具有更高的ACR水平[（948.3±36.4）mg/g比（919.3±31.5）mg/g、（921.8±37.9）mg/g，F(xiàn)=4.946，P＜0.05]；與痰濕證、濕熱證比較，兼血瘀證患者具有更高的ACR水平 [（954.3±34.3）mg/g比（921.5±36.9）mg/g、（917.8±37.1）mg/g，F(xiàn)=7.283，P＜0.05]。CX3CR1-V249I基因突變與Hcy、ACR水平相關(guān)（t=3.601、2.692，P均＜0.05）。且V249I野生型（VV型）患者較突變型（Ⅵ型+Ⅱ型）患者NF-Kb[（0.94±0.16）ng/mL比（0.75±0.17）ng/mL，t=7.926，P＜0.05]、IL-6[（170.75±34.01）pg/mL比（147.43±27.23）pg/mL，t=5.472，P＜0.05]、TNF-α[（95.91±19.21）ng/mL比（81.12±13.50）ng/mL，t=2.887，P＜0.05]含量要高，F(xiàn)KN則在突變型患者表達(dá)更多 [（1.10± 0.19）ng/mL比（0.83±0.12）ng/mL，t=9.246，P＜0.05）。結(jié)論DN患者CX3CR1-V249I基因多態(tài)性與Hcy、ACR、NF-κB、IL-6、TNF-α、FKN及中醫(yī)證候相關(guān)。

糖尿病腎?。恢嗅t(yī)證候；CX3CR1；尿微量白蛋白/肌酐比值；同型半胱氨酸；炎癥介質(zhì)

糖尿病腎?。╠iabetic nephropathy，DN）是糖尿病引起的最嚴(yán)重、危害性最大的一種慢性并發(fā)癥，病變特點是微血管病變導(dǎo)致的腎小球硬化。CX3CR1是趨化因子（fractalkine，F(xiàn)KN）的高選擇性受體，參與了白細(xì)胞黏附和聚集以及遷移,在血管內(nèi)皮的炎性損傷中起重要作用。CX3CR1-V249I基因突變可能對這一過程產(chǎn)生影響。本課題研究CX3CR1基因多態(tài)性和中醫(yī)證型、尿微量白蛋白與肌酐比值（albumin to creatinine ratio，ACR）及炎癥因子之間的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 2009年1月—2013年12月本院門診或住院2型DN患者108例，男70例，女38例，平均年齡（60.15±10.21）歲，平均糖尿病病程（9.0±2.42）年。所有病例診斷符合中國2型糖尿病防治指南（2007年版）糖尿病腎病診斷標(biāo)準(zhǔn)[2]，要求3～6個月內(nèi)至少出現(xiàn)2次ACR異常，ACR＞300mg/g診斷為大量白蛋白尿；ACR 30～300mg/g為微量白蛋白尿。中醫(yī)辨證分型標(biāo)準(zhǔn)參照《中藥新藥臨床研究指導(dǎo)原則》[3]分為陰虛熱盛、氣陰兩虛、陰陽兩虛，兼證分為痰濕證、血瘀證、濕熱證。排除原發(fā)性腎臟疾病患者；嚴(yán)重的心血管與肝臟疾病患者；30歲以下；合并感染或發(fā)熱患者；腫瘤患者。所有受試者均簽署知情同意書。

1.2 臨床生化指標(biāo)及炎癥因子檢測方法 所有受檢者過夜禁食12h后，于晨起空腹采集肘靜脈血，應(yīng)用自動生化分析儀檢測低密度脂蛋白膽固醇（LDLC）、腎功能；應(yīng)用美國伯樂公司高壓液相自動測定儀測定糖化血紅蛋白（HbA1c）。采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）測定（酶標(biāo)儀型號：DENLEY DRAGON Wellscan MK 3；產(chǎn)地：芬蘭Thermo公司）血清FKN、核因子-κb、白細(xì)胞介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）濃度。留取晨尿，應(yīng)用日立生化分析儀，采用肌酐酶法檢測尿肌酐；應(yīng)用西門子BN-2全自動免疫分析儀，采用散射比濁法檢測尿微量白蛋白，測量2次尿微量清蛋白與尿肌酐，取兩次測量ACR平均值，ACR=尿微量白蛋白/尿肌酐×88 400，單位是mg/g[2]。

1.3 人外周血全血基因組DNA提取及CX3CR1基因多態(tài)性分析 每樣本（空腹肘靜脈血，EDTA-K2抗凝，-70℃低溫冰箱保存）取300μL全血，利用杭州艾迪康醫(yī)學(xué)研究中心提供的外周血DNA提取試劑盒提取基因組DNA，DNA濃度為50～150ng/μL。引物由杭州艾迪康醫(yī)學(xué)研究中心合成：上游引物：5’TCAT CCAGACGCTGTTTTCC-3’，下游引物：5’-GGCATTT CCCATACAGGTG-3’。PCR產(chǎn)物經(jīng)測序（測序過程及測序圖略），總長為588bp。NCBI上進(jìn)行BLAST，確認(rèn)為目的基因，符合研究設(shè)計。使用限制性內(nèi)切酶AclⅠ對V249I酶切位點進(jìn)行酶切。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS17.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計分析，等位基因頻率比較采用R×C列聯(lián)表χ2檢驗，計量資料兩組間均數(shù)比較采用t檢驗，多組間指標(biāo)均值比較采用方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CX3CR1基因V249I酶切結(jié)果 V249I多態(tài)位點中，顯示僅1條條帶（295bp），為突變型純合子Ⅱ型（4例），顯示2條條帶（104bp、191bp），為野生型純合子VV型（87例），顯示3條條帶（104bp、191bp和295bp），為雜合子Ⅵ型（17例）（圖1，見插頁）。

2.2 中醫(yī)證型與基因型相關(guān)性分析 糖尿病腎病的中醫(yī)證型與CX3CR1-V249I基因型之間具有相關(guān)性（χ2=10.136，P＜0.05），VV型基因多辨證為氣陰兩虛型，Ⅵ和Ⅱ型以陰虛燥熱為主，見表1。中醫(yī)兼證證型與CX3CR1-V249I基因型之間也具有相關(guān)性（χ2= 13.909，P＜0.01），VV型以血瘀證最多，VI和Ⅱ型以痰濕證為主，見表2。

表1 糖尿病腎病患者中醫(yī)證候與基因型的相關(guān)性[例（%）]

表2 糖尿病腎病患者中醫(yī)兼證與基因型的相關(guān)性[例（%）]

2.3 CX3CR1-V249I各基因型的相關(guān)因素分析V249I野生型（VV型）和突變型（因純和突變例數(shù)較少，故將Ⅵ+Ⅱ合為突變型）患者平均動脈血壓、血肌酐、低密度脂蛋白及糖化血紅蛋白含量比較無明顯差異（P＞0.05）。野生型患者較突變型患者ACR、Hcy、NF-κB、IL-6、TNF-α含量增高，F(xiàn)KN則在突變型患者表達(dá)更多（P＜0.05，P＜0.01）。見表3。

表3 糖尿病腎病患者各基因型相關(guān)因素分析

2.4 不同中醫(yī)證型糖尿病腎病患者ACR比較 各中醫(yī)證型組間ACR比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F= 4.946，P＜0.01），氣陰兩虛型患者ACR值明顯較其他兩組升高。兼血瘀證患者較非血瘀證患者具有更高的ACR水平，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=7.283，P＜0.01），見表4。

3 討 論

糖尿病腎病乃本虛標(biāo)實之證，本虛有“氣陰兩虛”、“陰虛”、“（氣）陽虛”、“陰陽兩虛”等虛證。標(biāo)實有血瘀、濕濁、燥熱等實證[4]。本文采用的“三型辨證”理論體系依據(jù)為衛(wèi)生部制定《中藥新藥臨床研究指導(dǎo)原則》。本研究中108例患者中氣陰兩虛共54例，占50.0%，血瘀證在兼證中占46.3%，因此，氣陰兩虛兼血瘀可能為DN的主要病機(jī)。

多數(shù)學(xué)者[5-6]認(rèn)為，DN的基本病機(jī)演變?yōu)殛幪撛餆帷獨(dú)怅巸商摗庩杻商?，其中氣陰兩虛階段的持續(xù)時間較長，為影響疾病轉(zhuǎn)歸之樞紐，而血瘀兼證是導(dǎo)致病情遷延進(jìn)展的重要因素。本研究通過分析DN患者CX3CR1-V249I基因型與中醫(yī)證候之間的關(guān)系發(fā)現(xiàn)，野生型主證以氣陰兩虛分布比例最高，Ⅵ和Ⅱ型以陰虛燥熱為主。兼證中,野生型以血瘀證最多，Ⅵ和Ⅱ型以痰濕為主。且氣陰兩虛、兼血瘀證患者ACR較其他兩型明顯增高（P＜0.01）。說明野生型患者可能更易發(fā)生腎臟損害。CX3CR1-V249I位于CX3CR1第6跨膜區(qū)，等位基因突變的結(jié)果是異亮氨酸在密碼子249處替代了纈氨酸。本課題組既往研究[7]發(fā)現(xiàn)，CX3CR1基因的249I等位基因與DN發(fā)生的危險性下降明顯相關(guān)，獨(dú)立于DN其他危險因素。因此，對于野生型、氣陰兩虛、兼血瘀證患者，及早予以中醫(yī)辨證施治有著積極的作用。

ACR是判斷2型糖尿病進(jìn)展為DN的重要指標(biāo)，且與腎臟病變嚴(yán)重程度有密切關(guān)系[1]，且利用尿肌酐矯正的辦法使隨機(jī)尿微量白蛋白的結(jié)果穩(wěn)定可靠。Hcy是蛋氨酸循環(huán)中的重要產(chǎn)物，可直接損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞，還可促血小板凝聚、脂蛋白氧化和平滑肌增生、加速血管病變[7]。研究[8-9]發(fā)現(xiàn)，血清Hcy水平越高，周圍血管病變的程度愈加嚴(yán)重，且高Hcy血癥被認(rèn)為是血管性疾病的獨(dú)立危險因素。本研究發(fā)現(xiàn)，V249I野生型患者較突變型患者ACR、Hcy含量高。這一結(jié)果說明野生型患者更易出現(xiàn)腎臟血管病變及蛋白漏出，加速DN的發(fā)生發(fā)展。有研究[10]發(fā)現(xiàn)，LDL可以刺激單核細(xì)胞趨化蛋白1（MCP-1）的表達(dá)，引起單核-巨噬細(xì)胞趨化，促進(jìn)腎小球動脈硬化的發(fā)展。但本研究中野生型患者和突變型患者LDL水平無差異（P＞0.05），也可能其引起腎臟損傷的機(jī)制與FKNCX3CR1系統(tǒng)關(guān)系不大，有待進(jìn)一步研究。

表4 糖尿病腎病患者中醫(yī)證候與基因型的相關(guān)性

CX3CR1是G-蛋白偶聯(lián)受體，趨化因子FKN與CX3CR1結(jié)合以后，啟動細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)機(jī)制并形成級聯(lián)反應(yīng)，促進(jìn)單核細(xì)胞表達(dá)TNF-α和NF-κB，從而產(chǎn)生相應(yīng)的生物學(xué)效應(yīng)[11]。本研究發(fā)現(xiàn)，V249I野生型患者較突變型患者NF-κB、IL-6、TNF-α含量高，F(xiàn)KN則在突變型患者表達(dá)更多。雖然突變型患者FKN含量較高，但CX3CR1-V249I變異型對FKN的趨化活性下降，與FKN的結(jié)合率也降低[12]。而DN患者CX3CR1-V249I野生型相對變異型而言，CX3CR1表達(dá)增加，對FKN的趨化活性增強(qiáng)，F(xiàn)KN-CX3CR1系統(tǒng)激活，單核細(xì)胞表達(dá)NF-κB和TNF-α增加，腎血管內(nèi)皮細(xì)胞和系膜細(xì)胞的損傷，促進(jìn)DN的發(fā)生發(fā)展；NF-κB的增加促使血清IL-6升高并刺激腎小球系膜增殖、細(xì)胞外基質(zhì)的產(chǎn)生，使腎小球濾過膜增厚[13]，加速DN的病情進(jìn)展。

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（收稿2015-06-09 修回2015-10-28）

Relationship Between the Correlated Factors of CX3CR1 Mutations and the Different TCM Syndromes inType-2 Diabetic Nephropathy

RZHU A'nan1,FANG Yajun1,XU Hong1,WANG Lifeng1,CHEN Hongyu2,YU Yanwen1. 1 Department of Internal Medicine,Yuyao Traditional Chinese Medicine Hospital,Yuyao(315400),China; 2 Department of Nephrology,Hangzhou Traditional Chinese Medicine Hospital,Hangzhou(310006),China

ObjectiveTo explore the relationship between CX3CR1-V249I mutation and the different syndromes of TCM,albumin to creatinine ratio（ACR）and inflammatory cytokines in patients with type-2 diabetic nephropathy （DN）.MethodsBy polymerase chain reaction and restriction fragment length polymorphism（PCR-RFLP）and re verse sequencing method,CX3CR1-V249I gene polymorphism was analyzed in 108 patients with DN.The levels of homocysteine（Hcy）,glycosy lated hemoglobin（HbA1c）,ACR,low-density lipoprotein and the serum contents of NF-κb,IL-6,TNF-α,and FKN were detected.The TCM syndromes of DN in patients were recorded.ResultsOut of 108 patients,87 had VV wild genotype and 21 had non-wild genotype including 17 of VI genotype and 4 of homozygote（II genotype）.The CX3CR1-V249I gene polymorphisms was related to the TCM syndromes of DN （χ2=10.136,P＜0.05）.Patients with genotype VV had mostly the syndrome of Qi and Yin deficiency,and patients with genotype VI+II had mostly the syndrome of Yin deficiency with heat.Patients with the syndrome of Qi and Yin deficiency had higher ACR level compared with patients with the syndrome of Yin deficiency with heat and the syndrome of Yin and Yang deficiency（948.3±36.4mg/g vs 919.3±31.5mg/g and 921.8±37.9mg/g;F=4.946,P＜0.05）;patients with the syndrome of Qi and Yin deficiency accompanying to blood stasis had higher ACR level compared with patients with the syndrome of Qi and Yin deficiency accompanying to phlegmatic hygrosis or dampheat constitution（954.3±34.3mg/g vs 921.5±36.9mg/g and 917.8±37.1mg/g;F=7.283,P＜0.05）.CX3CR1-V249I mutation was related with serum Hcy level and ACR level（t=3.601,2.692,P＜0.05）.The serum contents of NF-κB, IL-6,and TNF-α were increased significantly in the patients with VV genotype than those with VI+II genotypes （NF-κB：0.94±0.16ng/mL vs 0.75±0.17ng/mL,t=7.926,P＜0.05;IL-6：170.75±34.01pg/ml vs 147.43±27.23pg/ml,t= 5.472,P＜0.05;TNF-α：95.91±19.21ng/mL vs 81.12±13.50ng/mL,t=2.887,P＜0.05）,but FKN was lower（0.83± 0.12ng/mL vs 1.10±0.19ng/mL,t=9.246,P＜0.05）.ConclusionThe CX3CR1 polymorphism in patient of type-2 DN was related with serum Hcy,ACR,NF-κB,IL-6,TNF-α,and FKN and TCM syndromes.

diabetic nephropathy;TCM syndrome;CX3CR1;urinary albumin to creatinine ratio;homocysteine; mediators of inflammation

浙江省余姚市科技局項目（No.2009Y11）

1浙江省余姚市中醫(yī)院內(nèi)科（朱阿楠）、腎內(nèi)科（方亞君、許紅、王利峰、俞艷雯）（余姚 315400）；2杭州市中醫(yī)院腎內(nèi)科（杭州 310006）

朱阿楠，Tel：0574-62674919；E-mail：yylinyanrong@163.com