夏曉華，盧辰華，李墨溢，王 坡，董 慧，高亞丹，常重杰*

(1.河南師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453007； 2.河南師范大學(xué)附屬中學(xué) 高三五班，河南 新鄉(xiāng) 453007)

乙氧氟草醚對大鱗副泥鰍的毒性研究

夏曉華1，盧辰華1，李墨溢2，王 坡1，董 慧1，高亞丹1，常重杰1*

(1.河南師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453007； 2.河南師范大學(xué)附屬中學(xué) 高三五班，河南 新鄉(xiāng) 453007)

為了檢測除草劑乙氧氟草醚對水生生物的毒性，以大鱗副泥鰍(Paramisgurnusdabryanus)為受試對象，研究乙氧氟草醚對大鱗副泥鰍的急性毒性、生理毒性和DNA損傷程度。結(jié)果顯示，隨著染毒劑量的增加和染毒時間的延長，大鱗副泥鰍的死亡率升高。乙氧氟草醚對大鱗副泥鰍24 h、48 h、72 h、96 h的半數(shù)致死質(zhì)量濃度(LC50)分別為41.87 mg/L、36.62 mg/L、29.96 mg/L、25.62 mg/L，安全質(zhì)量濃度為8.40 mg/L。生理毒性試驗(yàn)結(jié)果顯示，15.5 mg/L乙氧氟草醚染毒6 d,大鱗副泥鰍血液中谷丙轉(zhuǎn)氨酶(GPT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(GOT)活力值最大，與對照(0 mg/L)相比差異極顯著。整體上，GPT和GOT活力隨著染毒時間的延長和染毒劑量的升高呈上升趨勢。通過單細(xì)胞凝膠電泳研究乙氧氟草醚對大鱗副泥鰍的DNA損傷，試驗(yàn)結(jié)果顯示，6 d時試驗(yàn)處理組彗尾DNA百分含量、彗星尾長和Olive尾矩與對照相比均具有極顯著差異(P<0.01)。表明，乙氧氟草醚對大鱗副泥鰍具有一定的毒性和DNA損傷效應(yīng)，應(yīng)適量施用。

乙氧氟草醚； 大鱗副泥鰍； 毒性； 谷丙轉(zhuǎn)氨酶； 谷草轉(zhuǎn)氨酶； 單細(xì)胞凝膠電泳技術(shù)

乙氧氟草醚(oxyfluorfen)是一種觸殺型除草劑，在有光的情況下發(fā)揮除草作用[1]。長期大量應(yīng)用化學(xué)除草劑帶來的殘毒和環(huán)境污染，直接危害到人畜健康，影響農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展[2]。農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的不合理使用、雨水沖刷、地表徑流及農(nóng)藥廠污水的肆意排放等，使乙氧氟草醚進(jìn)入河流、湖泊、海洋等水生生態(tài)系統(tǒng)，從而對水生生物的生存以及水生生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定與平衡造成威脅。近年來，許多專家學(xué)者著重就乙氧氟草醚的分析方法、藥效、殘留動態(tài)等開展了較為系統(tǒng)的研究[3-5]，關(guān)于乙氧氟草醚對水生生物的遺傳毒性研究較少。

稻田養(yǎng)魚，也被稱作嵌套養(yǎng)殖，是人工稻魚共生的生態(tài)結(jié)構(gòu)，屬淡水養(yǎng)魚的組成部分，將種植業(yè)與養(yǎng)殖業(yè)結(jié)合起來，稻魚互利互惠，從而實(shí)現(xiàn)稻魚雙豐收。該組合與中國南方農(nóng)業(yè)中的“?；~塘”模式一樣，構(gòu)成了生物多樣性保護(hù)和農(nóng)業(yè)資源利用的良性循環(huán)[6]。而泥鰍(廣義)又屬稻田生態(tài)漁業(yè)的優(yōu)良養(yǎng)殖品種，其產(chǎn)量和效益均高于稻田養(yǎng)魚、養(yǎng)蟹,精養(yǎng)泥鰍的稻田效益顯著。大鱗副泥鰍(Paramisgurnusdabryanus)屬魚綱、鯉形目、鰍科、花鰍亞科、副泥鰍屬。大鱗副泥鰍因其營養(yǎng)價值高而被稱為“水中人參”，在國內(nèi)外市場深受歡迎。

從環(huán)境毒理學(xué)的觀點(diǎn)出發(fā)，無論污染物對生態(tài)系統(tǒng)的影響多復(fù)雜或最終的影響如何嚴(yán)重，必然是從對生物個體的作用開始。鄒積鑫等[7]研究了乙氧氟草醚的同類藥劑乙羧氟草醚對斑馬魚的急性毒性和生物富集性，發(fā)現(xiàn)其對魚類的急性毒性較高,因此在施用時應(yīng)合理控制劑量,盡量減少對水生生物的影響。

新鄉(xiāng)市地處河南省北部，是黃河流域盛產(chǎn)大鱗副泥鰍的三大地區(qū)之一。目前，關(guān)于乙氧氟草醚對大鱗副泥鰍的毒性研究尚未見報(bào)道。為此，以當(dāng)?shù)卮篦[副泥鰍為材料，探究了乙氧氟草醚對大鱗副泥鰍的急性毒性、生理毒性和遺傳毒性，旨在為安全使用乙氧氟草醚、保護(hù)漁業(yè)資源、維護(hù)生態(tài)平衡奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 供試材料及試劑

350尾大鱗副泥鰍，購自河南新鄉(xiāng)市海鴻農(nóng)貿(mào)市場，發(fā)育狀況良好，體質(zhì)量13～16 g，體長9～12 cm。試驗(yàn)前用曝氣3 d的自來水馴養(yǎng)1周，馴養(yǎng)期間死亡率小于2 %；挑選健康、體表無損的個體作為試驗(yàn)材料。試驗(yàn)前1 d停止喂食，進(jìn)行饑餓處理，試驗(yàn)期間不投喂。

乙氧氟草醚制劑購自上海惠光化學(xué)有限公司；谷丙轉(zhuǎn)氨酶(GPT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(GOT)活力測定試劑盒購自南京建成生物工程研究所。

1.2 方法

1.2.1 乙氧氟草醚對大鱗副泥鰍的急性毒性試驗(yàn) 通過預(yù)試驗(yàn)，找出乙氧氟草醚使大鱗副泥鰍在96 h內(nèi)全部存活的最高染毒劑量和全部死亡的最低染毒劑量，確定試驗(yàn)劑量區(qū)間。正式試驗(yàn)分6組，乙氧氟草醚質(zhì)量濃度分別為0 mg/L、18.75 mg/L、23.44 mg/L、29.30 mg/L、36.62 mg/L、45.78 mg/L，每組均投放10尾健康大鱗副泥鰍，每24 h更換1次等體積等質(zhì)量濃度的乙氧氟草醚，注意觀察并及時清除死亡個體，以免影響其他個體的生存。然后觀察記錄大鱗副泥鰍24 h、48 h、72 h及96 h的死亡數(shù)量，并記錄其中毒的癥狀。試驗(yàn)重復(fù)3次。

采用改進(jìn)的寇氏法(Karber)[8-9]計(jì)算乙氧氟草醚對大鱗副泥鰍的半數(shù)致死質(zhì)量濃度(LC50)和安全質(zhì)量濃度。LC50的計(jì)算公式：lgLC50=Xm-i(∑p-0.5),式中Xm為死亡組最大劑量的對數(shù)；i為相鄰組質(zhì)量濃度對數(shù)之差；p為各組的死亡率，∑p為各組死亡率的總和。安全質(zhì)量濃度(SC)的計(jì)算公式：SC=LC50(24 h)×0.3/[LC50(24 h)/LC50(48 h)]3。

1.2.2 乙氧氟草醚對大鱗副泥鰍的生理毒性試驗(yàn) 在急性毒性試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，在安全質(zhì)量濃度和最大零致死質(zhì)量濃度之間，設(shè)置乙氧氟草醚質(zhì)量濃度分別為0 mg/L(CK)、8.0 mg/L、10.5 mg/L、13.0 mg/L、15.5 mg/L 5個試驗(yàn)組，每組均隨機(jī)投放20尾健康大鱗副泥鰍，每隔1 d更換1次等體積等質(zhì)量濃度的乙氧氟草醚。分別于2 d、4 d、6 d從每組隨機(jī)取3尾大鱗副泥鰍，剪尾取血,按試劑盒說明書測定GPT、GOT活力。試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.3 乙氧氟草醚對大鱗副泥鰍血細(xì)胞的DNA損傷試驗(yàn) 參照文獻(xiàn)[10-11]的方法將1.2.2步驟取的血樣制備血細(xì)胞懸液，制備玻片、裂解、解旋、電泳、中和，然后進(jìn)行染色和觀察。試驗(yàn)重復(fù)3次。

大鱗副泥鰍的單細(xì)胞凝膠電泳試驗(yàn)結(jié)果運(yùn)用CASP軟件進(jìn)行分析，得出彗尾DNA (Tail DNA)百分含量、彗尾長度(TL)、Olive尾矩(OTM)3項(xiàng)指標(biāo)的數(shù)據(jù)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel和SPSS 16.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 乙氧氟草醚對大鱗副泥鰍的急性毒性

大鱗副泥鰍剛?cè)径緯r，表現(xiàn)為急劇游動、四處亂竄，尤其在高劑量組中表現(xiàn)更為明顯，上竄下跳、打團(tuán)、翻白，片刻后稍趨于平靜，伏于水底，胸鰭張開。隨著乙氧氟草醚劑量的增加，死亡率不斷升高，大鱗副泥鰍表現(xiàn)為反應(yīng)遲鈍、身體彎曲、游動緩慢，逐漸喪失平衡能力，翻白肚等現(xiàn)象，死亡時身體僵直，脊椎略彎曲成弓形。

由表1可知，乙氧氟草醚對大鱗副泥鰍24 h、48 h、72 h、96 h的半數(shù)致死質(zhì)量濃度分別為41.87 mg/L、36.62 mg/L、29.96 mg/L、25.62 mg/L，安全質(zhì)量濃度為8.40 mg/L。由試驗(yàn)結(jié)果可以看出，同一時間段內(nèi)，大鱗副泥鰍死亡率隨乙氧氟草醚質(zhì)量濃度的升高而增加；同一劑量組，其死亡率隨時間的延長而增加。說明大鱗副泥鰍的死亡率與乙氧氟草醚呈時間劑量效應(yīng)關(guān)系。

表1 乙氧氟草醚各濃度組大鱗副泥鰍的死亡率、半數(shù)致死質(zhì)量濃度和安全濃度

2.2 乙氧氟草醚對大鱗副泥鰍血清GPT和GOT活性的影響

由表2可知，15.5 mg/L乙氧氟草醚處理6 d后，大鱗副泥鰍GPT、GOT活力最大，與對照組相比有極顯著差異，分別增高172.88%、174.66%。從相同時間不同質(zhì)量濃度來看，大鱗副泥鰍的GPT、GOT活力均隨乙氧氟草醚染毒劑量的上升而呈升高的趨勢；從相同質(zhì)量濃度不同時間來看，隨著時間的延長，血清里的GPT、GOT活力也都呈升高趨勢?？梢姡篦[副泥鰍血清GPT及GOT活力與乙氧氟草醚呈時間劑量效應(yīng)關(guān)系。通過生理毒性試驗(yàn)結(jié)果可以看出，血清中GPT和GOT活力均升高，這是由于肝臟因毒物影響而受損，使肝臟中的這2種酶大量釋放到血清中，從而導(dǎo)致血清中這2種酶活力增強(qiáng)。

注：*表示與對照組比較差異顯著(P<0.05),**表示與對照組比較差異極顯著(P<0.01)，下同。

2.3 乙氧氟草醚對大鱗副泥鰍血細(xì)胞DNA損傷結(jié)果

細(xì)胞經(jīng)過裂解、解旋、電泳后，斷裂的DNA會在電場力的作用下從核內(nèi)移出，熒光染料染色后，在熒光顯微鏡下，可觀察到受損細(xì)胞核的彗星狀圖像。由圖1可以看出，處理6 d時對照組細(xì)胞核呈圓球形，彗星頭部DNA致密且集中，細(xì)胞核未受損；隨著乙氧氟草醚劑量的增加，各處理組細(xì)胞核均有拖尾呈現(xiàn)如彗星樣，細(xì)胞核頭部逐漸縮小，拖尾逐漸變長，尾部DNA變得發(fā)散，細(xì)胞核受損程度也越來越嚴(yán)重。

由表3可以看出，乙氧氟草醚染毒2 d時，不同劑量組大鱗副泥鰍血細(xì)胞的慧尾DNA百分含量、尾長和Olive尾距與對照組相比均升高，差異均不顯著(除15.5 mg/L組的慧尾DNA百分含量)；染毒4 d時，乙氧氟草醚低質(zhì)量濃度(8.0 mg/L、10.5 mg/L)處理組，大鱗副泥鰍血細(xì)胞的慧尾DNA百分含量、尾長和Olive尾距與對照組相比均無顯著差異，15.5 mg/L處理組細(xì)胞慧尾DNA百分含量、尾長和Olive尾距顯著或極顯著升高；染毒6 d時，不同劑量組大鱗副泥鰍血細(xì)胞的慧尾DNA百分含量、尾長和Olive尾距均極顯著高于對照組。較高劑量的乙氧氟草醚對大鱗副泥鰍血細(xì)胞DNA造成了損傷。在同一質(zhì)量濃度不同處理時間條件下，隨著處理時間的延長，慧尾DNA百分含量和Olive尾距呈升高趨勢；在相同處理時間不同質(zhì)量濃度條件下，隨著質(zhì)量濃度的升高，尾長逐漸增加,但在第6天高質(zhì)量濃度組(13.0 mg/L、15.5 mg/L)尾長變短。由此可見，乙氧氟草醚誘發(fā)的細(xì)胞DNA損傷率在各濃度之間均呈明顯的劑量效應(yīng)關(guān)系。

CK:對照組； A:8.0 mg/L; B:10.5 mg/L; C:13.0 mg/L; D:15.5 mg/L

質(zhì)量濃度/(mg/L)時間/dTailDNA百分含量/%TLOTM0(CK)0．70±0．2222．00±5．670．77±0．308．021．31±0．0334．50±16．261．46±0．3041．57±0．1423．00±5．201．61±0．2968．87±0．61??109．33±24．11??11．51±0．71??10．521．75±0．0626．67±9．871．82±0．2742．24±0．2837．67±8．742．44±0．12611．52±1．20??143．00±48．04??19．07±6．61??13．022．70±0．0139．33±8．022．76±0．2743．70±0．1784．33±26．58??4．23±0．55621．92±6．18??133．67±12．58??22．83±3．58??15．523．94±0．11?65．00±15．554．80±1．1445．93±0．17??68．00±27．71?7．53±1．20??615．10±2．43??129．00±26．04??19．63±5．68??

3 結(jié)論與討論

應(yīng)用生物檢測水環(huán)境污染，有多種檢測方法。對水生生物常見的檢測方法有生理生化指標(biāo)和遺傳物質(zhì)損傷的檢測，而將泥鰍作為水污染的模式生物進(jìn)行研究已越來越受人們重視。本試驗(yàn)以大鱗副泥鰍為材料，探究乙氧氟草醚對大鱗副泥鰍的毒性作用。根據(jù)中國《化學(xué)農(nóng)藥環(huán)境安全評價試驗(yàn)準(zhǔn)則》[12]，當(dāng)農(nóng)藥對魚類的96 h LC50>10 mg/L時，說明該農(nóng)藥對魚類屬于低毒。由本試驗(yàn)結(jié)果可知，乙氧氟草醚對大鱗副泥鰍的96 h LC50為25.62 mg/L，說明乙氧氟草醚對大鱗副泥鰍為低毒。急性毒性試驗(yàn)結(jié)果表明，隨著染毒時間的延長，大鱗副泥鰍死亡率升高。由此可見，乙氧氟草醚對水生生物有一定的毒害作用。所以，在使用這類農(nóng)藥時一定要注意安全，使用后一定要合理處理廢液，避免污染水源、破壞環(huán)境、對水生生物造成危害。

GPT和GOT是廣泛存在于動物細(xì)胞線粒體中的重要氨基酸轉(zhuǎn)移酶，在機(jī)體蛋白質(zhì)代謝中起著重要作用。當(dāng)生物的生理機(jī)能處于正常情況下，GPT和GOT主要存在于細(xì)胞內(nèi)，而血清中的轉(zhuǎn)氨酶活性很低，當(dāng)肝臟受到毒性物質(zhì)影響而發(fā)生損傷時，肝臟中的這2種酶會大量釋放到血清中，致使血清中這2種酶活性增強(qiáng)，而肝組織中的酶活性降低。因此可根據(jù)血清中這2種酶的活性來判斷肝臟的損傷情況[13-15]。馮健等[16]研究了鎘對草魚的肝胰臟、腎臟功能的影響,結(jié)果表明鎘中毒可使血清中的GOT活性升高。在本試驗(yàn)中，乙氧氟草醚對大鱗副泥鰍處理后GPT和GOT活力均呈升高的趨勢。表明，乙氧氟草醚對大鱗副泥鰍的肝細(xì)胞造成了損傷，導(dǎo)致肝細(xì)胞中這2種酶發(fā)生大量外泄。

在單細(xì)胞水平上檢測DNA鏈損傷的方法，最常見的是單細(xì)胞凝膠電泳技術(shù)。彗尾DNA百分含量、尾長和Olive尾距是彗星試驗(yàn)中反映細(xì)胞DNA所受損傷的重要指標(biāo)。彗尾DNA百分含量和Olive尾距越大，尾長越長，說明細(xì)胞DNA受到的損傷越嚴(yán)重。魚類吸收了水環(huán)境中的毒物，可導(dǎo)致造血干細(xì)胞染色體斷裂，從而影響其外周血環(huán)境[17]，故本研究用彗星電泳檢測了大鱗副泥鰍血細(xì)胞的DNA損傷程度。在6 d時，15.5 mg/L處理組的彗尾DNA百分含量、尾長和Olive尾距均較13.0 mg/L處理組有所下降，可能是由于DNA的損傷過于嚴(yán)重，以致于電泳時造成了DNA片段的丟失，因此導(dǎo)致了測量值的下降[18-19]。

綜上，乙氧氟草醚對大鱗副泥鰍具有一定的急性毒性、生理毒性和DNA損傷效應(yīng)，因此在使用除草劑時一定要適量施用，合理處理廢液，避免污染水源，以減少對生態(tài)環(huán)境和水生生物造成的威脅。同時，合理使用農(nóng)藥是嵌套養(yǎng)殖技術(shù)發(fā)展的關(guān)鍵，對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和環(huán)境保護(hù)及其他相關(guān)領(lǐng)域具有重要意義。

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Toxic Effects of Oxyfluorfen on Paramisgurnus dabryanus

XIA Xiaohua1,LU Chenhua1,LI Moyi2，WANG Po1,DONG Hui1,GAO Yadan1,CHANG Zhongjie1*

(1.College of Life Sciences,Henan Normal University,Xinxiang 453007,China； 2.The Affiliated High School of Henan Normal University,Grade Three Class Five，Xinxiang 453007，China)

In order to assess the toxicity of herbicide oxyfluorfen to aquatic organisms,withParamisgurnusdabryanusas the experimental object,toxic effects of oxyfluorfen onParamisgurnusdabryanusincluding acute toxicity,physicological toxicity and DNA damage were studied.Results showed that theParamisgurnusdabryanus’ mortality increased with the concentration increasing and the extension of time.The LC50of oxyfluorfen toParamisgurnusdabryanusin different periods(24 h,48 h,72 h,96 h) were 41.87 mg/L,36.62 mg/L,29.96 mg/L,25.62 mg/L,respectively.The safety concentration was 8.40 mg/L.Through physicological experiments,the activities of GPT and GOT inParamisgurnusdabryanus’ blood cells increased obviously， the maximum value appeared in the high treatment group(15.5 mg/L) on the sixth day and had significant differences compared with the control(0 mg/L).Overall,the activities of GPT and GOT inParamisgurnusdabryanus’ blood cells increased obviously with the extension of time and the concentration increasing.With single cell gel electrophoresis technique (SCGE),we studied the DNA ofParamisgurnusdabryanusblood cells damaged by oxyfluorfen.The results showed that all the treatment groups’ tail DNA content,tail length,olive tail moment showed obvious differences compared with the control group on the sixth day in a whole (P<0.01).The experiment results showed that the oxyfluorfen had certain toxicity and DNA damage effect onParamisgurnusdabryanus,and it should be used reasonably.

oxyfluorfen；Paramisgurnusdabryanus； toxicity; GPT； GOT； single cell gel electrophoresis(SCGE)

2015-12-28

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31200923)；河南師范大學(xué)青年骨干教師科研項(xiàng)目(5101049470610)；河南師范大學(xué)引進(jìn)人才科研項(xiàng)目(01046500109)

夏曉華(1982-)，女，河南漯河人，副教授，博士，主要從事分子細(xì)胞遺傳學(xué)研究。E-mail:xxhlpf@163.com

*通訊作者：常重杰(1965-)，男，河南禹州人，教授，博士，主要從事分子細(xì)胞遺傳學(xué)研究。E-mail:changzhongjie@tom.com

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1004-3268(2016)07-0122-05