鄭嶸炅,張麗娟

(新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院感染性疾病中心,新疆 烏魯木齊 830054)

?

MiRNA-155在肝細(xì)胞癌組織中的表達(dá)及其與臨床病理特征和預(yù)后的關(guān)系

鄭嶸炅,張麗娟

(新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院感染性疾病中心,新疆 烏魯木齊 830054)

目的：觀察微小RNA-155(miRNA-155)在肝細(xì)胞癌(hepatocellular cancer，HCC)組織中的表達(dá)及其與臨床病理特征和預(yù)后的關(guān)系。方法：應(yīng)用實(shí)時(shí)定量反轉(zhuǎn)錄PCR檢測(cè)77例HCC患者癌組織和癌旁組織中miRNA-155表達(dá)情況，并分析不同病理特征HCC患者間miRNA-155表達(dá)差異。Kaplan-Meier生存曲線分析miRNA-155和患者預(yù)后的關(guān)系。結(jié)果：miRNA-155在HCC癌組織中表達(dá)量顯著高于癌旁組織(P<0.01)；高miRNA-155表達(dá)和HCC患者TMN分期(P<0.05)、微血管侵犯(P<0.05)密切相關(guān)。Kaplan-Meier生存分析顯示，miRNA-15高表達(dá)的HCC患者平均生存期(16.07±1.52)個(gè)月，miRNA-155低表達(dá)患者為(28.25±1.38)個(gè)月，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論：miRNA-155在HCC患者中存在過(guò)表達(dá)，且與患者預(yù)后存在一定關(guān)系。

肝細(xì)胞癌；微小核糖核酸；臨床病理特征；預(yù)后

肝細(xì)胞癌(hepatocellular cancer，HCC)是最常見(jiàn)惡性腫瘤之一，位居全球惡性腫瘤發(fā)病率第6位和死亡率第2位[1-2]。中國(guó)是肝癌新發(fā)病例最多的國(guó)家，數(shù)據(jù)顯示，全國(guó)肝癌的發(fā)病率居第3位，死亡率僅次于肺癌[3]。HCC發(fā)生和發(fā)展涉及原位癌基因激活和/或抑癌基因失活，是一種病理機(jī)制復(fù)雜的多階段、多步驟過(guò)程。目前臨床診斷和評(píng)估肝臟炎癥、慢性纖維化和癌變程度需結(jié)合抗原、抗體等血清標(biāo)志物以及甲胎蛋白(AFP)等實(shí)驗(yàn)室相關(guān)指標(biāo)，因此尋找特異性生物標(biāo)記物是 HCC 早期診斷的研究熱點(diǎn)[4-5]。微小RNAs(miRNAs)是一類長(zhǎng)度為 19～25個(gè)核糖核苷酸的非編碼單鏈小分子 RNA，參與機(jī)體多種生物學(xué)信號(hào)通路調(diào)節(jié)，與細(xì)胞周期活動(dòng)、腫瘤的進(jìn)入和轉(zhuǎn)移有關(guān)[6]。隨著對(duì)miRNAs的深入研究，發(fā)現(xiàn)其異常表達(dá)與HCC的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，對(duì)腫瘤進(jìn)展和生存預(yù)后判斷具有潛在價(jià)值[7-8]。報(bào)道[9-10]稱miRNA-155在一系列實(shí)體腫瘤中存在過(guò)表達(dá)，具有腫瘤診斷和預(yù)后判斷的作用。但也有研究[8]表明，miRNA-155在黑色素瘤中表達(dá)降低，并能靶向抑制SKI蛋白的抑癌作用。目前為止，針對(duì)miRNA-155與HCC相關(guān)性的報(bào)道相對(duì)較少。本研究運(yùn)用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)檢測(cè)HCC患者癌組織中miRNA-155的表達(dá)水平，并初步探討其在肝癌預(yù)后中的診斷價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來(lái)源

收集2012年4月至2014年7月新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院收治的77例HCC患者的臨床病理資料、手術(shù)切除癌組織和癌旁組織標(biāo)本?；颊呷虢M標(biāo)準(zhǔn)：①既往乙型肝炎病毒(HBV)感染、肝硬化后進(jìn)展為HCC;②符合NCCN臨床實(shí)踐指南：肝膽腫瘤[11]中肝癌根治手術(shù)指征；③術(shù)后病理組織確診為HCC；④術(shù)后隨訪資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并丙型肝炎病毒(HCV)感染，或其他病毒性肝炎導(dǎo)致的HCC患者；②合并其他器官、系統(tǒng)惡性腫瘤患者。77例患者中男性59例，女性18例；年齡41～65歲，平均(53.21±7.05)歲；腫瘤TNM分期：Ⅰ期24例，Ⅱ期27例，Ⅲ～Ⅳ期26例。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本采集 分別收集患者癌組織標(biāo)本和距離癌組織邊緣>5 cm的癌旁組織標(biāo)本，充分研磨后，每50 mg標(biāo)本中加入1 mL裂解液，無(wú)水乙醇和氯仿處理后離心去雜質(zhì)，-80℃保存?zhèn)錂z。

1.2.2 細(xì)胞總RNA提取 按照RecoverALLTM總核酸提取成套盒(購(gòu)自美國(guó)Ambion公司)說(shuō)明書提取總RNA，并用Nano Drop ND-1000分光光度計(jì)測(cè)定RNA的含量和純度。

1.2.3 逆轉(zhuǎn)錄和實(shí)施定量PCR 應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(購(gòu)自大連Takara公司)將總RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板，根據(jù)實(shí)時(shí)PCR引物設(shè)計(jì)原則及miR-155序列設(shè)計(jì)miR-155實(shí)時(shí) PCR引物。選擇U6作為miR-155的內(nèi)參基因(見(jiàn)表1)，定量PCR反應(yīng)條件按照試劑盒說(shuō)明書嚴(yán)格進(jìn)行。每個(gè)樣品均設(shè)置3個(gè)平行反應(yīng)復(fù)孔，miR-155表達(dá)量用實(shí)時(shí)定量 PCR的CT均值來(lái)表示，相對(duì)定量用 2-ΔΔCt來(lái)計(jì)算。

表1 實(shí)時(shí)定量PCR使用引物列表

1.3 觀察指標(biāo)

對(duì)比HCC患者癌組織和癌旁組織中miRNA-155表達(dá)水平差異，并根據(jù)病理資料對(duì)HCC患者進(jìn)行分類，探討miRNA-155表達(dá)與病理特征之間的關(guān)系。收集患者術(shù)后隨訪資料，分析不同miRNA-155表達(dá)水平的HCC患者術(shù)后生存情況。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 癌組織和癌旁組織miRNA-155表達(dá)

HCC患者癌組織中miRNA-155平均表達(dá)水平為5.70(3.40,11.06)，癌旁組織miRNA-155平均表達(dá)水平為1.14(0.75, 2.21)，miRNA-155在HCC癌組織中表達(dá)水平顯著高于癌旁組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

2.2 miRNA-155表達(dá)與臨床病理關(guān)系

以miRNA-155中位數(shù)作為臨界值，將77例HCC患者分為低表達(dá)組(n=39)和高表達(dá)組(n=38)，結(jié)果顯示，miRNA-155表達(dá)水平與TMN分期(P<0.05)、微血管侵犯(P<0.05)密切相關(guān)，而與性別、腫瘤分化程度、腫瘤最大徑、腫瘤數(shù)目和術(shù)前AFP水平無(wú)明顯關(guān)系(P>0.05)。見(jiàn)表2。

表2 miRNA-155表達(dá)與HCC患者臨床病理特征的關(guān)系[n(%)]

病理特征例數(shù)高表達(dá)組(n=38)低表達(dá)組(n=39)t/χ2值P值性別 男5930(78.95)29(74.36) 女188(21.05)10(65.64)TMN分期 I～I(xiàn)I5120(52.63)29(74.36) III～I(xiàn)V2618(47.36)10(25.64)腫瘤分化 低分化3114(36.84)17(43.59) 高、中分化4624(63.16)22(56.41)腫瘤最大徑 ≤5cm3717(44.74)20(51.28) >5cm4021(55.26)19(48.72)腫瘤數(shù)目 單發(fā)4220(52.63)22(56.41) 多發(fā)3518(47.37)17(43.59)微血管侵犯 無(wú)5621(55.26)32(82.05) 有2117(44.74)7(17.95)術(shù)前AFP/(μg/L) ≤4004924(63.16)25(64.10) >4002814(36.84)14(73.68)0.226>0.053.926<0.050.364>0.050.330>0.050.110>0.054.037<0.050.007>0.05

2.3 miRNA-155表達(dá)水平和患者生存預(yù)后的關(guān)系

隨訪時(shí)間至2015年9月，Kaplan-Meier生存分析顯示miRNA-155高表達(dá)患者平均生存時(shí)間為(16.07±1.52)個(gè)月，顯著短于miRNA-155低表達(dá)組(28.25±1.38)個(gè)月，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，可見(jiàn)miRNA-155高表達(dá)患者的預(yù)后較差(圖1)。

3 討論

miRNA是一種非編碼RNA，成熟的miRNA通過(guò)核酸序列互補(bǔ)識(shí)別特定目標(biāo)mNRA,當(dāng)miRNA和編碼蛋白的mRNA3′-UTR完全配對(duì)時(shí)，能誘導(dǎo)靶mRNA的降解；而當(dāng)miRNA和靶mRNA3′-UTR不能完全配對(duì)時(shí)，在轉(zhuǎn)錄過(guò)程抑制基因的翻譯，從而抑制蛋白質(zhì)合成并調(diào)控基因表達(dá)[12]。miRNA-155位于人染色體21q21非編碼轉(zhuǎn)錄本B細(xì)胞整合簇(BIC)第3個(gè)外顯子內(nèi)，其表達(dá)水平受BIC的轉(zhuǎn)錄水平和miRNA加工等調(diào)控[13]。miRNA-155作為一種多功能miRNA，參與調(diào)控造血細(xì)胞和免疫細(xì)胞的發(fā)育分化。繼Acunzo等[14]表明miRNA-155在慢性淋巴細(xì)胞白血病中表達(dá)異常之后，越來(lái)越多的試驗(yàn)表明miRNA-155在胰腺癌、乳腺癌、宮頸癌等實(shí)體惡性腫瘤中呈現(xiàn)高表達(dá)。本研究顯示，HCC患者癌組織中miRNA-155表達(dá)水平較癌旁組織顯著上調(diào)，表達(dá)水平和TMN分期(P<0.05)、微血管侵犯密(P<0.05)密切相關(guān)。同時(shí)，Kaplan-Meier生存分析顯示，miRNA-155高表達(dá)患者預(yù)后較差，韓中博等[15]通過(guò)COX多因素模型分析也指出miRNA-155是影響患者肝癌移植術(shù)后生存的獨(dú)立因素，但miRNA-155是否能作為HCC潛在的腫瘤標(biāo)志物仍需進(jìn)一步研究證明。

miRNA-155通過(guò)降低caspase-3的活性來(lái)抑制腫瘤細(xì)胞的凋亡，同時(shí)其異常表達(dá)也能造成腫瘤蛋白表達(dá)減少，抑制細(xì)胞周期[16]。miRNA-155還可能參與介導(dǎo)炎癥反應(yīng)相關(guān)的基因調(diào)節(jié)過(guò)程[17]，而炎癥反應(yīng)在腫瘤發(fā)生、發(fā)展、惡化、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移中同樣扮演重要角色。傅春江等[18]也發(fā)現(xiàn)在腫瘤微環(huán)境的刺激下，肝腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為和腫瘤細(xì)胞內(nèi)miRNA表達(dá)譜均發(fā)生了變化，以miRNA-155改變最為顯著。本研究中HCC患者有既往HBV感染、肝硬化病史，后續(xù)研究可以探討miRNA-155在疾病進(jìn)展不同階段的表達(dá)情況。

綜上所述，miRNA-155在肝細(xì)胞癌組織中存在過(guò)表達(dá)，且與患者預(yù)后存在一定關(guān)系，是一種潛在的肝癌診斷、治療和預(yù)后判斷的分子標(biāo)志物。

[1] Ferlay J,Soerjomataram I,Dikshit R,etal.Cancer incidence and mortality worldwide:sources,methods and major patterns in GLOBOCAN 2012[J].Int J Cancer,2015,136(5):E359-E386.

[2] 熊義富,李麗,徐浩.HIF-1α/VEGF 在肝細(xì)胞癌的表達(dá)及其與腫瘤血管生成的關(guān)系[J].川北醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2013,28(6):530-533.

[3] Wallace MC，Preen D，Jeffrey GP,etal.The evolving epidemiology of hepatocellular carcinoma:a global perspective[J].Expert The evolving epidemiology Rev Gastroenterol Hepatol,2015,9(6):765-779.

[4] Witjes CD,van Aalten SM,Steyerberg EW,etal.Recently introduced biomarkers for screening of hepatocellular carcinoma:a systematic review and meta-analysis[J].Hepatol Int,2013,7(1):59-64.

[5] 李杰,馬曉潔,譚榜憲.原發(fā)性肝癌中血管生成擬態(tài)的表達(dá)和預(yù)后相關(guān)性分析[J].川北醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2012,27(2):97-98.

[6] Melo S A,Sugimoto H,O’Connell JT,etal.Cancer exosomes perform cell-independent microRNA biogenesis and promote tumorigenesis[J].Cancer Cell,2014,26(5):707-721.

[7] 薛華,化羅明,羅建民.miRNA-155與惡性血液病[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)血液學(xué)雜志,2013,21(3):810-814.

[8] 江文洋,康敢軍,謝頌平,等.miR-155與消化系統(tǒng)腫瘤關(guān)系的研究進(jìn)展[J].臨床腫瘤學(xué)雜志,2014,19(5):473-476.

[9] Uchida F,Hasegawa S,Baba O,etal.miRNA-155-5p Targets ZNF703 and Suppresses Metastasis in Oral Cancer Cells[J].Journal of Oral and Maxillofacial Surgery,2014,72(9):e113-e114.

[10]Thomsen KG,Terp MG,Lund RR,etal.miR-155,identified as anti-metastatic by global miRNA profiling of a metastasis model,inhibits cancer cell extravasation and colonization in vivo and causes significant signaling alterations[J].Oncotarget,2015,6(30):29224-29239.

[11]Benson AB,Abrams TA,Ben-Josef E,etal.NCCN clinical practice guidelines in oncology:hepatobiliary cancers[J].J Natl Compr Canc Netw,2009,7(4):350-391.

[12]Tenga A,Beard JA,Takwi A,etal.Regulation of Nuclear Receptor Nur77 by miR-124[J].PLoS ONE,2016,11(2):e0148433.

[13]Zeng FR,Tang LJ,He Y,etal.An update on the role of miRNA-155 in pathogenic microbial infections[J].Microbes Infect,2015,17(9):613-621.

[14]Acunzo M,Croce CM.Downregulation of miR-15a and miR-16-1 at 13q14 in Chronic Lymphocytic Leukemia[J].Clin Chem,2016,62(4):655-656.

[15]韓中博,陳洪元,樊軍衛(wèi),等.微小RNA-155,在肝細(xì)胞癌中的表達(dá)及其對(duì)肝癌肝移植術(shù)患者預(yù)后的影響[J].中華醫(yī)學(xué)雜志,2013,93(12):884-887.

[16]Saadi H,Seillier M,Carrier A.The stress protein TP53INP1 plays a tumor suppressive role by regulating metabolic homeostasis[J].Biochimie,2015,118(1):44-50.

[17]Hu R,Kagele DA,Huffaker TB,etal.miR-155 promotes T follicular helper cell accumulation during chronic,low-grade inflammation[J].Immunity,2014,41(4):605-619.

[18]傅春江,毛廷森,曾泉,等.miR-155對(duì)人肝癌細(xì)胞系 SK-HEP-1 及 MHCC-97H 增殖與浸潤(rùn)能力的影響[J].生物技術(shù)通訊,2015,26(5):600-604.

(學(xué)術(shù)編輯：劉鳳君)

Expression of miRNA-155 in hepatocellular cancerous tissues and its relationship with clinical pathological characteristics and prognosis

ZHENG Rong-jiong,ZHANG Li-juan

(CenterforInfectiousDiseases,TheFirstAffiliatedHospitalofXinjiangMedicalUniversity,Urumchi830054,Xinjiang,China)

Objective：To observe the expression of micro-RNA-155 (miRNA-155) in tissues of hepatocellular cancer (HCC) and its relationship with clinical pathological characteristics and prognosis.Methods：Quantitative real-time reverse transcription polymerase chain reaction (PCR) was used to detect the expression of miRNA-155 in the cancerous tissues and para-cancerous tissues of 77 patients with HCC,and the difference of miRNA-155 expression in HCC patients with different pathological characteristics was analyzed. Kaplan-Meier survival curve was used to analyze the correlation between miRNA-155 and patients’ prognosis.Results：miRNA-155 expression was evidently higher in cancerous tissues than that in para-cancerous tissues of HCC(P<0.01).High expression of miRNA-155 was in close association with TMN staging (P<0.05) and microvascular invasion (P<0.05) in patients with HCC.Kaplan-Meier survival curve analysis showed that the average survival time was (16.07±1.52) months in HCC patients with high expression of miRNA-155 and (28.25±1.38) months in those with low expression of miRNA-155,and there was significant difference (P<0.05).Conclusion：MiRNA-155 over-expresses in patients with HCC and it has certain relationship with patients’ prognosis.

Hepatocellular cancer;Micro ribonucleic acid;Clinical pathological characteristics;Prognosis

10.3969/j.issn.1005-3697.2016.06.032

2016-07-12

鄭嶸炅(1981-)，女，碩士，主治醫(yī)師。E-mail: zhengrongjiong@163.com

時(shí)間：2017-1-3 22∶01

http://www.cnki.net/kcms/detail/51.1254.R.20170103.2201.064.html

1005-3697(2016)06-0891-03

R735.7

A