胡雪松，葛彥龍，李池陶，王世會(huì)，賈智英，張秋軍，石連玉

（中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黑龍江水產(chǎn)研究所淡水魚類育種國(guó)家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150070）

利用微衛(wèi)星標(biāo)記高效鑒定松浦鏡鯉的親緣關(guān)系

胡雪松，葛彥龍，李池陶，王世會(huì)，賈智英，張秋軍，石連玉

（中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黑龍江水產(chǎn)研究所淡水魚類育種國(guó)家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150070）

用37尾雌和14尾雄松浦鏡鯉Cyprinus carpio Songpu構(gòu)建37個(gè)血統(tǒng)明確的全同胞家系，同池、同條件養(yǎng)殖。用篩選出的9個(gè)多態(tài)性微衛(wèi)星標(biāo)記和建立的多重PCR檢測(cè)方法進(jìn)行子代群體（1 318尾）的親權(quán)鑒定。9個(gè)位點(diǎn)共檢測(cè)到53個(gè)等位基因，各位點(diǎn)均為高度多態(tài)（PIC＞0.5），平均期望雜合度為0.742，觀測(cè)雜合度為0.755。親本基因型信息的模擬分析顯示，利用9個(gè)標(biāo)記將子代分配到親本對(duì)的成功率可達(dá)100%。實(shí)際鑒定結(jié)果：1 287尾個(gè)體準(zhǔn)確鑒定到配組的親本對(duì)，鑒定成功率為97.6%。以上結(jié)果表明：本研究提供的標(biāo)記和檢測(cè)方法可用于松浦鏡鯉的親本遺傳距離分析和家系親緣追溯，也適用于群體遺傳多樣性監(jiān)測(cè)。

松浦鏡鯉；微衛(wèi)星；家系；親緣關(guān)系

微衛(wèi)星標(biāo)記在基因組中廣泛分布，具有豐富的多態(tài)性且按孟德爾方式共顯性遺傳，比傳統(tǒng)的同工酶或其他標(biāo)記更能反映近緣個(gè)體間的遺傳差異[1-3]，已成為水產(chǎn)動(dòng)物遺傳學(xué)相關(guān)研究中應(yīng)用最廣泛的分子標(biāo)記[4-6]，其應(yīng)用范圍包括群體遺傳結(jié)構(gòu)分析[7-9]、基因圖譜構(gòu)建[10-14]及親緣關(guān)系鑒定等[15-17]。

魚類特殊的生活環(huán)境和繁殖方式容易發(fā)生系譜混亂，導(dǎo)致優(yōu)良生產(chǎn)性狀或適應(yīng)性逐代下降。鑒定親本的親緣關(guān)系可提供配組依據(jù)，降低近交幾率。和畜禽等養(yǎng)殖動(dòng)物相比，魚類出生時(shí)個(gè)體較小，難以利用物理標(biāo)記進(jìn)行早期個(gè)體區(qū)分。在家系選育或遺傳參數(shù)評(píng)估時(shí)，為剔除環(huán)境因素的非遺傳性效應(yīng)，很多研究將不同家系來(lái)源的受精卵混合孵化，或?qū)⒊醴踝恤~在相同條件下混合養(yǎng)殖，再利用微衛(wèi)星標(biāo)記鑒定家系來(lái)源[18-20]。鑒定親緣關(guān)系的前提是需要有足夠多的多態(tài)性豐富的微衛(wèi)星標(biāo)記位點(diǎn)。為使外形和目標(biāo)性狀趨于穩(wěn)定，魚類新品種培育須經(jīng)多世代的高強(qiáng)度選擇，等位基因可能會(huì)較大程度地丟失。在此情況下，屬間甚至種間的微衛(wèi)星引物會(huì)失去通用性，因此篩選特定品種的分子標(biāo)記十分必要。

松浦鏡鯉是黑龍江水產(chǎn)研究所于2008年在德國(guó)鏡鯉選育系（F4）的基礎(chǔ)上培育出的鯉新品種，是水產(chǎn)原良種委員會(huì)的登記品種（GS01-001-2008）。該品種鱗少易加工，其生長(zhǎng)速度和出肉率遠(yuǎn)高于其他鯉品種，且目前已被推廣到全國(guó)20多個(gè)省市養(yǎng)殖，帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)效益。然而，目前尚未開發(fā)出適合松浦鏡鯉親緣關(guān)系鑒定的分子標(biāo)記。本研究通過(guò)構(gòu)建已知親本對(duì)的松浦鏡鯉家系，從中篩選出9個(gè)高度多態(tài)微衛(wèi)星位點(diǎn)，建立各位點(diǎn)基因型的快速檢測(cè)方法用于親緣關(guān)系鑒定，旨在為指導(dǎo)該品種親魚的科學(xué)配組或輔助制定家系選育計(jì)劃提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 家系構(gòu)建

實(shí)驗(yàn)用松浦鏡鯉（SJ）來(lái)自黑龍江水產(chǎn)研究所呼蘭實(shí)驗(yàn)中心。于2013年，挑選健康雄性親魚14尾和雌性37尾，以不平衡的巢氏交配的方法配組，每尾雄魚與2、3尾雌魚交配，利用人工授精建立37個(gè)全同胞家系。配組時(shí)收集親魚鰭條樣本，將帶有不同組合編號(hào)的受精卵單獨(dú)孵化。孵化后的子代個(gè)體始終同池、同條件養(yǎng)殖，生長(zhǎng)至60d時(shí)，采集所有子代個(gè)體（1 318尾）的鰭條用于親緣關(guān)系鑒定。

1.2 DNA提取

采用酚氯仿法提取所有親本和子代樣本鰭條基因組DNA，利用瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)檢測(cè)DNA質(zhì)量和濃度。DNA原液稀釋至200ng/μL，置 -20℃保存，DNA工作液稀釋至50ng/μL，置4℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3 引物篩選和PCR擴(kuò)增

實(shí)驗(yàn)選用部分在德國(guó)鏡鯉選育系F4（JL）中擴(kuò)增效果較高的MFW系列引物（MFW1、MFW5、MFW7、MFW11），參考Crooijmans等[21]報(bào)道的序列合成。另外9對(duì)引物均來(lái)自本實(shí)驗(yàn)室開發(fā)的HLJ系列，篩選自鯉新一代連鎖圖譜[10]，相關(guān)信息見表1。PCR擴(kuò)增體系共20μL，包括ddH2O 13.7μL、10× PCR buffer 2μL、1.5mM MgCl21.6μL、10mM dNTPs 2μL、10μM上下游引物各0.6μL、5U/μL Taq DNA聚合酶0.08μL，及50ng/μLDNA模板1μL。PCR反應(yīng)條件為：94℃變性4min；94℃變性15s，58℃退火15s，72℃延伸30s，循環(huán)30次；72℃延伸5min，4℃保溫。利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增效果，10%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離。利用銀染法顯帶并拍照，用Gel-pro analyzer軟件確定等位基因大小。進(jìn)一步進(jìn)行4個(gè)多重PCR反應(yīng)，分別包含以下引 物 組 合 ：1（HLJ1115、HLJ3656、HLJ3526）、2（HLJ3473、HLJ3850）、3（HLJ3857、HLJ3993）、4（HLJ3 938、HLJ3948），PCR反應(yīng)體系均為20μL，體系僅ddH2O作相應(yīng)改變，其余各成分體積均與單引物PCR反應(yīng)相同。反應(yīng)退火溫度分別為55℃、57℃、55℃和58℃，其他反應(yīng)條件及PCR產(chǎn)物的聚丙烯酰胺電泳檢測(cè)和顯帶方法與單引物PCR反應(yīng)相同。將基因型數(shù)據(jù)整理成0、1矩陣。

表1 松浦鏡鯉家系鑒定的微衛(wèi)星標(biāo)記引物信息Tab.1 Microsatellite primers information on family identification of Songpu mirror carp

1.4 遺傳參數(shù)統(tǒng)計(jì)和家系分配計(jì)算

利用實(shí)驗(yàn)室自編軟件將包含親本和子代的0、1矩陣基因型文件轉(zhuǎn)換成Genepop格式文件。利用Cervus3.0軟件統(tǒng)計(jì)等位基因數(shù)，計(jì)算多態(tài)信息含量、期望雜合度和觀測(cè)雜合度等遺傳參數(shù)。基于親本的基因頻率，運(yùn)行模擬分析模塊（已知親本性別父母對(duì)）分析，置信概率為95%，子代樣本數(shù)為1 500，候選父本為14，母本為37。同時(shí)基于各家系（子代）群體的基因頻率，計(jì)算累積排除率，綜合判斷各位點(diǎn)的鑒定能力。最后利用家系分析模塊（已知親本性別父母對(duì)）計(jì)算出候選父母的LOD值，LOD值越大代表可信度越高，如將子代個(gè)體分配到組建的家系視為鑒定成功。

1.5 遺傳距離分析

利用PopGen32軟件計(jì)算家系（子代）間各組合及各家系親本組合間的Nei氏遺傳距離。

2 結(jié)果與分析

2.1 微衛(wèi)星引物擴(kuò)增效果檢測(cè)

選擇在JL擴(kuò)增效果理想的MFW系列引物擴(kuò)增SJ DNA樣本進(jìn)行擴(kuò)增，效果不理想。不同微衛(wèi)星位點(diǎn)在JL中表現(xiàn)為高度多態(tài)[22]，但在本次SJ中檢測(cè)到的等位基因數(shù)和基因型均較少（表2），未在后續(xù)研究中應(yīng)用。

表2 MFW系列引物在JL和SJ中擴(kuò)增的等位基因數(shù)比較Tab.2 Comparison of allele number（Na）amplified in JL and SJ by primers from the MFW series

已篩選出的9對(duì)HLJ系列引物擴(kuò)增SJ DNA樣本，各位點(diǎn)擴(kuò)增和分型效果均較理想，適合SJ家系鑒定。各位點(diǎn)的聚丙烯酰胺檢測(cè)結(jié)果見圖1。不同位點(diǎn)組合后，其多重PCR產(chǎn)物的聚丙烯酰胺檢測(cè)結(jié)果見圖2。

圖1 松浦鏡鯉在9個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的聚丙烯酰胺凝膠電泳圖譜Fig.1 The polyacrylamide gel electrophoresis results at 9 microsatellite loci in Songpu mirror carp

圖2 松浦鏡鯉在9個(gè)位點(diǎn)的多重PRC擴(kuò)增產(chǎn)物聚丙烯酰胺凝膠電泳圖譜Fig.2 The polyacrylamide gel electrophoresis results of multiple PCR at 9 microsatellite loci in Songpu mirror carp

2.2 遺傳變異參數(shù)和家系鑒定

9個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)共檢測(cè)到53個(gè)等位基因，平均每個(gè)位點(diǎn)為5.89個(gè)。平均期望雜合度和觀測(cè)雜合度分別為0.742和0.755，所有位點(diǎn)均為高度多態(tài)（PIC＞0.5）（表3）。模擬分析顯示，利用9個(gè)位點(diǎn)將任意已知基因型的子代樣本鑒定到父本的概率為82%，而鑒定到母本的概率僅為40%，鑒定到父母對(duì)的概率為100%（圖3）。利用各位點(diǎn)的基因頻率計(jì)算累積排除率，隨位點(diǎn)數(shù)目的增加，累積排除率增大（圖4）。在父母基因型未知的情況下，9個(gè)位點(diǎn)的累積排除概率為0.99046；在已知一個(gè)親本基因型時(shí)，累積排除另一個(gè)親本的概率為0.99948；累積排除親本對(duì)的概率為0.99997。對(duì)同一家系的隨機(jī)個(gè)體而言，累積排除概率為0.99754。在1 318尾個(gè)體中，有31尾鑒定到多個(gè)親本對(duì)，其余1 287尾個(gè)體準(zhǔn)確鑒定到36個(gè)家系，鑒定率為97.6%。

表3 9個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記在松浦鏡鯉家系中的遺傳參數(shù)分析Tab.3 Genetic parameters analysis of families in Songpu mirror carp by 9 microsatellite markers

圖3 利用9個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)預(yù)測(cè)松浦鏡鯉母本、父本和親本對(duì)的成功率Fig.3 Predicted assignment success rate of Songpu mirror carp for mother alone,father alone and parent pair using nine microsatellite loci

圖4 基于基因頻率計(jì)算微衛(wèi)星位點(diǎn)數(shù)與累積排除概率之間的關(guān)系Fig.4 Relationship between number of microsatellite loci and combined exclusion probability based on gene frequency

2.3 遺傳距離

遺傳距離計(jì)算結(jié)果顯示，各家系親本間的遺傳距離范圍為0.285～0.762（圖5），而各家系（子代）間組合的遺傳距離范圍很小，平均僅為0.029，最大為0.133（圖6）。

圖5 各家系親本間的遺傳距離Fig.5 Genetic distances between parents of each family

圖6 各家系（子代）間遺傳距離Fig.6 Genetic distances between each family（offspring）

3 討論

經(jīng)過(guò)多代強(qiáng)化選育后，松浦鏡鯉表型（體型、鱗被）特征的遺傳一致性較選育前更高。多個(gè)在德國(guó)鏡鯉選育系（F4）或其他鯉品種中具有豐富多態(tài)性的微衛(wèi)星座位在松浦鏡鯉中已純合或多態(tài)性較低，不宜于在家系鑒定中應(yīng)用。這充分表明該品種選擇強(qiáng)度較高，其基因庫(kù)整體遺傳多樣性下降。本研究獲得9個(gè)具有高度多態(tài)性的微衛(wèi)星位點(diǎn)，平均等位基因數(shù)為4～7個(gè)，遠(yuǎn)低于在3個(gè)德國(guó)鏡鯉選育系（F4）群體中檢測(cè)到的結(jié)果（14.4個(gè)）。相比較而言，雖然檢測(cè)位點(diǎn)的平均雜合度較高，但不代表群體有相應(yīng)的多樣性水平。

在利用分子標(biāo)記鑒定親緣關(guān)系前，需先進(jìn)行模擬分析，初步確定標(biāo)記的檢測(cè)效率和合理的標(biāo)記數(shù)目。當(dāng)鑒定的家系較多或親本基因型信息不清時(shí)，應(yīng)有足夠多的標(biāo)記才能準(zhǔn)確區(qū)分親本來(lái)源。模擬分析顯示，利用7個(gè)高度多態(tài)標(biāo)記（PIC＞0.7）將斑節(jié)對(duì)蝦Penaeus monodon的子代準(zhǔn)確匹配到30個(gè)家系的成功率低于80%；當(dāng)設(shè)定為13個(gè)家系時(shí)，能正確匹配的比率達(dá)到96%[23]。該結(jié)果與本研究相似，當(dāng)松浦鏡鯉設(shè)定為36個(gè)家系時(shí)，利用7個(gè)標(biāo)記成功鑒定父母對(duì)的比率為76%，而當(dāng)標(biāo)記數(shù)增加到9個(gè)時(shí)，成功率達(dá)到100%。進(jìn)一步利用基因頻率計(jì)算累積排除率，在親本性別已知時(shí)，9個(gè)標(biāo)記的累積排除概率可達(dá)到0.99997。以上結(jié)果是利用9個(gè)標(biāo)記進(jìn)行親本來(lái)源鑒定的依據(jù)。實(shí)際鑒定結(jié)果與模擬分析相符，97.6%子代個(gè)體成功分配到配組家系，其中2.4%的個(gè)體分配到多個(gè)家系，這可能是基因型誤判所致。

本研究在家系建立前未進(jìn)行親本親緣關(guān)系的測(cè)算，利用篩選出的標(biāo)記計(jì)算出的各家系親本間的遺傳距離為0.285～0.762。根據(jù)孫效文等[24]在德國(guó)鏡鯉選育系（F4）中的研究結(jié)果，親本遺傳距離的可選范圍是0.2～0.7，因此松浦鏡鯉親本間存在較大的配組選擇空間。另一方面，36個(gè)子代家系間的遺傳距離范圍很小，僅為0.029～0.133，這可能與松浦鏡鯉較高的選育強(qiáng)度有關(guān)。

綜合本研究結(jié)果可知，經(jīng)過(guò)多代的強(qiáng)化培育，松浦鏡鯉不僅表型（形態(tài)、鱗被等）具有很強(qiáng)的一致性，群體的基因型一致性水平也有較大提高。本研究篩選出的9個(gè)多態(tài)性分子標(biāo)記和檢測(cè)方法可用于監(jiān)測(cè)不同地區(qū)或來(lái)源的松浦鏡鯉群體遺傳多樣性的動(dòng)態(tài)變化。在該品種未來(lái)的選育實(shí)踐中，可用這些標(biāo)記和檢測(cè)方法建立核心群的系譜檔案追溯混養(yǎng)子代的親本來(lái)源。

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Highly Effective Identification of Genetic Relationship of Songpu Mirror Carp（Cyprinus carpio Songpu）Using Microsatellite Markers

HU Xue-song,GE Yan-long,LI Chi-tao,WANG Shi-hui,JIA Zhi-ying,ZHANG Qiu-jun,SHI Lian-yu
（National and Local United Engineering Laboratory for Freshwater fish Breeding,Heilongjiang Fisheries Research Institute,Chinese Academy of Fishery Sciences,Harbin 150070,China）

In the present study,37 females and 14 males of Songpu mirror carp（Cyprinus carpio Songpu）were used to establish 37 full-sib families with clear genealogy,and all offspring individuals were cultured in a same pond and under the same conditions.Nine polymorphic microsatellite markers were chosen,and a multiple PCR detection method was furtherly used for the parentage assignment of 1 318 offspring samples.A total of 53 alleles were detected and each locus showed high polymorphism（PIC＞0.5）.The average expected and observed heteroygosity were 0.742 and 0.755,respectively.The simulation analysis based on genotypic information of parents showed that 100%of progeny could be correctly assigned the parent pair using 9 markers.In fact,the assignments to the actual family of 1 287 individuals with 9 loci were completed,and the success rate was 97.6%.All these results suggest that our marker suite can be used for genetic diversity detection,genetic distance analysis and parentage assignment in Songpu mirror carp.

Songpu mirror carp;microsatellite;family;genetic relationship

S917

A

1005-3832（2016）05-0037-06

2016-05-26

中央級(jí)公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)資助項(xiàng)目（HSY201302）；現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)（CARS-46-02）；國(guó)家科技支撐計(jì)劃資助項(xiàng)目（2012BAD26B02；2012BAD26B01）.

胡雪松（1977-），男，博士，從事魚類生理和育種研究.E-mail:huxuesong@hrfri.ac.cn

石連玉（1960-），男，研究員，從事魚類遺傳育種研究.E-mail:sly2552@yahoo.com.cn