魏洪祥，駱小年，徐忠源，王新榮

（1.遼寧省淡水水產(chǎn)科學(xué)研究院，遼寧 遼陽 111000；2.遼寧省新賓縣紅升水庫管理所，遼寧 撫順 113202；3.遼寧省新賓滿族自治縣水產(chǎn)技術(shù)推廣站，遼寧 撫順 113202）

北方須鰍性腺發(fā)育的組織學(xué)觀察

魏洪祥1，駱小年1，徐忠源2，王新榮3

（1.遼寧省淡水水產(chǎn)科學(xué)研究院，遼寧 遼陽 111000；2.遼寧省新賓縣紅升水庫管理所，遼寧 撫順 113202；3.遼寧省新賓滿族自治縣水產(chǎn)技術(shù)推廣站，遼寧 撫順 113202）

采用組織學(xué)方法觀察遼寧太子河上游體長5～11cm的北方須鰍Barbatula nuda性腺發(fā)育的組織形態(tài)結(jié)構(gòu)。結(jié)果表明：北方須鰍的精巢屬于小葉形，分為6個發(fā)育期，精子的發(fā)生分為5個時相：精原細胞、初級精母細胞、次級精母細胞、精子細胞和成熟精子；卵巢發(fā)育分為6個時期，卵子的形成分為5個時相：卵原細胞、初級卵母細胞前期、初級卵母細胞后期、次級卵母細胞、成熟卵子。夏季水溫較高時，北方須鰍迅速積累營養(yǎng)物質(zhì)，精巢當年秋冬季節(jié)達到Ⅳ期，次年三、四月即可繁殖，較非冷水性魚類提前1～2個月。

北方須鰍；性腺；組織學(xué)

北方須鰍Barbatula nuda隸屬鯉形目Cypriniformes鰍科Cobitidae須鰍屬Barbatula，主要分布于俄羅斯鄂畢河以東的西伯利亞地區(qū)和遠東地區(qū)，日本、朝鮮以及我國的西北、東北等地區(qū)也有分布[1,2]；它生活在水質(zhì)清澈、溫度低、溶氧充足的水體中，常隱藏在河流的砂石下面，不集群，為小型喜冷水性魚類[3,4]；在天然水域，主要以甲殼動物、昆蟲及附生藻類為食。北方須鰍肉質(zhì)細嫩，味道鮮美，深受人們喜食，自然資源量越來越少。有學(xué)者研究了北方須鰍的外部形態(tài)、生物學(xué)[5-7]及分類[8]等，但對北方須鰍性腺發(fā)育的研究卻鮮見報道。本文通過研究北方須鰍性腺發(fā)育的組織學(xué)周年變化，旨在為北方須鰍的繁殖生物學(xué)提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 材料

2014年7月～2015年7月，在太子河上游的遼寧省新賓滿族自治縣平頂山鎮(zhèn)采集160尾北方須鰍，體長5～11cm，體質(zhì)量1.86～36.7g。

1.2 方法

挑取體長由大到小的魚體樣本，解剖摘取性腺，分前、中、后取長約5mm的組織用Bouin′s液固定，用梯度濃度的酒精脫水處理，再用Leica EG 1150型石蠟包埋機包埋，然后用Reichert-Jung 820旋轉(zhuǎn)切片機切片。切片厚5～7μm，經(jīng)蘇木精-曙紅（HE）染色后，在Leica DM750光學(xué)顯微鏡下觀察、測量及拍攝。按照參考文獻[9-11]的描述，對性腺進行分期。

2 結(jié)果與分析

2.1 精巢發(fā)育的外形分期

精巢成對，位于腹腔內(nèi)消化道背面，緊貼于腎臟上。不同發(fā)育階段的精巢形狀、色澤等外部特征不同，以此分為6個發(fā)育時期：I期，精巢細長線形，淡粉色，緊貼于腹腔壁上，僅從外部特征肉眼無法分辨雌雄；Ⅱ期，精巢細長帶狀，淡粉色半透明，血管不明顯，肉眼可以分辨出雌雄；Ⅲ期，精巢加厚，呈圓錐狀，淡黃色，可見血管分布；Ⅳ期，精巢明顯變厚，呈細棒狀，乳白色，有明顯的血管分布；V期，精巢外形已經(jīng)成熟，形狀與Ⅳ期相近，也呈細棒狀，乳白色，質(zhì)地柔軟，輕輕用手按壓腹部，可見有乳白色精液從生殖孔流出；Ⅵ期，精液已大量排出，精巢體積大幅萎縮而松弛，乳白色帶紅，布滿微血管。

2.2 精子發(fā)生的組織學(xué)觀察

北方須鰍的精巢是小葉型組織結(jié)構(gòu)，小葉外層包埋于結(jié)締組織和生殖上皮中。小葉間質(zhì)由成纖維細胞、微血管和間質(zhì)細胞等構(gòu)成，把小葉分開。北方須鰍的精子發(fā)生主要經(jīng)歷精原細胞、初級精母細胞、次級精母細胞、精子細胞、成熟精子五個時相。

2.2.1 精原細胞時相

I期精巢由初級和次級精原細胞構(gòu)成。初級精原細胞數(shù)量不多，但體積較次級精原細胞大，核仁更加明顯且大，經(jīng)多次有絲分裂后形成大量次級精原細胞。次級精原細胞體積較初級精原細胞稍小，核膜不明顯，核質(zhì)呈點狀分布（圖版I-1）。

2.2.2 初級精母細胞時相

Ⅱ期精巢主要由初級精母細胞構(gòu)成。初級精母細胞由次級精原細胞分裂而來，形狀與次級精母細胞相似但體積略有增大。核內(nèi)染色質(zhì)呈線型，準備下一次成熟分裂。組織學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，小葉仍緊密排列在一起，但是精小葉間出現(xiàn)了小葉腔，數(shù)目較少。HE染色后觀察發(fā)現(xiàn)，初級精母細胞核仁和核膜被染成深藍色，而胞質(zhì)染成淡紅色。

精巢初次發(fā)育到Ⅱ期的形態(tài)與繁殖后再發(fā)育至Ⅱ期的精巢有明顯的區(qū)別：前者精巢內(nèi)小葉腔體積較小，含有較多的初級精母細胞，腔內(nèi)沒有退化的精子或精子細胞；后者精巢內(nèi)小葉腔體積較大，初級精母細胞的數(shù)量較少，腔內(nèi)有大量退化的精子或精子細胞（圖版I-2）。

2.2.3 次級精母細胞時相

Ⅲ期精巢由少量的初級精母細胞和大量的次級精母細胞共同組成。此時的次級精母細胞由初級精母細胞經(jīng)過減數(shù)分裂而來，染色體的數(shù)目減少一半。小葉腔中還有少量的精子。次級精母細胞具有較強的嗜堿性。小葉腔數(shù)目明顯增多，體積明顯增大（圖版I-3）。

2.2.4 精子細胞形成時相

Ⅳ期精巢主要由精子細胞組成。次級精母細胞經(jīng)有絲分裂產(chǎn)生兩個體積更小的精子細胞，精子細胞的體積比次級精母細胞小很多，細胞器逐漸消失。小葉腔內(nèi)仍存少量的精子，小葉腔體積進一步擴大，相鄰的小葉腔之間開始融匯貫通并形成通道（圖版I-4）。

2.2.5 精子成熟時相

V期精巢內(nèi)主要是經(jīng)一系列復(fù)雜發(fā)育過程變化而來的成熟精子。此時相的精小葉間沒有界限，精子通道完全形成。發(fā)育成熟的精子溢出流至小葉腔，小葉腔內(nèi)充滿成熟的漩渦狀精子流。精子頭部呈圓顆粒狀，嗜堿性較強，HE染色呈深藍色。尾部細長狀，HE染色呈淺藍色。小葉間隙呈淡紅色（圖版I-5、圖版I-6）。

2.3 卵巢發(fā)育的外形分期

北方須鰍的卵巢為1個，位于消化道的背面，緊貼腎臟。根據(jù)形狀和外部特征，將卵巢的發(fā)育分為5個時期：I期，緊貼在腹膜上，細線狀，半透明，肉眼不能分辨雌雄，看不到卵巢內(nèi)的血管；Ⅱ期，卵巢扁帶狀，半透明，表面血管不明顯，中間略厚兩端變窄；Ⅲ期，卵巢體積明顯擴大，扁平囊狀，寬度和厚度顯著增加，可見卵粒，血管分布明顯；Ⅳ期，卵巢體積進一步擴大，呈梭狀，表面血管粗且明顯，布滿整個卵巢表面，卵巢膜明顯增厚，卵粒明顯但不易分開；V期，卵巢飽滿但體積沒有增大，輕壓腹部，卵粒即從生殖孔流出；Ⅵ期，卵巢中卵子大部分產(chǎn)出，體積明顯縮小，卵巢松弛，表面充血。

2.4 卵子發(fā)生的組織學(xué)觀察

根據(jù)卵子產(chǎn)生過程中卵巢組織變化、細胞體積、卵黃物質(zhì)的產(chǎn)生過程等特征，將北方須鰍卵子發(fā)生分為5個時相。

2.4.1 第Ⅰ時相

系卵原細胞向初級卵母細胞的過渡時期。卵巢內(nèi)主要由位于生殖上皮的卵原細胞或由卵原細胞向初級卵母細胞過渡的細胞組成。細胞體積最小，細胞質(zhì)少，細胞核大，核質(zhì)比大。

2.4.2 第Ⅱ時相

系初級卵母細胞的小生長期。卵母細胞的體積比卵原細胞大得多，隨著發(fā)育，卵母細胞間體積相差較大。卵母細胞形狀不規(guī)則，多圓形。細胞核嗜酸性，HE染色為淺粉色。細胞質(zhì)嗜堿性，HE染色呈藍紫色。核仁開始為單個，緊貼核膜，隨著細胞發(fā)育，數(shù)目逐漸增多，大小不一。卵母細胞之間有卵原細胞分布。出現(xiàn)濾泡細胞（圖版I-7）。

2.4.3 第Ⅲ時相

系初級卵母細胞的大生長期。卵母細胞體積進一步增大，細胞質(zhì)嗜堿性減弱，HE染色由原來的藍紫色變?yōu)闇\藍色；早期胞質(zhì)邊緣開始出現(xiàn)卵黃泡，中期卵黃泡逐漸由單層變?yōu)槎鄬?，卵黃泡內(nèi)開始積累卵黃顆粒，后期隨著細胞發(fā)育，卵黃泡和卵黃顆粒數(shù)目增多；細胞外出現(xiàn)放射帶。濾泡細胞單層，扁平狀（圖版I-8、圖版I-9、圖版I-10）。

2.4.4 第Ⅳ時相

隨著發(fā)育，卵母細胞的體積增大至最終大小。大部分細胞為圓形或橢圓形，營養(yǎng)物質(zhì)的積累終止，卵黃顆粒布滿卵母細胞，卵黃顆粒嗜酸性，經(jīng)HE染色呈粉紅色。細胞核向動物極偏移。大部分未積累卵黃物質(zhì)的卵黃泡被擠至卵膜內(nèi)緣，放射帶增厚至最大。濾泡層由兩層細胞組成，厚度大幅度增加，內(nèi)層厚度與放射帶相同，由單層柱狀細胞緊密排列，外層由單層扁平細胞組成（圖版I-11）。

2.4.5 第V時相

由卵母細胞經(jīng)過成熟分裂向次級卵母細胞過渡的階段。卵母細胞充滿開始融合的卵黃顆粒，移到動物極；細胞核的核膜完全消失并進入第一次成熟分裂，排出第一極體，繼而進入第二次成熟分裂期。放射帶明顯。卵粒從放射膜同濾泡層之間脫離并落入卵巢腔中，即排卵（圖版I-12）。

3 討論

3.1 北方須鰍精巢及精子發(fā)育的特點

根據(jù)Nagahama[12]和Billard[13]對硬骨魚類精巢類型的劃分方法，北方須鰍精巢和其他理科魚類一樣也為小葉型（lobular type），進入生殖季節(jié)時，相鄰精小葉的壁逐漸破裂，精子外泄，充滿小葉腔，小葉腔之間互相連通構(gòu)成精子向外流出的通道，最靠近輸出管的小葉腔向輸出管開口，成熟精子就由此進入輸出管。

魚類的性腺發(fā)育成熟及繁殖活動受體內(nèi)生理調(diào)節(jié)和外部營養(yǎng)、光照和水溫等環(huán)境條件影響[14]。北方須鰍樣本采集點地處太子河上游的山間溪流中，水質(zhì)清冷、溶氧充足，其性腺發(fā)育與一般非冷水性養(yǎng)殖魚類的性腺發(fā)育不同。北方須鰍精巢的發(fā)育與卵巢一樣，在夏季水溫較高時迅速積累營養(yǎng)物質(zhì)并發(fā)育，精巢發(fā)育到當年的秋冬季節(jié)就已達到Ⅳ期，次年三月或四月繁殖，較非冷水性養(yǎng)殖魚類的繁殖季節(jié)提前1～2個月[15,16]。

3.2 北方須鰍卵巢及卵子發(fā)育的特點

魚類的產(chǎn)卵類型分為一次性產(chǎn)卵、分批產(chǎn)卵及連續(xù)產(chǎn)卵等三種類型[17]。一般認為，鯉Cyprinus carpio、鯽Carassius auratus屬非同步，一年可產(chǎn)卵二或三次；而鰱Hypophthalmichthys molitrix、鳙Aristichthys nobilis、草魚Ctenopharyngodon idellus、青魚Mylopharyngodon piceus屬同步，一年產(chǎn)卵一次；尼羅羅非魚Tilapia nilotica和短蓋巨脂鯉Piaractus brachypomus屬典型的分批非同步，一年產(chǎn)卵數(shù)次[18]。北方須鰍卵巢的組織切片觀察表明，在V期卵巢中的卵母細胞絕大部分都處于第V時相，其周圍僅有極少量處于第Ⅱ時相的卵母細胞，說明北方須鰍屬一次性產(chǎn)卵魚類。影響魚類性腺發(fā)育的綜合因素包括營養(yǎng)、溫度、鹽度、光照、水流，及溶氧等[18]。本研究中，2014年10月所采集到的北方須鰍樣本中大部分卵巢已達Ⅳ期，卵巢發(fā)育飽滿，這和大部分非冷水性養(yǎng)殖魚類五月發(fā)育到Ⅳ期不同。青魚、草魚、鰱、鳙等鯉科養(yǎng)殖魚類在秋冬季性腺處于Ⅱ期或Ⅲ期，正在進行營養(yǎng)的積累，22～28℃為其性腺發(fā)育和成熟的適宜水溫，水溫低于18℃性腺發(fā)育速度緩慢，往往停止在第Ⅲ期或第Ⅳ期初而不向第Ⅳ期末過度。這是因為北方須鰍屬溪流冷水性魚類，繁殖期在三月底至四月中旬，較一般魚類提早2個月以上，因此不需要多久卵巢就發(fā)育到V期，即可完成成熟產(chǎn)卵過程。

北方須鰍第Ⅰ時相和第Ⅱ時相的卵母細胞與其他硬骨魚類卵母細胞沒有區(qū)別，第Ⅲ時相時，在靠近細胞膜的細胞質(zhì)周圍出現(xiàn)卵黃泡，卵膜的內(nèi)周和核周開始出現(xiàn)卵黃顆粒，細胞外的放射膜和濾泡膜逐漸增厚。卵母細胞在第Ⅳ時相早期胞質(zhì)中不斷出現(xiàn)大量的卵黃顆粒，伴隨著卵母細胞的不斷發(fā)育，后期的卵母細胞充滿卵黃顆粒。當卵母細胞發(fā)育至第V時相時，細胞核開始出現(xiàn)極化，細胞核移到動物極，核膜溶解，核質(zhì)與細胞質(zhì)混合在一起，此時細胞也完全脫離了濾泡膜。未成熟或未產(chǎn)出的卵母細胞最后退化被吸收[19-21]。

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Observation of Gonadal Development of Loach Barbatula nuda

WEI Hong-xiang1,LUO Xiao-nian1,XU Zhong-yuan2,WANG Xin-rong3
（1.Freshwater Fisheries Research Academy of Laoning Province,Liaoyang 111000,China; 2.Hong Sheng Reservoir Administration in Xinbin County,Liaoning Province,Fushun 113202,China; 3.Fisheries Technology Extension Station of Xinbin Manchu Autonomous County,Liaoning Province,Fushun 113202,China）

Histological observation of gonadal development was conducted in loach Barbatula nuda with body length of 5～11 cm collected in the upper reaches of Taizi River in Liaoning province by a histological method.The results showed that the loach had lobular testes whose development divided into 6 stages,and 5 subphases of spermatogenesis including spermatogonia,primary spermatocyte, secondary spermatoeyte,spermatid,and spermatozoon.The ovary development was divided into 6 stages and the oocyte development was divided into 5 stages including oogonium,earlier primary oocyte,later primary oocyte,secondary oocyte,and ovum.Loach began to rapidly accumulate of nutrients at high temperature in summer,and had testis with stageⅣin autumn and winter and spawned in the next March and April,1～2 months earlier than non-coldwater fishes.

Barbatula nuda;gonad;histology

圖版I北方須鰍的性腺發(fā)育Plate I The gonadal development of loach Barbatula nuda

S917.4

A

1005-3832（2016）05-0007-05

2016-04-19

遼寧省農(nóng)業(yè)科技攻關(guān)項目（2015103049）；遼寧省自然科學(xué)基金項目（2014020181）；遼寧省海洋與漁業(yè)廳項目.

魏洪祥（1983-），男，碩士，工程師，從事漁業(yè)水域生態(tài)研究.E-mail:weihongxiang2003@163.com

駱小年，博士，研究員.E-mail:luo2989_cn@sina.com