孫嘉，楊樹青，孫珂，黨斌，鞠孜敬，孫淑紅**

（1.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)，山東 泰安 271018；2.濟(jì)南賽斯家禽科技有限公司，山東 濟(jì)南 250000)

采用血液、羽毛等材料鑒別雞性別PCR方法的應(yīng)用研究*

孫嘉1，楊樹青1，孫珂2，黨斌2，鞠孜敬1，孫淑紅1**

（1.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)，山東 泰安 271018；2.濟(jì)南賽斯家禽科技有限公司，山東 濟(jì)南 250000)

公母雞染色體上的染色體螺旋蛋白基因（chromobox-he-licase-DNA binding gene，CHD 1基因）的內(nèi)含子基因序列存在差異,通過PCR方法可擴(kuò)增該基因內(nèi)含子的保守序列,可對(duì)雞等非平胸禽類的性別進(jìn)行鑒定。本研究首先采集42只28日齡肉雞抗凝血，完成血液DNA PCR鑒定性別，結(jié)果表明，42只商品肉雞中22只公雞、20只母雞，與剖檢結(jié)果相同；其次，采集20只90日齡SPF雞（13只公雞、7只母雞）和15只2日齡SPF雞的抗凝血和羽毛，完成其DNA的 PCR鑒定以及與微量血的PCR檢測結(jié)果的比較。結(jié)果表明，90日齡、2日齡SPF雞的微量血PCR與抗凝血、羽毛提取DNA的PCR鑒定結(jié)果均相同，其中，90日齡SPF雞與其外觀性別完全吻合；另外，采集12枚15日齡雞胚的尿囊液、羽毛、肌肉，提取DNA后PCR方法可擴(kuò)增出區(qū)分性別的特異性條帶，鑒定結(jié)果一致，12枚15日齡雞胚中均為7個(gè)雄性、5個(gè)雌性。本研究表明，微量血PCR和血液、羽毛等材料提取DNA后的 PCR方法均可準(zhǔn)確快速鑒定雞和雞胚的性別，可作為家禽育種過程中常規(guī)鑒定方法的有力補(bǔ)充，適合大型養(yǎng)殖場規(guī)?；b定，也滿足科研領(lǐng)域區(qū)分雞和雞胚性別的需求。

雞；血液；羽毛；性別鑒定

雞在我國畜牧飼養(yǎng)業(yè)中占據(jù)很大比重，而且它是進(jìn)行科學(xué)研究的主要模型動(dòng)物之一，在科學(xué)研究領(lǐng)域也占據(jù)重要地位。飼養(yǎng)繁育過程中，根據(jù)不同的生產(chǎn)需求，需要對(duì)雞的性別進(jìn)行區(qū)分。為使原有品種的主要生產(chǎn)性能能夠整齊、穩(wěn)定、規(guī)格化的提高，或者為了獲得優(yōu)良性狀穩(wěn)定的新品種，需要進(jìn)行育種工作。育種過程中，由于雌雄個(gè)體的發(fā)育差異，對(duì)營養(yǎng)的需求有所不同，要求在早期就區(qū)分出雌雄個(gè)體，以便于分群飼養(yǎng)，不同品種的雞在進(jìn)行育種時(shí)，也需要合適的雌雄比例。PCR方法對(duì)雞進(jìn)行性別鑒定，生產(chǎn)上可作為傳統(tǒng)鑒別方法的一種補(bǔ)充方法，在新品種的繁育上起到重要作用；科研方面，可滿足形態(tài)學(xué)、內(nèi)分泌學(xué)、遺傳學(xué)等學(xué)科在早期區(qū)分性別的需求。

1 材料方法

1.1 主要儀器及試劑 DNA提取試劑盒購自天根生化科技有限公司，2×Taq Master Mix（含Taq DNA Polymerase，dNTP，優(yōu)化的緩沖體系）購自諾唯贊生物科技有限公司，性別鑒定引物由鉑尚生物科技有限公司合成，其它試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物 12枚SPF胚、15只2日齡SPF雞、90日齡SPF雞20只 （13只公雞、7只母雞），均購自濟(jì)南賽斯家禽科技有限公司；28日齡商品肉雞42只。

1.3 材料采集 SPF雞胚孵化至15日齡，4℃放置10h凍死雞胚，吸取尿囊液并采集胚體羽毛和腿部肌肉；心臟采血法采取2日齡雛雞血液，翅根靜脈采取28日齡商品肉雞和90日齡SPF雞血液，采取血液均為100μl/ml肝素抗凝血（肝素：血液=1：4）；采集雞翅膀或尾部羽毛囊內(nèi)容物較多的羽毛。

1.4 材料中雞基因組DNA的提取與PCR的擴(kuò)增 本研究通過雞ZW染色體上CHD 1基因內(nèi)含子大小的差異，針對(duì)以羽毛等基因組DNA PCR擴(kuò)增鑒定雞性別的方法選取一對(duì)引物SF/SR[1]，引物序列為：

另外，針對(duì)直接以雞微量血液為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增選取另一對(duì)引物2550F/2718R[2]，引物序列為：

1.4.1 材料中基因組DNA的提取 按照DNA提取試劑盒說明書，提取肝素抗凝血、尿囊液的基因組DNA；采用傳統(tǒng)的苯酚氯方法提取肌肉組織和羽毛的DNA。羽毛含有大量的角質(zhì)蛋白，苯酚氯仿法提取羽毛DNA時(shí)，取羽毛根部中空部位，剪成1cm長度小段，放入2ml離心管中，加入700μl組織抽提液、15μl胰蛋白酶 K，55～60℃消化8h。抽提 DNA時(shí)，Tris平衡酚和氯仿的用量加大至350μl。若經(jīng)12000rpm離心10min，上清層和蛋白質(zhì)層難以分離，可將上清層和蛋白質(zhì)層一同吸出，用Tris平衡酚和氯仿進(jìn)行第二次抽提。

1.4.2 基因組DNA的PCR擴(kuò)增 PCR反應(yīng)體系為 25μl：2×Taq Master Mix 12.5μl，上、下游引物（25μmol/ml）各1μl，基因組DNA 1μl。PCR反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性 5min；94℃變性 40s，55℃退火30s，72℃延伸 40s， 進(jìn)行 30個(gè)循環(huán)；72℃延伸7min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳后，在紫外凝膠成像儀讀取結(jié)果。

1.4.3 微量全血的PCR擴(kuò)增 PCR反應(yīng)體系25 μl：2×Taq Master Mix 12.5μl，ddH2O 9.9μl，上、下游引物（25μmol/ml）各1μl，抗凝血0.1μl。

根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[3]，采用該P(yáng)CR反應(yīng)程序：在PCR反應(yīng)管中加入上述PCR 反應(yīng)體系中各物品，95℃ 3min，55℃ 3min，4個(gè)循環(huán)使紅細(xì)胞模板的細(xì)胞膜變性裂解，釋放出細(xì)胞核內(nèi)的DNA。變性結(jié)束后，按如下程序進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)：94℃預(yù)變性5min；93℃變性 40s，52℃退火 30s，72℃延伸 40s，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；72℃延伸7min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳后，在紫外凝膠成像儀讀取結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 90日齡SPF雞血液DNA和羽毛DNA性別鑒定 通過PCR方法擴(kuò)增雞的血液和羽毛的基因組DNA，電泳結(jié)果見圖1。20只90日齡SPF雞（13只公雞，7只母雞）的PCR鑒定結(jié)果與表觀性別吻合。

圖1 90日齡SPF雞血液DNA、羽毛DNA PCR擴(kuò)增結(jié)果

2.2 28日齡商品肉雞的性別鑒定 血液DNA為模板，PCR鑒定結(jié)果表明，42只28日齡商品肉雞中有22只為公雞，20只為母雞，結(jié)果與剖檢結(jié)果完全吻合，部分電泳結(jié)果見圖2。

圖2 商品肉雞血液DNA PCR電泳結(jié)果

2.3 2日齡雛雞的性別鑒定 以2日齡雛雞的血液DNA和羽毛DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，電泳后出現(xiàn)區(qū)分性別的特異性條帶，電泳結(jié)果見圖3。結(jié)果顯示，15只雛雞中9只為公雞，6只為母雞。

圖3 雛雞血液DNA和羽毛DNA PCR電泳結(jié)果

2.4 15日齡雞胚的性別鑒定 以尿囊液、胚羽、腿肌的基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，電泳后出現(xiàn)目的條帶，同一雞胚尿囊液、胚羽、腿肌提取的基因組DNA PCR擴(kuò)增結(jié)果一致。部分電泳結(jié)果見圖4。

圖4 雞胚各材料DNA PCR電泳結(jié)果

2.5 微量血方法 以微量血為模板進(jìn)行性別鑒定，2日齡SPF雞的微量血鑒定結(jié)果與血液DNA、羽毛DNA的鑒定結(jié)果一致，90日齡SPF雞的微量血鑒定結(jié)果與雞的性別一致。電泳結(jié)果見圖5。

圖5 微量血PCR擴(kuò)增電泳結(jié)果

3 討論

雞性別由ZW染色體決定（雄性為ZZ，雌性為ZW），對(duì)性染色體上的CHD1、ATP5A1、EE0.6等特異性基因序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增，任意一特異性基因序列的擴(kuò)增產(chǎn)物都能夠鑒定雞的性別，其中CHD1基因在平胸鳥類的性別領(lǐng)域應(yīng)用最為廣泛，其擴(kuò)增方法簡單，擴(kuò)增的片段本身就可作為對(duì)照，避免假陰性或假陽性結(jié)果。染色體螺旋蛋白基因（chromobox-he-licase-DNA bingding gene，CHD 1基因）是性染色體上編碼調(diào)節(jié)整個(gè)染色體水平上轉(zhuǎn)錄活性蛋白的一個(gè)功能性基因[4]，其在非平胸鳥類中存在兩個(gè)同源拷貝基因，分別是與Z染色體連鎖的CHD1-Z和與W染色體連鎖的CHD1-W。1995年，Griffiths等[4]首次發(fā)現(xiàn)CHD1基因，并針對(duì)CHD1基因上的保守序列設(shè)計(jì)了一對(duì)引物（P2/ P3），展開了鳥類性別的分子鑒定工作。在非平胸鳥類的性別鑒定研究中,很多學(xué)者[5-10]采取糞便、羽毛等材料進(jìn)行鳥類的性別鑒定工作,成功鑒定出了多種野生鳥類和來亨雞的性別。Jensen等[11]利用卵殼膜提取基因組DNA，通過擴(kuò)增CHD基因上的保守基因片段成功鑒定出鳥類的性別，李振剛等[12]對(duì)雞胚血管的分布情況和形態(tài)制定了雄性雞胚的標(biāo)準(zhǔn)血線判定方法。

目前，雞一般是通過體貌特征和行為方式[13]、荷爾蒙水平測定[14]和腹腔剖檢[15]等辦法進(jìn)行性別鑒定，但是這些方法存在一定的局限性。采用翻肛法對(duì)雞進(jìn)行性別鑒定，其成本低廉，鑒定速度較快，準(zhǔn)確率可達(dá)95%以上,可應(yīng)用于生產(chǎn)上雞的大批量鑒定，但頻繁的接觸雛雞會(huì)引起多種疾病的橫向傳播,并且翻出肛門會(huì)造成一定的機(jī)械損傷，也要求鑒定性別的工作人員積累充足的經(jīng)驗(yàn)，該方法存在一定的局限性。翻肛法適用于生產(chǎn)上雞的性別鑒定，其95%的準(zhǔn)確率無法滿足科研領(lǐng)域區(qū)分性別的需求。

隨著對(duì)鳥類性別鑒定的不斷研究以及分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，PCR擴(kuò)增技術(shù)成為鑒定雞性別的一種比較理想的方法。應(yīng)用非傷害性取樣法抽取血液、采集羽毛等材料，在不觸及或損傷雞的情況下采集材料，對(duì)雞的應(yīng)激小，結(jié)合普通PCR操作簡便、周期短的特點(diǎn)，可對(duì)大量材料同時(shí)進(jìn)行檢測，即適用于小群育種時(shí)性別的鑒定，也可滿足科研對(duì)鑒定準(zhǔn)確率的要求。

根據(jù)CHD1基因的內(nèi)含子基因序列在Z、W染色體上大小的差異，利用內(nèi)含子兩側(cè)的保守序列設(shè)計(jì)特異性引物，用該引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增后，雌性會(huì)出現(xiàn)450bp、600bp的兩條帶，雄性只會(huì)出現(xiàn)600bp大小的一條帶，電泳后僅根據(jù)條帶的數(shù)目就可判斷雞的雌雄。

本研究對(duì)雞胚和不同日齡的雞進(jìn)行性別鑒定，采集雞的羽毛、血液、肌肉以及雞胚的尿囊液、胚體羽毛、肌肉組織，提取基因組DNA，PCR擴(kuò)增后電泳均出現(xiàn)鑒別雌雄的特異性目的條帶。同一雞或雞胚不同材料的基因組DNA經(jīng)PCR方法鑒定性別的結(jié)果一致。另外，同一只雞微量血PCR的鑒定結(jié)果與基因組DNA的PCR鑒定結(jié)果相同。在應(yīng)用PCR方法鑒定雞的性別時(shí)，雞的羽毛、血液、肌肉均可作為雌雄鑒別的材料，尿囊液、胚體羽毛、肌肉組織可用于雞胚的雌雄鑒別。

新生雛雞的翅靜脈和頸靜脈細(xì)小，采血困難。通過心臟采血法可以采集到足夠的雛雞血液，但該采血方法對(duì)新生雛雞的傷害極大，易致雛雞死亡。羽毛的再生能力強(qiáng)，并且可通過非傷害性采樣獲得，對(duì)雞的應(yīng)激和傷害小，在應(yīng)用PCR方法鑒定新生雛雞的性別時(shí)，羽毛是最理想的材料。通過測定尿囊液中雌激素水平也可區(qū)分16～18日齡雞胚的雌雄，但PCR方法鑒定性別可將鑒定時(shí)間提早至5～6胚齡。12.5日齡雞胚的尿囊液中含有少量脫落的胚胎細(xì)胞，200μl尿囊液可提取足夠的基因組DNA，避開血管及胚體抽取尿囊液后用石蠟封口仍可孵化出殼。PCR方法鑒定雛雞和雞胚的性別，靈敏準(zhǔn)確，樣品用量少且提取的DNA不需要純化，適合在大型養(yǎng)雞場進(jìn)行規(guī)模化鑒定[16]。

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Sex Identification of Chicken with Blood,Feathers and Other Materials by PCR

SUN Jia1,YANG Shu-qing1,SUN Ke2,DANG Bin2,JU Zi-jing1,SUN Shu-hong1
(1.Shanong Agricultural University,Shandong Tai'an 271018，China; 2.Jinan SAIS Poultry Co.,Ltd,Shandong Ji'nan 250000,China)

The intron gene sequence of CHD1 gene(chromobox-he-licase-DNA binding gene) was different between the chromosomes of hens and roosters.PCR(Polymerase Chain Reaction)was used to amplified the conserved sequence of the intron gene sequence in order to identified the sex of non-ratite birds such as chickens. First of all,we collected 42 anticoagulant blood samples of 28-day-old broilers,extracted DNA from the blood and used PCR to indentify the sex.Theresultsshowed that therewere22 roosters and 20 hens,thesameasthenecropsy result. Secondly,we collected anticoagulant blood and feathers samples of 20 90-day-old SPF chickens(13 roosters,7 hens)and 15 2-day-old SPF chickens,DNA was extracted and was used in PCR. Meanwhile,PCR amplification were taken on microscale blood samples and the result were identical to the PCR(with DNA)result.Among the result,all the 90-day-old SPF chickens' sex were identical to their appearance sex. Thirdly, we collected feathers, muscles and allantoic fluid samples of 12 15-day-old chicken embrysos and then extracted DNA. sexspecific bands were amplified by PCR and the result showed that there were 7 male embrysos and 5 female embrysos.In conclusion,both PCR with microscale blood samples and PCR with DNA extracted from blood and feathers could quickly and accurately identify the sex of embrysosand chickens. Itcould be a strong complementto conventionalmethodsofsex identification among poultry breeding process.

chicken;blood;feather;identified the sex

S814.7

B

1673-1085（2016）07-0011-05

2016-06-11

山東省科技發(fā)展計(jì)劃。

孫嘉（1990-），男，執(zhí)業(yè)獸醫(yī)師，碩士研究生，主要從事禽病學(xué)研究，E-mail:416211484@qq.com。

**通訊作者。