郭 創(chuàng),王 翔,曹 云,王靜軒,李 璐,姜玉梅,尹 鈞

(河南農(nóng)業(yè)大學/國家小麥工程技術(shù)研究中心,河南 鄭州450002)

小麥轉(zhuǎn)錄因子TabHLH041基因的克隆與表達分析

郭 創(chuàng),王 翔,曹 云,王靜軒,李 璐,姜玉梅,尹 鈞*

(河南農(nóng)業(yè)大學/國家小麥工程技術(shù)研究中心,河南 鄭州450002)

利用RT-PCR方法從小麥品種遼春10號中克隆得到1個bHLH轉(zhuǎn)錄因子基因TabHLH041,并對其表達特性進行分析,以期為研究bHLH轉(zhuǎn)錄因子在小麥發(fā)育中的功能奠定基礎(chǔ)。結(jié)果表明,TabHLH041cDNA開放閱讀框(ORF)長1 179 bp,編碼392個氨基酸,TabHLH041蛋白在C端含有1個bHLH結(jié)構(gòu)域;該基因包括4個外顯子和3個內(nèi)含子。系統(tǒng)發(fā)育分析發(fā)現(xiàn),TabHLH041蛋白與大麥bHLH蛋白親緣關(guān)系最近。實時熒光定量PCR分析表明, 總體上該基因的表達具有晝夜節(jié)律性,在光照條件下表達量呈下降趨勢,在黑暗條件下表達量呈上升趨勢。在低溫條件下,TabHLH041基因的表達呈現(xiàn)前期被誘導、后期被抑制的特征,處理24 h時低溫的抑制作用最明顯;在高鹽、外源ABA和干旱處理條件下,TabHLH041基因的表達持續(xù)受到抑制。綜上,TabHLH041基因可能參與光周期及逆境脅迫的信號轉(zhuǎn)導途徑。

小麥;TabHLH041; 克隆; 表達; 非生物脅迫; 光周期

在自然生長環(huán)境中,植物經(jīng)常要面臨各種脅迫,包括生物脅迫和非生物脅迫(干旱、高鹽、高溫、低溫等)。在面臨外界環(huán)境變化時,植物體內(nèi)基因的表達會發(fā)生變化,以適應環(huán)境變化。轉(zhuǎn)錄因子對基因轉(zhuǎn)錄具有激活或抑制作用,是植物中最重要的一類調(diào)節(jié)因子[1]。bHLH轉(zhuǎn)錄因子廣泛分布于真核生物中,在生物體內(nèi)以大家族形式存在,bHLH是植物的第二大類轉(zhuǎn)錄因子家族,在植物許多生物學過程中發(fā)揮關(guān)鍵調(diào)節(jié)作用,主要包括抗逆境脅迫、光信號傳導、莖分支發(fā)生、花和果實發(fā)育、小孢子發(fā)生、葉片表皮絨毛發(fā)生、氣孔分化和根系生長等[2-4]。近年來,已鑒定出多種bHLH 轉(zhuǎn)錄因子,主要集中在擬南芥和水稻中。其中,大多數(shù)bHLH轉(zhuǎn)錄因子與鹽[5-6]、干旱[7-8]、冷[9]、營養(yǎng)缺乏[10]等逆境脅迫響應有關(guān);也有一些bHLH轉(zhuǎn)錄因子,其表達具有晝夜節(jié)律性,且對與植物節(jié)律鐘和光周期相關(guān)的開花具有重要的調(diào)控作用[11-12]。Shigeru等[11]研究發(fā)現(xiàn),在擬南芥中許多MYB、bHLH、bZIP轉(zhuǎn)錄因子的表達具有晝夜節(jié)律性,其中轉(zhuǎn)錄因子MYB3R2、bHLH69和bHLH92雖然不是生物鐘的組成成分,但它們可以影響LHY(LATEELONGATEDHYPOCOTYL)、CCA1(CIRCADIANCLOCKASSOCIATED1)等節(jié)律相關(guān)基因的表達。后來研究發(fā)現(xiàn),bHLH轉(zhuǎn)錄因子家族的光敏相互作用因子(phytochrome-interacting factors,PIFs)可以通過與光敏素基因相互作用來調(diào)控植物開花;其中,PIF4和PIF5的表達具有節(jié)律性,它們可能通過與節(jié)律鐘基因的相互作用來調(diào)控植物的開花時間[12]。進一步研究發(fā)現(xiàn),擬南芥中的bHLH轉(zhuǎn)錄因子FLOWERING BHLH 1(FBH1)、FBH2、FBH3、FBH4能結(jié)合到光周期效應因子CO(CONSTANS)啟動子的E-box上,正向調(diào)控CO的表達,分別過表達上述4個FBHs基因均能顯著提高CO基因的表達水平,進而促使植株提早開花[13];另外,FBH1基因還能與CCA1基因的啟動子結(jié)合進而調(diào)節(jié)CCA1基因的表達[14]。在擬南芥中,在短日照條件下,bHLH型轉(zhuǎn)錄因子NFL (NO FLOWERING IN SHORT DAY)對于植株開花是必需的,該基因通過GA信號途徑發(fā)揮作用[15]。在小麥中,有關(guān)bHLH轉(zhuǎn)錄因子的報道相對很少,已報道的有TaBHLH1、TaBHLH13等逆境脅迫響應基因[16-17]。其中,TabHLH1基因?qū)Φ土住⒌偷?、干旱和高鹽等逆境明顯應答,其在低磷等非生物脅迫的信號轉(zhuǎn)導中可能發(fā)揮著重要作用[16];TabHLH13是一個鹽脅迫誘導表達基因[17]。為了研究小麥中bHLH轉(zhuǎn)錄因子的作用,在前期小麥光周期表達譜分析(尚未發(fā)表)的基礎(chǔ)上,篩選出一個長日照條件下表達下調(diào)的bHLH轉(zhuǎn)錄因子基因TabHLH041,并對其序列進行生物信息學分析,同時研究TabHLH041在不同光周期處理下的晝夜節(jié)律性表達及在高鹽、干旱、低溫脅迫以及外源ABA處理條件下的表達特性,為進一步探索TabHLH041的生物學功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料及處理

供試材料為普通小麥品種遼春10號和寧春36號。

分別選取籽粒飽滿的遼春10號和寧春36號的種子,經(jīng)表面滅菌后置于25 ℃條件下浸泡12～24 h,種子萌動后播種于裝有營養(yǎng)土的盆中。遼春10號放置于16 h光照/8 h黑暗條件下培養(yǎng)。寧春36號分別放置于每天6 h光照(SD)和18 h光照(LD)2種光周期條件下培養(yǎng)。光照培養(yǎng)箱溫度設(shè)定為21 ℃恒溫,每天常規(guī)水肥管理,保證植株正常生長。3周后剪取寧春36號的葉片用于基因的晝夜節(jié)律性表達分析。取樣時間從照光開始設(shè)為0,每隔3 h取一次,連續(xù)取48 h。同時,剪取遼春10號的葉片用于基因克隆。材料用液氮冷凍后保存于-80 ℃冰箱備用。

選取寧春36號發(fā)芽一致的種子置于滅菌培養(yǎng)皿中,于16 h光照/8 h黑暗、21 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)液為1/2 MS培養(yǎng)液,每隔2 d更換一次,21 d后進行以下處理。(1)對照(CK)：不進行任何脅迫處理;(2)脅迫處理：取一部分幼苗分別放進含有100 μmol/L ABA、100 mmol/L NaCl、20% PEG6000的1/2MS培養(yǎng)液中進行ABA、鹽、干旱處理,另取一部分幼苗置于4 ℃的光照培養(yǎng)箱中進行低溫脅迫處理。分別剪取各個處理0.5、6、12、24 h 的葉片,液氮速凍后置于-80 ℃冰箱中備用。

1.2 DNA 和RNA的提取及cDNA第一鏈的合成

小麥葉片DNA的提取采用CTAB法,總RNA 的提取參照Invitrogen 公司的Trizol Reagent試劑說明書進行。用瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA 的提取質(zhì)量,采用核酸蛋白分析儀測定RNA 濃度和純度?？俁NA 經(jīng)DNaseⅠ(Promega 公司)處理后,參照Invitrogen公司的SuperScriptTMⅢ Reverse Transcriptase反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA。

1.3 小麥TabHLH041基因DNA、cDNA序列的克隆及其編碼蛋白的結(jié)構(gòu)、系統(tǒng)發(fā)育分析

在前期研究所得的小麥光周期表達譜(尚未發(fā)表)中進行篩選獲得TabHLH041基因的EST序列,利用NCBI的ORF Finder分析其ORF,利用Primer Premier 5.0設(shè)計2 條特異性引物用于該基因全長片段的擴增。其中,上游引物F1：5′-CTTGCTGAGGGATGGATGAT-3′,下游引物R1：5′-CCAATCTAAGGTATGGGAATGAG-3′。PCR反應體系參照TaKaRa公司的PremixTaqTM(LATaqTMVersion 2.0)說明書配制,體系為20 μL：2×PremixTaqTM(LATaqTMVersion 2.0) 2.0 μL,上、下游引物各1 μL,模板1 μL,用滅菌蒸餾水補齊至20 μL。以cDNA為模板時,PCR 反應程序為：95 ℃預變性5 min;95 ℃變性30 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸2 min,35個循環(huán);72 ℃最后延伸10 min。以DNA為模板時,PCR反應條件為：95 ℃預變性5 min;95 ℃變性30 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸3 min,35個循環(huán);72 ℃最后延伸10 min。用1%瓊脂糖凝膠對PCR產(chǎn)物進行電泳檢測,回收目的條帶,然后與pMD19-T進行連接,轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α,PCR擴增鑒定后將陽性克隆菌液送至北京華大六合基因有限公司進行測序。

采用DNASTAR 軟件比對TabHLH041基因的cDNA 和基因組DNA序列,以確定內(nèi)含子和外顯子;采用NCBI的Conserved Domains (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi) 進行保守結(jié)構(gòu)域分析;采用PredictProtein (http://www.predictprotein.org/)進行蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的預測;采用NCBI Blast(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)進行蛋白質(zhì)序列同源性比對;采用DNAMAN 軟件進行蛋白質(zhì)序列比對;采用MEGA 6.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進化樹。

1.4 實時熒光定量PCR(qRT-PCR)分析

采用Primer Premier 5.0設(shè)計目的基因qRT-PCR引物F2(5′-GTGATGGTGAAGAGCAGCCT -3′)和R2(5′-GTCCTTCTTTGAGCAGGGGG -3′)。根據(jù)小麥看家基因β-actin(登錄號：AB181991)cDNA序列,采用Primer Premier 5.0設(shè)計其特異引物 F3(5′-GTTCCAATCTATGAGGGATACACGC-3′)和R3(5′-GAACCTCCACTGAGAACAACATTACC-3′)。 qRT-PCR反應體系參照TaKaRa公司的 SYBR Premix ExTaqTMⅡ(Tli RNaseH Plus)試劑盒說明書,20 μL體系含SYBR Premix ExTaqTMⅡ(2×) 10.0 μL,cDNA模板2.0 μL,10 μmol/L 的上、下游引物各1.0 μL,ddH2O 6.0 μL。每個樣品設(shè)置3個重復。反應條件參照TaKaRa公司的 SYBR Premix ExTaqTMⅡ(Tli RNaseH Plus)試劑盒

說明書：95 ℃預變性 30 s;95 ℃變性 5 s,60 ℃退火 30 s,72 ℃ 延伸30 s,40個循環(huán)。在60 ℃反應步驟時收集熒光信號。反應在BIO-RAD CFX Connect Real-Time System上進行。采用2-ΔΔCt方法計算目的基因的相對表達量。

2 結(jié)果與分析

2.1 小麥TabHLH041基因的克隆及其編碼蛋白序列分析

利用NCBI的ORF Finder分析TabHLH041的ORF,利用Primer Premier 5.0在該基因ORF的5′和3′非編碼區(qū)設(shè)計2 條引物用于cDNA和DNA片段的擴增。以遼春10號葉片cDNA和DNA為模板,利用特異性引物對F1和R1進行擴增,結(jié)果得到與預期片段大小一致的產(chǎn)物(圖1)。測序表明,TabHLH041基因DNA長3 135 bp,包含4個外顯子和3個內(nèi)含子(圖2);cDNA片段全長1 531 bp,其中ORF為1 179 bp,5′非編碼區(qū)包含 11 bp,3′非編碼區(qū)包含341 bp,該ORF編碼392個氨基酸。預測編碼的TabHLH041蛋白分子質(zhì)量為42.90 ku,等電點為5.670。保守結(jié)構(gòu)域分析顯示(圖3),TabHLH041蛋白僅在多肽鏈C端有1個bHLH結(jié)構(gòu)域,該結(jié)構(gòu)域含有典型的E-box/N-box識別位點、二聚體界面和DNA結(jié)合堿性區(qū)域。對TabHLH041蛋白進行分析發(fā)現(xiàn),TabHLH041蛋白無跨膜螺旋和雙硫鍵,定位于細胞核中; TabHLH041有2個蛋白結(jié)合位點,分別位于第1、2位氨基酸。

圖1 小麥TabHLH041基因的PCR擴增結(jié)果

圖2 TabHLH041的DNA結(jié)構(gòu)分析

圖3 TabHLH041蛋白的保守結(jié)構(gòu)域分析

2.2TabHLH041編碼氨基酸序列比對及系統(tǒng)發(fā)育分析

將TabHLH041編碼的氨基酸序列與來自大麥(BAJ99887.1)、二穗短柄草(XP_010231939.1)、水稻(BAB90265.1)、高粱(XP_002455828.1)、玉米(XP_008656612.1)、谷子(XP_004969032.1)、擬南芥(NP_200506.1)等含有bHLH結(jié)構(gòu)域蛋白的氨基酸序列進行比對分析(圖4)發(fā)現(xiàn), TabHLH041氨基酸序列長度與其他物種bHLH蛋白氨基酸序列長度相近,所有參比序列均含有1個bHLH結(jié)構(gòu)域,該結(jié)構(gòu)域在序列上非常保守,其中有28個氨基酸在不同bHLH蛋白中是完全相同的,占bHLH結(jié)構(gòu)域氨基酸總數(shù)的57%。TabHLH04蛋白序列與大麥、二穗短柄草、水稻、高粱、玉米、谷子、擬南芥的bHLH蛋白序列同源性分別達92%、57%、53%、51%、46%、50%、21%。

下劃線部分為bHLH結(jié)構(gòu)域; 黑色陰影表示相同氨基酸,灰色陰影表示差異氨基酸;大麥：BAJ99887.1, 二穗短柄草：XP_010231939.1,水稻：BAB90265.1,谷子：XP_004969032.1,玉米：XP_008656612.1, 高粱：XP_002455828.1,擬南芥：NP_200506.1

對小麥TabHLH041蛋白與其他物種bHLH蛋白進行系統(tǒng)發(fā)育分析(圖5),根據(jù)親緣關(guān)系所有參比bHLH蛋白可以分為3類,分別是小麥、大麥、二穗短柄草、水稻、谷子、玉米等親緣關(guān)系較近的單子葉植物bHLH蛋白,油棕、海棗、小果野芭蕉等單子葉植物bHLH蛋白及擬南芥、芝麻等雙子葉植物bHLH蛋白。其中,TabHLH041蛋白與大麥bHLH蛋白親緣關(guān)系最近,其次為二穗短柄草、水稻。

大麥：BAJ99887.1; 二穗短柄草：XP_010231939.1; 水稻：BAB90265.1; 谷子：XP_004969032.1; 玉米：ACG29202.1、 XP_008656612.1; 小果野蕉：XP_009407301.1; 油棕：XP_010925429.1; 海棗：XP_008797775.1; 擬南芥：NP_200506.1; 芝麻： XP_011094007.1

2.3 小麥TabHLH041的表達特性分析

2.3.1 晝夜節(jié)律性TabHLH041基因是在光周期表達譜中篩選出來的,推測該基因可能參與光周期調(diào)控,為此本研究分析了TabHLH041基因的晝夜節(jié)律性表達。從圖6可以看出,無論是在長日照還是短日照條件下,TabHLH041基因表達總體上都有晝夜的節(jié)律性。在LD處理條件下,在0～6 h光照期間TabHLH041基因的表達量持續(xù)下降,之后其表達量持續(xù)上升直到12 h,隨后在12～18 h光照期間該基因表達量先下降后趨于平穩(wěn),最后在黑暗中(18～24 h)其表達量持續(xù)上升;在第2個循環(huán)中,TabHLH041基因的表達量在光照期間(24～42 h)總體呈下降趨勢,而在黑暗中(42～48 h)總體呈迅速上升趨勢。在SD處理條件下,TabHLH041基因的表達量在0～6 h光照期間迅速下降后趨于平穩(wěn),隨后在黑暗中(6～24 h)呈上升—下降—上升趨勢;在第2個循環(huán)中,TabHLH041基因的表達量在光照期間(24～30 h)急劇下降,而在黑暗中(30～48 h)總體呈升高趨勢。這暗示著該基因很有可能在光周期信號轉(zhuǎn)導途徑中發(fā)揮作用。

圖6 TabHLH041基因的晝夜節(jié)律性表達情況

2.3.2 脅迫誘導性 對TabHLH041基因在不同脅迫處理條件下的表達特性進行分析(圖7)發(fā)現(xiàn),在ABA處理條件下,TabHLH041基因在整個脅迫處理過程中均受ABA抑制,在 ABA 處理0.5、6、12、24 h 時，該基因的表達量僅為CK的48%、59%、48%、53%。

在20%PEG6000干旱處理條件下,TabHLH041基因的表達持續(xù)受到抑制。在 20%PEG6000處理0.5、6、12、24 h時，該基因的表達量僅為CK的37%、53%、60%、79%。說明隨著處理時間延長,干旱對該基因表達的抑制程度降低。

在100 mmol/L NaCl處理條件下,TabHLH041基因的表達持續(xù)受到抑制,與CK相比,在處理0.5 h時其表達量降低了1倍,在24 h時抑制效果最明顯,其表達量僅為CK的30%。

在4 ℃低溫處理條件下,處理前期低溫誘導TabHLH041基因表達；從處理12 h開始,低溫抑制該基因表達,在處理24 h時抑制程度最高。

圖7 TabHLH041基因在不同脅迫條件下的表達情況

3 結(jié)論與討論

本研究從小麥品種遼春10號中克隆到TabHLH041基因。多序列比對和進化分析結(jié)果顯示,TabHLH041蛋白序列相當保守,與近緣物種大麥同源性最高,達92%。蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域分析顯示,TabHLH041蛋白含有典型的bHLH結(jié)構(gòu)域,該bHLH結(jié)構(gòu)域具有E-box/N-box識別位點,含有形成同源或異源二聚體的二聚體界面,也含有與DNA片段結(jié)合的堿性區(qū)域,說明它可能具有調(diào)控其他基因轉(zhuǎn)錄的功能?；蚪M結(jié)構(gòu)分析表明,TabHLH041基因含有4個外顯子和3個內(nèi)含子,說明該基因在轉(zhuǎn)錄后存在剪接加工過程。

利用qRT-PCR分析TabHLH041在小麥不同光周期條件及不同逆境條件下的表達模式,結(jié)果顯示,TabHLH041在長日照和短日照條件下的表達總體上都具有晝夜節(jié)律性。在光照下其表達量總體保持下降趨勢,在黑暗中其表達量總體呈現(xiàn)上升趨勢,這與前期工作獲得的光周期表達譜結(jié)果一致。前人研究表明,與光周期途徑相關(guān)的多個關(guān)鍵基因CO、LHY、CCA1等的表達均呈現(xiàn)晝夜節(jié)律性[18-19]。目前已克隆出FBHs、PIFs等多個與光周期相關(guān)的bHLH基因[12-13]。故推測該基因可能在光周期信號轉(zhuǎn)導途徑中發(fā)揮作用。

TabHLH041對多種逆境脅迫(高鹽、干旱、ABA、低溫)均有不同程度的響應。其中,在高鹽、干旱及ABA脅迫下該基因的表達模式基本相同,均受抑制;而在低溫脅迫后其表達量呈現(xiàn)前期被誘導、后期被抑制的表達模式。這個結(jié)果暗示,TabHLH041也可能參與了逆境脅迫的信號通路。下一步將構(gòu)建TabHLH041基因植物表達載體,并對該基因在光周期及逆境脅迫中的功能做進一步分析。

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Cloning and Expression Analysis of Transcriptional Factor Gene TabHLH 041 from Wheat

GUO Chuang,WANG Xiang,CAO Yun,WANG Jingxuan,LI Lu,JIANG Yumei,YIN Jun*

(Henan Agricultural University/National Engineering Research Centre for Wheat,Zhengzhou 450002,China)

In order to lay a foundation for the study of the function of bHLH transcription factors in the development of wheat,a bHLH transcription factorTabHLH041 gene was cloned by RT-PCR method from wheat variety Liaochun No.10,and its expression pattern was analyzed.The results showed that the open reading frame ofTabHLH041 was 1 179 bp in length that encoded 392 amino acids.The TabHLH041 protein contained a bHLH domain in its C terminal.The analysis of the sequence ofTabHLH041 from genome DNA showed thatTabHLH041 gene contained four exons and three introns.Phylogenetic analysis showed that the sequence of TabHLH041 was closest toHordeumvulgarebHLH protein.Real time PCR analysis revealed that the expression ofTabHLH041 displayed the day-night rhythm,and its expression level decreased in the light while increased in the dark.The expression ofTabHLH041 was induced in the early time,and then was inhibited under the treatment of low temperature,the inhibition was very significant when treated for 24 h.The expression ofTabHLH041 was inhibited continuously under the treatment of high salt,ABA and PEG.In summary,the results suggest thatTabHLH041 may be involved in the signal transduction pathway of photoperiod and adversity stress.

wheat (Triticumaestivum);TabHLH041; cloning; expression; abiotic stress; photoperiod

2016-03-14

國家科技支撐計劃項目(2011BAD16B07，2013BAD04B01)

郭 創(chuàng)(1990-)，男，湖南婁底人，在讀碩士研究生，研究方向：小麥栽培與生物技術(shù)。 E-mail：1368614151@qq.com

*通訊作者：尹 鈞(1957-)，男，山西萬榮人，教授，博士，主要從事小麥栽培與生物技術(shù)研究。E-mail：xmzxyj@126.com

S512.1;Q943.2

A

1004-3268(2016)07-0007-07