龍登凱，丁 鈴，李 軍，周 濤，江維克，肖承鴻

(貴陽中醫(yī)學院，貴州 貴陽 550002)

太子參GAPDH基因的克隆及序列分析

龍登凱，丁 鈴，李 軍，周 濤*，江維克，肖承鴻

(貴陽中醫(yī)學院，貴州 貴陽 550002)

為了獲取可靠內(nèi)參基因，采用同源克隆技術(shù)和cDNA末端快速延伸技術(shù)，首次從太子參中克隆3-磷酸甘油醛脫氫酶基因(GAPDH)的部分cDNA序列，命名為PhGAPDH，序列長度為981 bp，包含699 bp的部分閱讀框，推測其編碼232個氨基酸，還含有282 bp的3′UTR。序列分析結(jié)果表明，太子參PhGAPDH基因編碼的氨基酸序列與同科植物香石竹(Dianthuscaryophyllus)氨基酸序列同源性高達99%。PCR分析結(jié)果表明，PhGAPDH基因在太子參不同種源塊根、同一種源不同組織及不同生長時期的表達水平較穩(wěn)定，可以作為太子參功能基因研究的內(nèi)部參考基因。

太子參；GAPDH基因； 同源克隆法； cDNA末端快速擴增； 表達模式

理想的內(nèi)參基因應該在所有的生物細胞中和生理狀態(tài)下都能較穩(wěn)定地表達。但是研究表明，沒有任何一種內(nèi)參基因的表達是始終穩(wěn)定的，在一種試驗條件下合適的內(nèi)參基因并不一定適用于另一種試驗條件[1]。因此，在具體試驗條件下選擇合適的內(nèi)參基因作為內(nèi)部參考，從而減小檢測樣本之間的表達差異至關(guān)重要[2]。3-磷酸甘油醛脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)是高等植物糖酵解過程中的一種關(guān)鍵酶，是維持生命活動能量形成的最基本酶之一，具有高度的保守性。GAPDH作為一種含量豐富的胞內(nèi)蛋白質(zhì)，在不同個體及組織細胞中的表達相對穩(wěn)定，具有組成型表達、易于擴增等許多優(yōu)點，因此經(jīng)常和β-actin、18S rRNA等管家基因在半定量RT-PCR、Real-time PCR等基因表達量的研究中作為內(nèi)參基因[3-4]。迄今為止，人們已從銀杏[5]、金龍膽草[6]、羅漢果[7]、羊蹄[8]等藥用植物中克隆得到GAPDH基因，并將其成功用作基因表達分析的內(nèi)部參考基因。

太子參為石竹科植物孩兒參[Pseudostellariaheterophylla(Mip.) Pax ex Pax et Hoffm.]的干燥塊根，具益氣健脾、生津潤肺之功效。現(xiàn)代研究表明，太子參具有降血糖、抗疲勞、增強機體免疫以及抗氧化等功效。目前有關(guān)太子參的研究主要集中在化學成分[9-10]、藥理作用[11-12]、分子鑒定[13]和遺傳多樣性[14]等方面，其在分子生物學領(lǐng)域的研究尚處于起步階段，內(nèi)參基因研究尚未見報道。鑒于此，采用同源克隆及cDNA末端快速延伸技術(shù)克隆太子參GAPDH基因的部分序列，并進行序列分析和組織特異性表達分析，為后續(xù)的太子參功能基因的研究奠定良好的基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

太子參樣本分為不同種源(A)、不同器官(B)、不同生長階段(C)3組。A組為不同種植區(qū)域的太子參塊根材料，分別來自江蘇句容馬山、句容赤山湖，福建柘榮、英山，貴州施秉牛大場種質(zhì)圃1號、種質(zhì)圃2號、種質(zhì)圃3號，共7份；B組為貴州施秉牛大場種質(zhì)圃3號的同株4個器官(花、莖、葉、塊根)，各1份；C組為貴州施秉牛大場種質(zhì)圃3號的同株第1～4莖段及其對應的葉片，各4份。洗凈雜質(zhì)，用液氮速凍后保存于-80 ℃冰箱中備用。

1.2 主要試劑和儀器

質(zhì)粒載體pMD19-T simple vector、RNAiso Plus試劑盒、TaqDNA聚合酶、反轉(zhuǎn)錄酶M-MLV、SMARTer?RACE 5′/3′Kit均購自寶生物工程(大連)有限公司。膠回收試劑盒購自Omega公司。大腸桿菌(Escherichiacoli)菌株DH5α購自上海生工生物工程技術(shù)服務公司。引物合成(表1)及測序服務均由上海生工生物工程技術(shù)服務公司完成。

表1 引物名稱與序列

1.3 試驗方法

1.3.1 RNA的提取及cDNA的合成 取適量太子參新鮮組織置于預冷的研缽中，加液氮迅速研磨成粉末狀。參照RNAiso Plus抽提試劑盒說明書提取總RNA。1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性，微量核酸測定儀檢測其濃度和純度。以RNA為模板、Oligo T11(50 μmol/L)為引物，利用M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA第1鏈。

1.3.2GAPDH核心片段的克隆和3′RACE延伸 從NCBI(National Center for Biotechnology Information，美國國立生物技術(shù)信息中心)上下載薄荷(Menthapiperita，KF061097)、彩葉草(Solenostemonscutellarioides，JX419387)、海蓬子(Salicorniaeuropaea，HM067013)、檸檬(Citruslimon，KJ852651)、漆菇(Saginasubulata，KC136241)，以及坎伯蘭雪草(Mononeuriacumberlandensis，HM017508、HM017509、HM017510)的GAPDH基因序列，通過muscle 3.6軟件進行多序列比較并找到保守區(qū)域，利用軟件Primer 5.0設計簡并引物GAPDH-1F、GAPDH-1R(表1)。以cDNA為模板進行PCR擴增，程序為：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性30 s，61 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，30個循環(huán)；72 ℃后延伸7 min。

根據(jù)上一步所得GAPDH序列設計2條3′末端延伸引物3gaGSP1、3gaGSP2(表1)。以cDNA為模板，參照SMARTer?RACE 5′/3′Kit說明書進行cDNA末端快速延伸。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測，切下目的條帶，用Omega膠回收試劑盒回收產(chǎn)物，將之與pMD19-T simple vector載體相連接，轉(zhuǎn)入DH5α感受態(tài)細胞進行培養(yǎng)、篩選。將篩選到的陽性克隆送至上海生工生物工程技術(shù)服務公司進行測序分析。

1.3.3GAPDH生物信息學分析 利用Genetyx version 7和sequencher V4軟件處理和組裝GAPDH序列。通過NCBI中的BLASTx(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)在線分析工具，對GAPDH編碼的氨基酸序列進行相似性分析，采用muscle 3.6軟件對相似性高的氨基酸序列進行多重比對、分析，利用Mega 4.0軟件以相鄰連接法(Neighbour Joining，NJ)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3.4GAPDH基因組織特異性表達分析 根據(jù)GAPDH核心片段序列設計特異引物G-2F和G-2R(表1)，以總RNA為分析標準，檢測GAPDH基因在太子參7個不同種植區(qū)域塊根中的表達情況，在塊根、莖、葉、花4個器官中的表達情況以及在莖、葉器官不同生長階段中的表達情況。擴增條件為：95 ℃預變性4 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，35個循環(huán)；72 ℃后延伸7 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 總RNA質(zhì)量分析

太子參總RNA電泳檢測結(jié)果(圖1—2)表明，28S和18S RNA條帶明亮清晰，5S RNA條帶較清晰，RNA完整性良好、無降解，且無DNA污染。經(jīng)核酸檢測儀檢測，其OD260/280在1.8～2.0， OD260/230在1.9～2.1，可以用于下一步cDNA的合成。

1～7分別為貴州施秉牛大場種質(zhì)圃1號、2號、3號，福建柘榮，江蘇赤山湖、馬山，福建英山等種植區(qū)域太子參塊根，圖7同； M：DL 2000

A：1～4分別為塊根、花、莖、葉； B：1～4分別為第1～4莖段，5～8分別為第1～4葉位的葉片； M：DL 2000

2.2GAPDH核心片段的克隆及序列分析

以太子參總RNA反轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA為模板，GAPDH-1F和GAPDH-1R為引物進行PCR擴增，得到約500 bp的條帶；利用3′RACE擴增得到約1 000 bp大小條帶(圖3)。測序后的序列經(jīng)Genetyx version 7軟件去除其載體序列，得到539 bp的核心片段序列和918 bp的3′末端序列，與預期大小一致。

利用sequencher V4軟件，對測序所得2條序列進行處理組裝，得到長度為981 bp的GAPDH序列，并將其命名為PhGAPDH，GenBank注冊號為KT899096。

根據(jù)cDNA序列翻譯的相應氨基酸序列(圖4)，PhGAPDH片段編碼區(qū)長699 bp，編碼232個氨基酸殘基，其終止密碼子在第697～699位堿基，3′UTR長度為282 bp。

1、2分別為太子參GAPDH基因核心片段、3′ RACE擴增； M：DL 2000

*表示終止密碼子； 長方形框內(nèi)為多聚腺苷酸尾

運用muscle 3.6軟件，將太子參GAPDH基因編碼的氨基酸序列與香石竹(Dianthuscaryophyllus)、梨(Pyruspyrifoliavar.culta)、大豆(Glycinemax)、麻瘋樹(Jatrophacurcas)、棗(Ziziphusjujuba)等物種的GAPDH氨基酸序列進行多重比較，并利用NCBI的CDD數(shù)據(jù)庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)對太子參GAPDH蛋白進行結(jié)構(gòu)域預測。結(jié)果如圖5所示，本研究所得PhGAPDH基因編碼的氨基酸序列與其他物種的氨基酸序列均具有高度同源性，其中，與香石竹的GAPDH氨基酸序列同源性高達99%。蛋白結(jié)構(gòu)域預測表明，PhGAPDH具有2個結(jié)構(gòu)域，一個為Gp_dh_N，與其他物種有4個氨基酸位點具有差異，另一個為Gp_dh_C，與其他物種有12個氨基酸位點的差異。

1：太子參； 2：香石竹； 3：梨； 4：大豆； 5：麻瘋樹； 6：棗；黑色背景：高度保守的氨基酸序列；黑色方框：GAPDH蛋白的Gp_dh_N和Gp_dh_C結(jié)構(gòu)域

為了更進一步了解該基因的親緣進化關(guān)系，運用Mega 4.0軟件的相鄰連接法構(gòu)建太子參GAPDH氨基酸序列與其他物種氨基酸序列的系統(tǒng)發(fā)育樹。分析所用物種的GenBank登錄號如下：GU356597(毛竹，Phyllostachysedulis)、P34921(香石竹，Dianthuscaryophyllus)、KC136241(漆菇，Saginasubulata)、HQ184063(刺五加，Eleutherococcussenticosus)、AAQ57193(人參，Panaxginseng)、DQ186631(三七，Panaxnotoginseng)、AAA33780(歐洲赤松，Pinussylvestris)、BAD72793(黑松，Pinusthunbergii)。系統(tǒng)進化分析結(jié)果顯示，GAPDH在進化上是非常保守的，來自9種植物的GAPDH分為2個大支，隸屬裸子植物門松柏綱的歐洲赤松、黑松聚為一支，其余7種被子植物聚為另一支。而在被子植物的次級分支下，單子葉植物綱植物獨立為一個分支，另一次級分支為雙子葉植物綱植物，且太子參的GAPDH序列與同科香石竹、漆菇的聚為一類，表明該序列在石竹科植物中高度同源(圖6)。

圖6 GAPDH基因系統(tǒng)進化分析

2.3GAPDH基因組織特異性表達分析

為了分析PhGAPDH基因在太子參不同種植區(qū)域、不同器官、不同生長時期中的表達情況，進行了GAPDH基因組織特異性表達分析。結(jié)果顯示，PhGAPDH基因在7個不同種植區(qū)域太子參塊根、同一種源4個器官和同一種源莖、葉的4個生長時期中均有穩(wěn)定表達，且所得擴增結(jié)果無非特異性條帶和引物二聚體，擴增序列長度與預期大小307 bp相符(圖7—9)。作為看家基因，PhGAPDH基因在不同太子參材料中均有穩(wěn)定表達。

M：DL 500

1～4分別為塊根、花、莖、葉； M：DL 500

1～4分別為第1～4莖段，5～8分別為第1～4位葉片； M：DL 500

3 結(jié)論與討論

高等植物中的3-磷酸甘油醛脫氫酶主要有2類：一類存在于葉綠體中，參與卡爾文碳循環(huán)；另一類存在于細胞質(zhì)中，主要參與糖酵解過程[15-16]。本研究通過同源克隆技術(shù)和cDNA末端快速延伸獲得了1段長度為981 bp的太子參GAPDH基因cDNA序列，包含699 bp的部分閱讀框，推測其編碼232個氨基酸，還含有282 bp的3′UTR。序列分析表明，太子參PhGAPDH基因編碼的氨基酸序列與其同科植物香石竹的GAPDH氨基酸序列相似度高達99%，與其他物種的氨基酸序列相似度在92%～95%，可確定本研究所得序列為太子參GAPDH基因序列。CDD結(jié)構(gòu)域預測分析表明，PhGAPDH含有Gp_dh_N和Gp_dh_C結(jié)構(gòu)域，這2個結(jié)構(gòu)域分別對應糖酵解過程中的3-磷酸甘油醛和NAD+合成，據(jù)此，推測PhGAPDH基因位于太子參的細胞質(zhì)中。

根據(jù)所建系統(tǒng)進化樹，GAPDH基因在進化過程中呈現(xiàn)出極高的保守性，不同物種GAPDH的同源性能夠很好反映物種之間的親緣關(guān)系。雙子葉植物綱、單子葉植物綱以及松柏綱各聚為一個大支。太子參GAPDH與傘形目的刺五加、人參、三七的3-磷酸甘油醛脫氫酶系統(tǒng)起源較近，隸屬雙子葉植物綱分支下。而且，其與同科的香石竹、漆菇聚為一個小支，表明該基因為石竹科所共有，該結(jié)果也更進一步論證了本研究所得序列為太子參GAPDH基因序列。另外，雖然隨著研究的深入，GAPDH基因的功能并非是單一的糖酵解途徑關(guān)鍵酶，但是聚類結(jié)果表明，作為細胞質(zhì)中的關(guān)鍵蛋白，其蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)在高等植物的系統(tǒng)進化過程中被保留下來。

一直以來，GAPDH被認為是僅存于細胞質(zhì)中的管家基因產(chǎn)物，在同種細胞或組織中表達量恒定，故被廣泛用作植物基因表達分析研究中的內(nèi)參對照基因。但最近許多研究表明，不同類型的細胞和組織中、細胞和器官發(fā)育的不同階段以及各種試驗條件等情況下，內(nèi)參基因的表達水平通常變異較大[17-18]。因此，在基因表達研究中需選擇合適的管家基因作內(nèi)部參照。本研究結(jié)果顯示，太子參的PhGAPDH基因在不同種源、不同器官以及莖葉不同生長時期均有穩(wěn)定表達，且其擴增產(chǎn)物特異性強，無引物二聚體。因此，本研究雖未克隆到太子參GAPDH基因的5′端序列，但是結(jié)果完全可以滿足作為內(nèi)參基因的要求，這對太子參基因的表達分析及其生物學功能的研究具有重要的開拓意義。

[1] Volkov R A,Panchuk I I,Schoffl F.Heat-stress-dependency and developmental modulation of gene expression: The potential of house-keeping genes as internal standards in mRNA expression profiling using real-time RT-PCR[J].J Exp Bot,2003,54(391):2343-2349.

[2] Quackenbush J.Microarray data normalization and transformation[J].Nat Genet,2002,32:496-501.

[3] 朱華,李珅,趙瑞強,等.三七植物GAPDH基因克隆及序列分析[J].西北植物學報,2006,26(7):1316-1319.

[4] 位明明,王俊生,張改生,等.GAPDH基因表達與小麥生理型雄性不育花藥敗育的關(guān)系[J].分子植物育種,2009,7(4):679-684.

[5] 潘偉明,劉文,楊妙賢,等.銀杏GAPDH基因序列的初步克隆[J].廣東農(nóng)業(yè)科學,2010,37(8):196-198.

[6] 孫蓉,高靜雷,劉姍,等.金龍膽草3-磷酸甘油醛脫氫酶基因的克隆及序列分析[J].中草藥,2013,44(19):2732-2735.

[7] 余匯,蔣向軍,覃宇燕,等.羅漢果GAPDH基因的克隆及其在基因表達分析中的應用[J].時珍國醫(yī)國藥,2014,25(2):495-498.

[8] 任聰,黃五星,張翔,等.羊蹄GAPDH基因的克隆及序列分析[J].河南農(nóng)業(yè)科學,2015,44(2):115-118.

[9] 賈愛群,李湘,譚寧華,等.太子參環(huán)肽B(Heterophyllin B,HB)的酶環(huán)化反應[J].中國科學(B輯化學),2005,35(6):455-458.

[10] 楊亞濱,譚寧華,許文彥,等.中藥太子參中環(huán)肽A和B含量測定的HPLC方法研究[J].云南中醫(yī)學院學報,2009,32(6):33-36.

[11] 劉訓紅,陳彬,王玉璽.太子參多糖抗應激和免疫增強作用的實驗研究[J].江蘇中醫(yī),2000,21(10):51-52.

[12] 蔡巧燕,林珊,肖桂清,等.太子參內(nèi)生真菌體外抗腫瘤、抗氧化活性研究[J].福建中醫(yī)藥大學學報,2011,21(6):41-43,46.

[13] 趙丹,周濤,江維克,等.太子參藥材的快速分子鑒定[J].中國中藥雜志,2014,39(19):3689-3694.

[14] 肖承鴻,周濤,江維克,等.栽培太子參的遺傳多樣性與質(zhì)量分析[J].中草藥,2014,45(9):1319-1325.

[15] Martin W,Brinkmann H,Savonna C,etal.Evidence for a chimeric nature of nuclear genomes: Eubacterial origin of eukaryotic glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase genes[J].Proc Natl Acad Sci USA,1993,90(18):8692-8696.

[16] Petersen J,Brinkmann H,Cerff R.Origin,evolution,and metabolic role of a novel glycolytic GAPDH enzyme recruited by land plant plastids[J].J Mol Evol,2003,57(1):16-26.

[17] Hu R,Fan C,Li H,etal.Evaluation of putative reference genes for gene expression normalization in soybean by quantitative real-time RT-PCR[J].BMC Mol Biol,2009,10(1):93.

[18] Die J V,Roman B,Nadal S,etal.Evaluation of candidate reference genes for expression studies inPisumsativumunder different experimental conditions[J].Planta,2010,232(1):145-153.

Cloning and Sequence Analysis of GAPDH Gene from Pseudostellaria heterophylla

LONG Dengkai，DING Ling，LI Jun，ZHOU Tao*，JIANG Weike，XIAO Chenghong

(Guiyang College of Traditional Chinese Medicine,Guiyang 550002,China)

In order to achieve a valuable reference gene,a partial cDNA sequence ofGAPDHwas cloned fromPseudostellariaheterophyllaby the homology cloning and RACE,which was namedPhGAPDH.The length ofPhGAPDHcDNA was 981 bp,which encoded 232 amino acids with 282 bp 3′UTR.Sequence analysis indicated that the amino acid ofPhGAPDHshowed high similarity with theGAPDHfromDianthuscaryophyllus(99%).The PCR analysis showed thatPhGAPDHhad a consistent expression in roots from different provenances and in different tissues,growth stages.This result showed thatPhGAPDHcould be used as a reliable reference gene in the function research of genes fromP.heterophylla.

Pseudostellariaheterophylla;GAPDHgene; homology cloning; RACE; expression profile

2016-03-20

國家自然科學基金項目(81460579)；貴州省研究生工作站建設項目(黔教研合JYSZ字[2014]016)；施秉中藥材產(chǎn)業(yè)科技合作專項計劃項目[施中藥科合專項(2014)第6號]

龍登凱(1990-)，男，貴州天柱人，在讀碩士研究生，研究方向：中藥資源鑒定與質(zhì)量控制。 E-mail：lanxitxy@163.com

*通訊作者：周 濤(1968-)，女，貴州凱里人，教授，博士，主要從事中藥材品質(zhì)形成的遺傳與環(huán)境機制研究。 E-mail：taozhou88@163.com

Q785

A

1004-3268(2016)07-0087-06