王戊騰，胡 鵬，安得霞

（西北民族大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730030）

提取動(dòng)物組織DNA的方法比較

王戊騰，胡 鵬，安得霞

（西北民族大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730030）

傳統(tǒng)方式提取DNA大多運(yùn)用氯仿、苯酚以及異丙醇等其他相關(guān)的試劑，此提取DNA的方式純度相對(duì)而言比較低，實(shí)驗(yàn)過(guò)程非常的復(fù)雜、耗時(shí)之多，并且還有可能產(chǎn)生毒性的物質(zhì)。所以，運(yùn)用商品化的試劑盒針對(duì)DNA進(jìn)行提取，顯得更加的簡(jiǎn)潔、便利。本文首先介紹了試劑盒提取DNA方法的相關(guān)內(nèi)容，并以兩種動(dòng)物組織DNA提取方法的比較為具體的案例進(jìn)行了分析。

DNA提取試劑盒；DNA；改進(jìn)

1 引言

DNA是構(gòu)成基因最主要的部分，在某個(gè)生物群體里面往往會(huì)共同具備著兩個(gè)或者多個(gè)不持續(xù)的基因型、變異型以及等位基因等被叫做基因的多態(tài)性，其有著非常多的種類，例如：DNA序列的多態(tài)性、DNA長(zhǎng)度的多態(tài)性以及單核苷酸的多態(tài)性等。

2 試劑盒提取DNA簡(jiǎn)介

2.1 基因組DNA提取的原則

確保核酸一級(jí)架構(gòu)的整體性 (由于所有的遺傳信息都儲(chǔ)藏于核酸一級(jí)架構(gòu)里面，因此較為全面的一級(jí)架構(gòu)是確保核酸功能與結(jié)構(gòu)分析的基石)。

排除其他類型的分子(例如：多糖、蛋白質(zhì)以及脂類等)所造成的污染，使得接下來(lái)的實(shí)驗(yàn)?zāi)軌虺晒Φ赝瓿伞?/p>

2.2 動(dòng)物基因組DNA提取的方法

2.2.1 損傷性取樣材料DNA的提取

2.2.1.1 乙醇保存的動(dòng)物標(biāo)本基因組DNA提取方式用乙醇保存動(dòng)物標(biāo)本是最為常見(jiàn)、效果最好的方式。因?yàn)榇蟛糠值腄NA酶必須具備某個(gè)二價(jià)陽(yáng)離子當(dāng)做輔助的因子(例如：Ca2+、Mg2+等)，在70%的乙醇里面倒入合適數(shù)量的EDTA，EDTA能夠在較短的時(shí)間內(nèi)調(diào)控住DNA酶的活性，從而避免DNA所發(fā)生的降解。莫邦輝等人在酒精標(biāo)本DNA模板迅速提取里面并未運(yùn)用蛋白酶 K，只有在緩沖液 (0.5%SDS，10 mmol/L Tris-HCl，100 mmol/LEDTA，pH 8.0)，37℃溫浴1h之后消化相關(guān)的材料，同樣得到了比較好的擴(kuò)增效果，然而這樣的方式只能夠運(yùn)用片段比較短的PCR擴(kuò)增中去。通常而言，使用酒精標(biāo)本提取DNA的方式均會(huì)加入一定量的蛋白酶K，同時(shí)56℃的溫度之下消化8～14 h，以使得組織里面所含有的蛋白質(zhì)全部消化。

2.2.1.2 甲醛溶液保存的動(dòng)物基因組DNA提取方式在之前所進(jìn)行的探索里面針對(duì)福爾馬林標(biāo)本的DNA提取方式做出了非常大的改善，在標(biāo)本的預(yù)先處理過(guò)程中，主要有臨界點(diǎn)干燥與梯度酒精浸泡這兩種不同的形式。然而梯度酒精浸泡的方式造成乙醇和標(biāo)本里面的甲醛發(fā)生反應(yīng)形成縮醛與半縮醛等，接著經(jīng)過(guò)酒精變換被過(guò)濾出去。徐來(lái)祥等人為了避免標(biāo)本吸入較多的水分而導(dǎo)致細(xì)胞被損害，運(yùn)用PBS溶液融合乙醇溶液對(duì)樣品進(jìn)行浸泡、洗脫，同樣獲得了比較好的成果[1]。在針對(duì)DNA進(jìn)行提取的環(huán)節(jié)里面，周美玉與杜世章等人均均采取了抗氧化劑二硫蘇糖醇(DTT)，DTT可以非常好的避免甲醛氧化成甲酸，然而甲酸同樣會(huì)導(dǎo)致DNA出現(xiàn)降解，所以抗氧化劑的通入對(duì)于DNA的提取有著非常重要的意義。

2.2.2 非損傷性取樣材料DNA的提取

2.2.2.1 從毛發(fā)里面提取DNA的方式 從毛發(fā)里面獲得DNA，與其有關(guān)的報(bào)道非常之多。余艦等人在蛋白酶K的作用之下，運(yùn)用酚-氯仿反復(fù)抽提的形式便已由毛發(fā)里面獲得極少數(shù)的DNA。徐艷春與伍新堯等人采取Chelex-100處理毛發(fā)提取DNA，然而運(yùn)用這樣的方式對(duì)于毛囊細(xì)胞的裂解并不充分，所遺留的消化液對(duì)于之后所進(jìn)行的PCR實(shí)驗(yàn)有非常的負(fù)面影響[2]。之后，李軍林等人以普通的酚-氯仿提取方式為基礎(chǔ)進(jìn)行改善，以pH 8.8Tris-HCl、MgCl2溶液與蛋白酶K作為裂解液進(jìn)行消化，得到了品質(zhì)比較高的DNA[3]。

2.2.2.2 從血液樣本里面提取DNA的方式 從血液里面取得DNA最為重要的便是清除掉里面所含有的蛋白質(zhì)與紅細(xì)胞等其他物質(zhì)。通常所采取的方式為∶首先獲得淋巴細(xì)胞，接著運(yùn)用蛋白酶K、SDS進(jìn)行消化，接著采取酚氯仿抽提進(jìn)行提取、使用乙醇進(jìn)行沉淀。然而這樣的方式比較繁瑣，同時(shí)所使用的試劑對(duì)于人們的健康有著較大的影響，因此有大量的專業(yè)人士對(duì)其作出了改善。趙權(quán)等人運(yùn)用TritonX-100來(lái)對(duì)白細(xì)胞與紅細(xì)胞進(jìn)行破碎，直接獲得白細(xì)胞核，接著運(yùn)用Na-ClO4，SDS分解聚核蛋白，然而并未運(yùn)用蛋白酶K，最終運(yùn)用PCl(酚∶氯仿∶異戊醇25∶24∶1)進(jìn)行抽提，使用乙醇進(jìn)行最后的沉淀。這樣的方式能夠更加好的去除紅細(xì)胞[4]。

3 試劑盒提取DNA的步驟

3.1 開(kāi)展試驗(yàn)之前所需要注意的幾點(diǎn)

首次運(yùn)用之前需要根據(jù)試劑瓶外所貼的標(biāo)簽指示首先在漂洗液PW與緩沖液GD里面倒入適量的無(wú)水乙醇。所選取的樣品需要防止重復(fù)此能夠的冷凍與溶化，不然會(huì)造成所提取出的DNA片段相對(duì)較小，提取的數(shù)量減低。如果緩沖液GB或者GA里面有沉淀物，能夠?qū)⑵渲萌?6℃的水浴里面再次溶解，搖勻之后繼續(xù)運(yùn)用。全部的離心過(guò)程都需要運(yùn)用臺(tái)式的離心機(jī)，在室溫背景下進(jìn)行離心。

3.2 具體的操作步驟

3.2.1 處理相關(guān)的材料

3.2.1.1 如果所提取的材料是血液，能夠直接運(yùn)用200μL冷凍、新鮮或者是融入各式各樣抗凝劑的血液，如果沒(méi)有200μL能夠加入適量的緩沖液GA進(jìn)行補(bǔ)充。

3.2.1.2 若所需處理的血樣是鳥(niǎo)類、禽類以及兩棲類等其他更加低級(jí)生物的抗凝血液，他們的紅細(xì)胞是有核細(xì)胞，所以處理量在5～20μL的范疇以內(nèi)，能夠加入緩沖液GA達(dá)到200μL之后實(shí)施以下的裂解過(guò)程。

3.2.1.3 由貼壁培養(yǎng)所獲得細(xì)胞首先需要處理成細(xì)胞懸液，10 000 rpm(-11 200×g)離心1 min，去處上清，倒入200μL緩沖液GA，不停的振蕩直到完全的懸浮。

3.2.1.4 動(dòng)物組織（脾組織的用量需要低于10 mg）首先需要打碎成細(xì)胞懸液，接著放入10 000 rpm(-11 200× g)離心1 min，去處上清，倒入200μL緩沖液GA，不停的振蕩直到完全的懸浮。

3.2.2 倒入20μL的蛋白酶K溶液，搖晃均勻

3.2.2.1 在提取血液基因組的時(shí)候，僅僅需要加入蛋白酶K搖晃均勻，便能夠進(jìn)入一下道程序。

3.2.2.2 在提取細(xì)胞基因組的時(shí)候，僅僅需要加入蛋白酶K搖晃均勻，便能夠進(jìn)入一下道程序。

3.2.2.3 在提取組織基因組的時(shí)候，加入蛋白酶K搖晃均勻之后，進(jìn)行56℃水浴，直到所有的組織全部溶解，簡(jiǎn)單的離心以清除懸掛在管蓋內(nèi)部的水珠，再進(jìn)入下一道程序。

3.2.3 倒入200μL的緩沖液GB，全面顛倒使其均勻，在70℃中擱置10 min，溶液變得非常的清亮，簡(jiǎn)單的離心以清除懸掛在管蓋內(nèi)部的水珠。

3.2.4 倒入200μL的無(wú)水乙醇，全面振蕩混勻15 s，這個(gè)時(shí)候或許會(huì)形成絮狀的沉淀物，簡(jiǎn)單的離心以清除懸掛在管蓋內(nèi)部的水珠。

3.2.5 將以上所獲得的溶液與絮狀的沉淀物均融入到吸附柱CB3里面，接著再將吸附柱置入收集管里面，12 000 rpm（～13 400×g）離心30 s，過(guò)濾掉廢液，把吸附柱CB3置入收集管里面。

3.2.6 往吸附柱CB3里面倒入500μL的緩沖液GD（在運(yùn)用之前首先需要檢驗(yàn)是不是已經(jīng)倒入了無(wú)水乙醇），12 000 rpm（～13 400×g）離心30 s，過(guò)濾掉廢液，把吸附柱CB3置入收集管里面。

3.2.7 往吸附柱CB3里面倒入600μL的漂洗液PW（在運(yùn)用之前首先需要檢驗(yàn)是不是已經(jīng)倒入了無(wú)水乙醇），12 000 rpm（～13 400×g）離心30 s，過(guò)濾掉廢液，把吸附柱CB3置入收集管里面。

3.2.8 重復(fù)執(zhí)行步驟7。

3.2.9 把吸附柱CB3置入收集管里面，12 000 rpm（～13 400×g）離心2 min，過(guò)濾廢液。把吸附柱CB3放入室溫里面幾分鐘的時(shí)間，以充分晾干吸附材料里面所剩下的漂洗液。

3.2.10 把吸附柱CB3轉(zhuǎn)移到其他未使用過(guò)的離心管里面，接著往吸附膜的中間區(qū)域懸空滴入50～200 μL的洗脫緩沖液TE，室溫?cái)[放2～5 min，12 000 rpm（～13 400×g）離心2 min，將所有的溶液采集到離心管里面。

4 兩種動(dòng)物組織DNA提取方法的比較

4.1 材料與方法

4.1.1 實(shí)驗(yàn)材料

4.1.1.1 試驗(yàn)樣本 此次試驗(yàn)所運(yùn)用的豬肉組織都源自于在售的新鮮動(dòng)物，在完成樣品收集之后儲(chǔ)藏在-80℃的冰箱里面。

4.1.1.2 試驗(yàn)試劑以及相關(guān)的設(shè)備 血液/細(xì)胞/組織基因組DNA提取試劑盒（天根生化科技有限公司）；漩渦混勻器（海門市其林貝爾儀器制造有限公司）；微型離心機(jī)（杭州米歐儀器有限公司）；FA2004N電子天平（上海精密科學(xué)儀器有限公司）；SP-1900UV型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（上海光譜儀器有限公司）。

4.1.2 實(shí)驗(yàn)方法

4.1.2.1 酚-氯仿抽提 一是取50 mg豬肉組織剪碎之后置入1.5 mL的離心管里面，倒入400μL的裂解液、200μL的lSDS以及20μL的蛋白酶K，經(jīng)過(guò)56℃的水浴消化之后過(guò)夜處理；二是往里面加入相同體積的飽和酚，充分搖晃5～6 min，靜靜的擱置5 min，12 000 r/min離心10 min；三是細(xì)致的提取上清部門轉(zhuǎn)移到全新的1.5 mL的離心管里面，融入相同體積的體積比是25飽和酚∶24氯仿∶1異戊醇，充分搖晃至均勻，靜靜的擱置4～5 min，12 000 r/min離心10 min；四是細(xì)致的提取上清部門轉(zhuǎn)移到全新的1.5 mL的離心管里面，融入相同體積的體積比是24氯仿∶1異戊醇，充分搖晃至均勻，靜靜的擱置4～5 min，12 000 r/min離心10 min；五是細(xì)致的提取上清部門轉(zhuǎn)移到全新的1.5 mL的離心管里面，倒入2倍的無(wú)水乙醇，（無(wú)水乙醇需要提前擺放于-20℃的環(huán)境中冷凍5～10 min），12 000 r/min離心10 min；六是排除無(wú)水乙醇，倒入1 mL的75%乙醇，反復(fù)吹打，12 000 r/min離心10 min，此步驟需要重復(fù)1次；七是通風(fēng)、干燥5～10 min，倒入50μL的純水。

4.1.2.2 試劑盒提取 一是取50 mg豬肉組織剪碎之后置入1.5 mL的離心管里面，融入200μL的緩沖液GA，倒入20μL蛋白酶K搖晃均勻之后，進(jìn)行56℃水浴，直到所有的組織全部溶解；二是倒入200μL的緩沖液GB，全面顛倒使其均勻，在70℃中擱置10 min，溶液變得非常的清亮，簡(jiǎn)單的離心以清除懸掛在管蓋內(nèi)部的水珠；三是倒入200μL的無(wú)水乙醇，全面振蕩混勻15 s，這個(gè)時(shí)候或許會(huì)形成絮狀的沉淀物，簡(jiǎn)單的離心以清除懸掛在管蓋內(nèi)部的水珠；四是將以上所獲得的溶液與絮狀的沉淀物均融入到吸附柱CB3里面，接著再將吸附柱置入收集管里面，12 000 rpm（～13 400×g）離心30 s，過(guò)濾掉廢液，把吸附柱CB3置入收集管里面；五是往吸附柱CB3里面倒入500μL的緩沖液GD（在運(yùn)用之前首先需要檢驗(yàn)是不是已經(jīng)倒入了無(wú)水乙醇），12 000 rpm（～13 400×g）離心30 s，過(guò)濾掉廢液，把吸附柱CB3置入收集管里面；六是往吸附柱CB3里面倒入600μL的漂洗液PW（在運(yùn)用之前首先需要檢驗(yàn)是不是已經(jīng)倒入了無(wú)水乙醇），12 000rpm（～13 400×g）離心30 s，過(guò)濾掉廢液，把吸附柱CB3置入收集管里面，重復(fù)再做一次；七是把吸附柱CB3置入收集管里面，12 000 rpm（～13 400×g）離心2 min，過(guò)濾廢液。把吸附柱CB3放入室溫里面幾分鐘的時(shí)間，以充分晾干吸附材料里面所剩下的漂洗液；八是把吸附柱CB3轉(zhuǎn)移到其他未使用過(guò)的離心管里面，接著往吸附膜的中間區(qū)域懸空滴入150μL的洗脫緩沖液TE，室溫?cái)[放2～5 min，12 000 rpm（～13 400×g）離心2 min，將所有的溶液采集到離心管里面。能夠直接開(kāi)展PCR反應(yīng)。

4.1.3 DNA濃度與純度的檢測(cè)

運(yùn)用核酸蛋白定量?jī)x檢測(cè)DNA樣品的OD260、OD280吸光度具體數(shù)值同時(shí)測(cè)定DNA的濃度與純度（如表1所示）。

4.1.4 PCR擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)

表1 兩種DNA提取方法的濃度及純度

豬cytb基因引物所設(shè)計(jì)的序列為：上游5′CACGACCAATGACATGAAAAATC3′，下游5′GCTGCGAGGGCGGTAAT3′。PCR的反應(yīng)過(guò)程如下：PCR反應(yīng)總體系是50μL，PCR反應(yīng)組成成分主要有以下幾種：其間 10×Buffer 5μL，10 mmol/LdNTP 4μL, 12.5μmol/L上下游的引物均為1.5μL，ExTagDNA聚合酶2U，倒入超純水直到50μL。PCR所必備的反應(yīng)條件如下：94℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸1 min，一共有35個(gè)重復(fù)過(guò)程，最終72℃延伸10 min，溫度降調(diào)4℃儲(chǔ)藏。御用酚-氯仿抽提的方式所獲得的DNA置入4℃的溫度中儲(chǔ)藏3～5 d之后，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。采取試劑盒所獲得的DNA能夠直接進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

4.1.5 瓊脂糖電泳檢測(cè)

4.1.5.1 基因組DNA的檢測(cè) 運(yùn)用1%的瓊脂糖電泳檢查兩種方式所提取出的DNA，見(jiàn)圖1。

圖1 兩種方法提取的基因組DNA電泳結(jié)果比較

4.1.5.2 PCR擴(kuò)增的檢測(cè) 運(yùn)用1%的瓊脂糖電泳檢查擴(kuò)增的結(jié)果，見(jiàn)圖2。

4.2 結(jié)果

4.2.1 DNA純度、濃度的測(cè)定結(jié)果 從以上兩種方式所測(cè)得的DNA純度層面來(lái)看，酚-氯仿抽提是1.58±0.18，試劑盒提取法是1.74±0.15，兩者之間的差距非常明顯（P＜0.05），試劑盒所提取出的DNA純度更加接近于1.8。從DNA的濃度層面來(lái)看：酚-氯仿抽提法時(shí)120±25μg/mL，試劑盒提取法是112±11μg/mL，兩者之間沒(méi)有太大的差距。

圖2 兩種方法的cytb基因PCR擴(kuò)增

4.2.2 DNA瓊脂糖電泳結(jié)果 瓊脂電泳檢測(cè)DNA帶型相對(duì)比較聚集、整齊（如圖1所示），表明以上兩種方式所提取獲得的基因組DNA都是非常全面的、無(wú)降解的。

4.2.3 PCR擴(kuò)增后結(jié)果 圖2所代表的是cytb基因經(jīng)過(guò)PCR擴(kuò)增之后的效果，此兩種不同的方式所提取得到的基因組DNA均能夠當(dāng)作PCR擴(kuò)增所需的模板，同時(shí)均有著非常好的擴(kuò)增成效。

5 結(jié)論

使用試劑盒進(jìn)行提取非常的迅速、便利，相同樣品的操作與比酚-氯仿抽提相比少用了非常少的時(shí)間。使用試劑盒進(jìn)行提取防止運(yùn)用含有毒性的氯仿與苯酚等其他相關(guān)的試劑，避免了具體操作環(huán)節(jié)里面對(duì)于工作人員自身的健康造成傷害。使用試劑盒所提出的DNA產(chǎn)量相對(duì)較高，純度較好，能夠直接運(yùn)用于PCR與其他的酶切試驗(yàn)中去。

因?yàn)樵噭┖刑崛〉姆绞竭\(yùn)用了離心柱，防止了多次重復(fù)性的換管，節(jié)約了大量的資源，離心的時(shí)間較少，離心只需要在室溫下就能夠完成，避免對(duì)離心機(jī)造成損害，同時(shí)采取試劑盒進(jìn)行提取是綠色無(wú)污染的。試劑盒提取具備較強(qiáng)的重復(fù)性、平穩(wěn)的結(jié)果以及較高的成功率等優(yōu)點(diǎn)，減少了提取所需要的費(fèi)用，比較適合用于大量DNA的提取。

[1]徐來(lái)祥,張知彬,宋銘晶,等.福爾馬林保存的動(dòng)物標(biāo)本基因組DNA的提取方法[J].動(dòng)物學(xué)報(bào)(Current Zoology), 2002,48(2)∶264-269.

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（編輯：趙鵬飛）

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1006-799X(2016)23-0087-04

王戊騰（1992-），女，河北保定人，本科，研究方向?yàn)榉肿由飳W(xué)。