林曉潔，關(guān)若丹，司徒紅林，戴燕，許銳，宋雪，丘嫦，郭倩倩，林毅，陳前軍

廣東省中醫(yī)院大學(xué)城醫(yī)院乳腺科，廣東 廣州 510006

參芪扶正液使化療增效的代謝通路初探
——維生素K2代謝

林曉潔，關(guān)若丹，司徒紅林，戴燕，許銳，宋雪，丘嫦，郭倩倩，林毅，陳前軍

廣東省中醫(yī)院大學(xué)城醫(yī)院乳腺科，廣東 廣州 510006

目的：通過(guò)液相色譜質(zhì)譜法對(duì)乳腺癌新輔助化療患者接受參芪扶正液治療前后的血漿代謝產(chǎn)物的對(duì)比分析，尋找參芪扶正液對(duì)乳腺癌新輔助化療增效的重要代謝通路，并以此建立其與扶正法抗瘤的聯(lián)系。方法：采用前瞻性隨機(jī)對(duì)照研究，納入?yún)④畏稣褐委熃M患者17例、對(duì)照組患者18例，收取每例患者化療前后血標(biāo)本，共70份標(biāo)本。應(yīng)用超高效液相色譜質(zhì)譜技術(shù)，獲得代謝輪廓圖譜，并運(yùn)用偏最小二乘判別分析和共識(shí)正交偏最小二乘判別分析模式識(shí)別技術(shù)，對(duì)得到的譜圖積分進(jìn)行分析，根據(jù)質(zhì)譜同位素（質(zhì)荷比）匹配HMDB數(shù)據(jù)庫(kù)，對(duì)化療前后血漿潛在的生物標(biāo)志物進(jìn)行鑒定。結(jié)果：治療組和對(duì)照組化療后的血漿代謝狀態(tài)與化療前比較完全發(fā)生了分離；化療后，對(duì)照組中維生素K2、傘形花內(nèi)酯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而治療組中無(wú)明顯變化，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)論：參芪扶正液能維持乳腺癌新輔助化療患者體內(nèi)維生素K2和傘形花內(nèi)酯的代謝平衡，這可能是其達(dá)到化療增效作用的重要環(huán)節(jié)。

乳腺癌；參芪扶正液；代謝組學(xué)；維生素K2

研究證明[1]，參芪扶正注射液聯(lián)合放化療能提高放療、化療的近期療效，改善生活質(zhì)量、降低毒副反應(yīng)。本研究中35例患者在前期臨床上新輔助化療的臨床療效評(píng)估亦提示參芪扶正液干預(yù)的治療組略?xún)?yōu)于對(duì)照組(臨床緩解率：58.8%(10/17) VS 50.0%(9/18))，但參芪扶正液在人體中經(jīng)過(guò)復(fù)雜代謝后，是怎樣達(dá)到對(duì)化療減毒增效的作用，其可能的作用靶點(diǎn)是什么，仍然不清楚。本研究試圖通過(guò)代謝組學(xué)方法尋找出參芪扶正液對(duì)乳腺癌新輔助化療增效的重要代謝通路，并闡述其與扶正法抗瘤的聯(lián)系。

1 臨床資料

觀察病例為2014年2月—2015年1月于廣東省中醫(yī)院乳腺科住院接受新輔助治療的乳腺癌患者共35例，病理類(lèi)型均為浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌。治療組17例，平均年齡(50.4±9.9)歲；對(duì)照組18例，平均年齡(56.3±12.3)歲。2組患者臨床分期、組織學(xué)分級(jí)、HER-2狀態(tài)、化療方案情況經(jīng)檢驗(yàn)，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，見(jiàn)表1。所有患者均無(wú)嚴(yán)重心、肺、肝、腎功能不全。

2 治療方法

2.1 對(duì)照組 患者均根據(jù)病情接受相應(yīng)的新輔助化療，HER-2陽(yáng)性者同時(shí)聯(lián)合赫賽汀治療至1年。本研究中采用的化療方案有TEC、EC、TCH、FEC。

表1 一般資料比較(±s) 例

表1 一般資料比較(±s) 例

注：上表P值取自χ2檢驗(yàn)或Fisher’s確切概率法；①數(shù)據(jù)由確切概率法計(jì)算得出。

項(xiàng)目臨床分期ⅢA期ⅢB期ⅢC期組織學(xué)分級(jí)1級(jí)2級(jí)3級(jí)H ER-2狀態(tài)陰性陽(yáng)性化療方案TEC EC TCH FEC治療組(n=17)對(duì)照組(n=18)P值10 1 6 0 9 0 9 2 0.50①130.26①4 6 14 2 100.23 11 7 7 2 1 8 4 8 2 4 0.45①

2.2 治療組 在對(duì)照組治療方案的基礎(chǔ)上，于化療當(dāng)天至化療后第6天連續(xù)予參芪扶正注射液(由麗珠集團(tuán)利民制藥廠提供，規(guī)格：每瓶250 mL，注射劑；批號(hào)：219990065)，靜脈滴注：每次250 mL，每天1次，周期為21天，共3周期。

2組分別于化療開(kāi)始前1天，第3周期化療后第10天留取血漿，共70份標(biāo)本?；?周期結(jié)束后評(píng)估化療療效。

3 觀察指標(biāo)與統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3.1 儀器和試劑儀器 Waters UPLC超高效液相色譜系統(tǒng)，配備自動(dòng)進(jìn)樣器。質(zhì)譜檢測(cè)采用AB SCIEX Triple TOF 5600高分辨質(zhì)譜儀，配有ESI電離源。VORTEX-5渦旋混合器(江蘇海門(mén)其林貝爾儀器制造有限公司)；AllegraTM X-22臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(Beckman Coulter，美國(guó))。

3.2 試劑 HPLC級(jí)乙腈、甲醇購(gòu)自Merck公司(Darmstadt，Germany)，甲酸購(gòu)自Fluka公司(Buchs，Switzerland)。其它試劑均為市售分析超純水(18.2MΩ)由本實(shí)驗(yàn)室Milli-Q超純水系統(tǒng)(Millipore，F(xiàn)rance)制備。

3.3 樣本的采集與處理 ①樣本采集：人血漿(EDTA抗凝)樣品；采集時(shí)間：首次化療前空腹抽血，第3周期化療結(jié)束后第10天空腹抽血(非抗凝血管支，約3 mL)，采集后立即-80℃冷凍保存。②樣品前處理：將保存的血漿4℃凍融后，振蕩混合均勻，取200 μL，置1.5 mL EP管中，加入乙腈800 μL，2 000 r/min渦旋混合2 min，置高速離心機(jī)中，13 000 r/min，離心20 min，取上清液置2 mL進(jìn)樣小瓶中。

3.4 數(shù)據(jù)采集與統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 ①數(shù)據(jù)采集及預(yù)處理：采用AB SCIEX公司的Analyst軟件對(duì)LC-MS的結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)采集，得到血漿代謝的指紋圖譜。采用MarkerView4.1軟件對(duì)代謝指紋圖譜進(jìn)行數(shù)據(jù)分析處理，進(jìn)行色譜合并，峰判別、峰對(duì)齊和歸一化等預(yù)處理。②多元統(tǒng)計(jì)分析方法：經(jīng)預(yù)處理后的各樣本量化信息數(shù)據(jù)導(dǎo)入SIMCA-P14.0軟件用于多維統(tǒng)計(jì)，運(yùn)用偏最小二乘判別分析(PLS-DA)和正交偏最小二乘判別分析(OPLS-DA)模式識(shí)別技術(shù)，對(duì)得到的譜圖積分進(jìn)行分析，比較對(duì)照組的受試者與治療組的受試者血漿代謝成分的差異，得到對(duì)分組貢獻(xiàn)最大的一組譜峰，結(jié)合t檢驗(yàn)等統(tǒng)計(jì)學(xué)方法，得到不同分組情況下，樣本間的聚類(lèi)情況，找出與分組相關(guān)的體內(nèi)小分子化合物，根據(jù)化合物在樣本聚類(lèi)中的貢獻(xiàn)度大小，對(duì)采用模式識(shí)別分析得出的化合物在各組間的差異進(jìn)行了兩兩間檢驗(yàn)分析，從不同臨床意義角度出發(fā)，找出組間差異性較大的化合物。

4 研究結(jié)果

4.1 典型代謝指紋圖譜 見(jiàn)圖1。圖1分別為對(duì)照組化療前、化療后，治療組化療前、化療后的代謝輪廓。每一個(gè)波峰代表一個(gè)代謝物，本研究共檢測(cè)到3074種代謝物，但現(xiàn)代技術(shù)目前能鑒別出來(lái)的代謝物僅有數(shù)百種，我們只需找出各組中含量差異較大的代謝物，并作鑒定。

4.2 化療前后差異代謝物分析及鑒定

4.2.1 2組化療前后血漿差異代謝物鑒定 見(jiàn)表2。根據(jù)OPLS-DA模型中的VIP值(VIP＞1)和t檢驗(yàn)結(jié)果，篩查出2組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)的化合物。即對(duì)分類(lèi)貢獻(xiàn)較大的特異性代謝物，經(jīng)鑒定共有13個(gè)(以不同的質(zhì)荷經(jīng)-保留時(shí)間表示不同的代謝物)。

圖1 血漿代謝UPLC-TOF指紋圖譜

表2 2組化療前后血漿差異代謝物鑒定 (13個(gè)) (根據(jù)歸一化積分值比較P值)

4.2.2 （正交）偏最小二乘法模型 見(jiàn)圖2。將血漿對(duì)照組化療前后與治療組化療前后的數(shù)據(jù)進(jìn)行PLS-DA和OPLS-DA分析，得到score圖(圖2-A、C、D)和loading圖(圖2-B)，分別提示不同組別的代謝狀態(tài)、聚類(lèi)關(guān)系和化合物差異分布。

4.2.3 化療前后血漿差異代謝物鑒定 見(jiàn)表3。根據(jù)質(zhì)譜同位素(質(zhì)荷比)匹配HMDB數(shù)據(jù)庫(kù)的檢索結(jié)果(http：//www. hmdb.ca)及查閱文獻(xiàn)后，結(jié)合化合物的生物學(xué)、臨床意義，對(duì)化療前后血漿潛在的生物標(biāo)志物(差異代謝物)進(jìn)行鑒定和篩選。對(duì)照組中維生素K2、傘形花內(nèi)酯降低(P＜0.05)，而治療組中無(wú)明顯變化(P＞0.05)。

5 討論

本研究通過(guò)液相色譜質(zhì)譜法探索分析了新輔助化療的乳腺癌患者接受參芪扶正液治療的治療組與未接受參芪扶正液治療的對(duì)照組血漿代謝組學(xué)的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，相比化療前，經(jīng)參芪扶正液干預(yù)的治療組和對(duì)照組其代謝輪廓化療后均發(fā)生了明顯差異。共有13個(gè)代謝物出現(xiàn)了明顯的變化，但2組化療前后發(fā)生變化的程度不一致，其中，經(jīng)參芪扶正液干預(yù)的患者，化療后維生素K2與傘形花內(nèi)酯的含量相比對(duì)照組可維持穩(wěn)定，結(jié)合研究中35例患者新輔助化療的臨床療效評(píng)估為參芪扶正液干預(yù)的治療組略?xún)?yōu)于對(duì)照組[58.8%(10/17)VS 50.0%(9/18)]，筆者推論，維生素K2和傘形花內(nèi)酯可能是參芪扶正液對(duì)化療增效的重要代謝通路。傘形花內(nèi)酯為家庭種當(dāng)歸類(lèi)植物抗毒素，主要功能是營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充，目前尚缺乏相關(guān)研究，以下就維生素K2與參芪扶正液對(duì)化療增效的相關(guān)機(jī)制展開(kāi)論述。

圖2 血漿代謝組學(xué)數(shù)據(jù)分析

表3 化療前后血漿差異代謝物鑒定

Vit K2主要作用是維持機(jī)體的正常凝血功能，臨床上主要用于出血性疾病的治療。但早在上世紀(jì)40年代末，有學(xué)者已發(fā)現(xiàn)接受維生素K治療的腫瘤病人，其腫瘤出現(xiàn)壞死現(xiàn)象，由此推斷維生素K可能具有抗腫瘤作用。近幾年越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)，Vit K2對(duì)多種惡性腫瘤細(xì)胞有生長(zhǎng)抑制作用，包括結(jié)腸癌、肺癌、乳腺癌細(xì)胞[2]，并可誘導(dǎo)肝細(xì)胞癌、卵巢癌等多種實(shí)體瘤和白血病、骨髓增生異常綜合征的細(xì)胞凋亡，具有明顯的抗腫瘤作用，且與多種抗腫瘤藥有協(xié)同作用。Vit K2抗腫瘤療效已在許多臨床研究中得到驗(yàn)證，Vit K2及其衍生物對(duì)肝癌細(xì)胞有抑制作用，對(duì)肝癌術(shù)后復(fù)發(fā)和生存率也有一定的影響。如Xia J等[3]以PKC亞型特異性抑制劑或siRNA處理人肝癌 Huh7細(xì)胞，加入四烯甲萘醌(Vit K2類(lèi)似物)，觀察到VitK2可通過(guò)抑制TPA誘導(dǎo)的N-kappaB的活化來(lái)抑制癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。Ishizuka等[4]將101例HCC經(jīng)根治術(shù)后患者隨機(jī)分為Vit K2組和對(duì)照組，患者術(shù)前γ-脫羧基凝血酶原均正常，結(jié)果顯示，對(duì)照組在12、24、36個(gè)月累積存活率分別為81.3%、0、0，而Vit K2組為78.3%、58.1%、31.0%，提示Vit K2對(duì)患者的生存有益。Vit K2還可誘導(dǎo)急性髓系白血病細(xì)胞系的凋亡和分化。Kitagawa等[5]將ACR(視黃醇)和Vit K2聯(lián)合發(fā)現(xiàn)其呈劑量依賴(lài)性抑制HL-60細(xì)胞(人早幼粒細(xì)胞白血病細(xì)胞)的增殖。Wei-xing等[6]將人胃癌裸鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、Vit K2治療組、貝那普利治療組和聯(lián)合治療組(Vit K2+貝那普利)，發(fā)現(xiàn)聯(lián)合治療組的凋亡指數(shù)升高，抗腫瘤效果顯著優(yōu)于維生素K2組或貝那普利組。這都提示Vit K2具有明顯的抗腫瘤作用。而關(guān)于Vit K2的抗腫瘤機(jī)制則說(shuō)法較多，包括Vit K2參與線粒體電子信號(hào)的傳遞、影響B(tài)cl-2蛋白、影響caspase家族誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、調(diào)節(jié)G1期相關(guān)的細(xì)胞周期分子的表達(dá)等[7]，但均存有爭(zhēng)議，這些均很大程度上影響Vit K2的應(yīng)用和研究。

Vit K2直接抗腫瘤的作用還需進(jìn)一步研究驗(yàn)證，但近年來(lái)VK被證實(shí)可用于降低骨折風(fēng)險(xiǎn)，如在一項(xiàng)納入55例患者的雙盲研究中發(fā)現(xiàn)，平均每天攝入45 mg Vit K2的患者其血中羧化骨鈣素含量明顯高于對(duì)照組(安慰劑組)[8]。Cockayne S等[9]作了Meta分析，共包括775名患者，結(jié)果顯示，MK4(VK2-4)可以明顯降低骨折風(fēng)險(xiǎn)。這可能可以減少腫瘤骨轉(zhuǎn)移病中的骨相關(guān)事件，甚至改善生存期。

維生素K2(Vit K2/MK，甲萘醌)來(lái)源于食物或由人體腸道菌群產(chǎn)生，嚴(yán)格來(lái)說(shuō)，Vit K2不是一種必需的維生素，它可由人體腸道內(nèi)正常定植的菌群利用維生素K1轉(zhuǎn)化合成，主要來(lái)源于革蘭陰性菌屬，包括擬桿菌、丙酸桿菌以及乳酸菌等。一般來(lái)說(shuō)，只有在特定人群才需要額外補(bǔ)充Vit K2，比如有特殊基因型、絕經(jīng)后女性[10]、或患特殊代謝性疾病的人群等等。因此，如果因?yàn)榧膊∮绊懟蛩幬锔深A(yù)導(dǎo)致腸道功能紊亂，將會(huì)一定程度上減少Vit K2的生成?；熥鳛槿橄侔┑闹匾委熓侄沃唬闹委熥饔貌粌H表現(xiàn)在對(duì)腫瘤細(xì)胞的直接殺滅作用，同時(shí)也影響了腫瘤細(xì)胞賴(lài)以生存的機(jī)體內(nèi)環(huán)境，其中，腸道生態(tài)環(huán)境即為內(nèi)環(huán)境研究的重要方面，臨床上常見(jiàn)消化道不良反應(yīng)。腸道上皮組織是一種更新快的組織，平均3～5天就要更新一次，對(duì)化療十分敏感。研究發(fā)現(xiàn)，化療可通過(guò)直接損傷腸粘膜細(xì)胞、破壞腸粘膜免疫功能以及造成腸道菌群紊亂等多種機(jī)制損傷胃腸道，引起化療不良反應(yīng)，嚴(yán)重者可影響化療的順利進(jìn)行，降低療效[10]。

中醫(yī)對(duì)腫瘤有“因虛致瘤”“扶正積自消”等見(jiàn)解，因此有“扶正抗瘤”一說(shuō)。歷代醫(yī)家扶正尤重調(diào)補(bǔ)脾腎，扶正法的代表藥物大多為健脾益腎之物，如黃芪、人參、淮山藥等，此類(lèi)健脾中藥的抗腫瘤研究機(jī)制主要為調(diào)節(jié)消化道功能，增加胃腸酶的分泌(液淀粉酶、胰淀粉酶)，提高小腸吸收功能，促進(jìn)RNA蛋自質(zhì)的合成、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞壞死、凋亡等等。但這僅為單藥分析階段，尚不能解釋扶正法復(fù)方如參芪扶正液的抗瘤機(jī)制。參芪扶正液主要成分是黃芪、黨參，具有益氣健脾之用。作為扶正法的代表，研究已表明參芪扶正液在降低毒副反應(yīng)、改善生活質(zhì)量的同時(shí)，亦可改善短期療效。目前其“增效機(jī)制”尚不明確，本研究中治療組化療前后維生素K2含量無(wú)明顯變化，提示參芪扶正液對(duì)腸道功能的保護(hù)，可能解釋了扶正藥物對(duì)化療增效的機(jī)制，與中醫(yī)所倡導(dǎo)的健脾“扶正抗瘤”理論相一致。

本研究尚存在許多不足之處，一是樣本量不足，雖然治療組和對(duì)照組的代謝物譜在化療后發(fā)生的差異各不相同，2組臨床療效亦顯示有參芪扶正液干預(yù)的治療組略?xún)?yōu)于對(duì)照組，但差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，因此無(wú)法作代謝組學(xué)變化與療效的相關(guān)性分析，目前僅限于探討階段；二是未設(shè)立健康組，文獻(xiàn)報(bào)道提示乳腺癌患者本身與健康人的血清代謝組學(xué)存在差異，本研究所納入均為乳腺癌患者，分為對(duì)照組和治療組，結(jié)果兩組化療后的代謝組學(xué)差異僅表示參芪扶正液組與單純化療組之間存在差異，但卻不能提示治療組的代謝物譜是否更接近健康人；三是未詳細(xì)評(píng)價(jià)治療的不良反應(yīng)，僅作療效與代謝物改變的關(guān)系探討，以上問(wèn)題亟待進(jìn)一步改進(jìn)。

綜上所述，根據(jù)本研究的代謝組學(xué)分析結(jié)果，重點(diǎn)圍繞代謝物維生素K2與參芪扶正液對(duì)化療“增效”對(duì)扶正法抗腫瘤的機(jī)制展開(kāi)論述，提示扶正法可能是通過(guò)維持腸道環(huán)境穩(wěn)態(tài)，進(jìn)而保護(hù)機(jī)體抗腫瘤的有利因子Vit K2而實(shí)現(xiàn)抗瘤目的的，有待進(jìn)一步的研究驗(yàn)證。代謝組學(xué)作為一門(mén)新興學(xué)科，仍有很多問(wèn)題亟待解決，但隨著其技術(shù)的不斷成熟和研究的深入，代謝組學(xué)可越來(lái)越多地發(fā)現(xiàn)腫瘤發(fā)生及轉(zhuǎn)移過(guò)程中關(guān)鍵的代謝產(chǎn)物，為腫瘤的靶向治療開(kāi)辟了新思路，真正實(shí)現(xiàn)腫瘤個(gè)體化治療。

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（責(zé)任編輯：劉淑婷）

R737.9

A

0256-7415（2016）12-0136-05

10.13457/j.cnki.jncm.2016.12.058

2016-08-20

廣東省中醫(yī)藥管理局資助重點(diǎn)項(xiàng)目（2012年）；廣東省中醫(yī)藥管理局資助項(xiàng)目（2013年）

林曉潔（1989-），女，醫(yī)學(xué)碩士，住院醫(yī)師，研究方向：中醫(yī)藥防治乳腺病。

司徒紅林，E-mail：sthl666@163.com。