薛曉麗,費(fèi)洋,張心慧,宋海燕 ,張克勤*

(1. 長(zhǎng)白山動(dòng)植物資源利用與保護(hù)吉林省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；2.吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院中藥學(xué)院；3. 吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院實(shí)驗(yàn)中心, 吉林 吉林 132101)

大孔吸附樹(shù)脂分離純化貫葉連翹中的金絲桃素

薛曉麗1，3,費(fèi)洋2,張心慧1，3,宋海燕1，3,張克勤1，3*

(1. 長(zhǎng)白山動(dòng)植物資源利用與保護(hù)吉林省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；2.吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院中藥學(xué)院；3. 吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院實(shí)驗(yàn)中心, 吉林 吉林 132101)

以貫葉連翹粗提浸膏為材料，考察六種大孔吸附樹(shù)脂分離純化金絲桃素的性能。采用靜態(tài)、動(dòng)態(tài)吸附方法篩選樹(shù)脂，以中壓分離方法確定分離純化的條件。結(jié)果表明：HZ-801樹(shù)脂以其高吸附率、高洗脫率成為優(yōu)選的分離填料，其最佳分離純化條件為：進(jìn)樣液質(zhì)量濃度為0.1125 g/mL,進(jìn)樣速度為5.0 mL/min、洗脫速度為20 mL/min，0～95%乙醇溶液梯度洗脫，金絲桃素的純度為79.11%。HZ-801可以較好分離純化金絲桃素，純化工藝具有較大實(shí)踐性及參考價(jià)值。

大孔吸附樹(shù)脂;分離純化;金絲桃素;貫葉連翹

金絲桃素 ( hypericin)是二蒽酮類物質(zhì)，是金絲桃屬Euhypericum組和Campyloporus組植物中最具生物活性的成分，具有抑制中樞神經(jīng)和鎮(zhèn)靜的作用[1-3]。近來(lái)研究表明，金絲桃素對(duì)于癌癥的光化學(xué)治療[4]、艾滋病[5-6]、抑郁癥[7-8]、禽流感[9]、抗雞球蟲(chóng)病[10-11]等的治療具有明顯的作用。但金絲桃素不穩(wěn)定的特性，即氧、光、溫度、pH均對(duì)其生物活性產(chǎn)生較大影響，故其提取率及分離純化的技術(shù)受到制約[12]，遠(yuǎn)遠(yuǎn)滿足不了終端產(chǎn)品的需要。黃英等[13]采用S898吸附樹(shù)脂分離純化金絲桃素粗品中金絲桃素，其含量達(dá)到4.26%。王曙陽(yáng)等[14]采用100～200目硅膠分離純化貫葉連翹全草中金絲桃素，其含量為1.08%。王曉菊等[15]用D101大孔吸附樹(shù)脂分離純化金絲桃素粗提物，其含量為2.13%。王海燕等[16]采用HZ-816大孔吸附樹(shù)脂將貫葉連翹提取物中金絲桃素的含量由0.33%提高至90%以上。由此可見(jiàn)，不同的樹(shù)脂對(duì)金絲桃素的分離純化效果差異顯著。本研究以D101、AB-8、HZ-801、HZ-818、HZ-806、X-5等六種大孔吸附樹(shù)脂為填料，分析金絲桃素的靜態(tài)、動(dòng)態(tài)吸附性能，并在中壓分離系統(tǒng)中進(jìn)行條件優(yōu)化，為金絲桃素純化的工業(yè)化發(fā)展提供理論數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 貫葉連翹粗提取物購(gòu)于西安康培基生物科技有限公司。

1.2 儀器與試劑 紫外分光光度計(jì)(島津 UV-2450)、恒溫?fù)u床(武漢中科 HQ45Z)、電子天平(梅特勒 AL204)、超純水機(jī)(密理博-Q3)、高效液相色譜儀(島津 LC-20AD)、中壓分離系統(tǒng)(步琪C-660)、層析柱、金絲桃素標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)于成都瑞芬思生物科技有限公司(生產(chǎn)批號(hào)：J-023-140913)，純度≥98%。D101、AB-8、HZ-801、HZ-818、HZ-806、X-5均購(gòu)于天津光復(fù)精細(xì)化工研究所。石油醚(60～90℃)、乙醇、氫氧化鈉、鹽酸等均分析純，購(gòu)于天津永大化學(xué)試劑有限公司，去離子水、超純水(實(shí)驗(yàn)室自制)。

1.3 方法

1.3.1 樣品前處理 將貫葉連翹粗提取物過(guò)20目篩后保存于-18℃冰箱備用。使用前陰干至恒重，用石油醚在55℃脫脂3 次，干燥后，在80℃、甲醇體積分?jǐn)?shù)90%、液固比75∶1條件下提取105 min，獲得金絲桃素含量為3.71%提取液[17]，將提取液在40℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去大部分溶劑制成金絲桃素粗提浸膏。

1.3.2 大孔吸附樹(shù)脂的預(yù)處理 將六種樹(shù)脂用95%乙醇浸泡24 h充分溶脹除雜，用蒸餾水洗滌至水澄清；用5%鹽酸浸泡4 h，用蒸餾水洗滌至中性；用5%氫氧化鈉浸泡4 h，用蒸餾水洗滌至中性，儲(chǔ)存水中，備用。六種樹(shù)脂性質(zhì)見(jiàn)表1。

表1 六種樹(shù)脂物理性能參數(shù)

1.3.3 金絲桃素含量的測(cè)定 精密稱取金絲桃素對(duì)照品5.10 mg，加甲醇定容至25 mL的容量瓶中，搖勻，配成質(zhì)量濃度0.204 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)母液，準(zhǔn)確量取適量標(biāo)準(zhǔn)母液定容至10 mL容量瓶中，配成濃度為1.280～20.40 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。將標(biāo)準(zhǔn)溶液過(guò)0.22 μm濾膜后注入高效液相色譜儀(HPLC)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，即：Y=49030.17X+224.7382，R=0.9999。其中Y為峰面積，X為金絲桃素質(zhì)量濃度。

1.3.4 靜態(tài)吸附量與解吸率考察 根據(jù)文獻(xiàn)方法[18]，精確稱取六種預(yù)處理后用濾紙擦干的樹(shù)脂各5.00 g，分別放入6個(gè)具塞錐形瓶中，各加入金絲桃素溶液(1.2 g浸膏溶于150 mL 70%乙醇溶液中)25 mL，放入恒溫?fù)u床，35 ℃，125 r/min振蕩24 h，過(guò)濾，濾液過(guò)0.22 μm濾膜后注入HPLC檢測(cè)金絲桃素的含量，計(jì)算每種樹(shù)脂的靜態(tài)吸附量。

Q靜=(C0-C濾)×V/m….(1) 其中Q靜為靜態(tài)吸附量(μg/g);C0、C濾為吸附前、吸附后的金絲桃素質(zhì)量濃度(μg/mL)；V溶液體積(mL); m為樹(shù)脂質(zhì)量(g)

將上述吸附飽和的樹(shù)脂用蒸餾水洗至無(wú)色后，加入70%乙醇100 mL置于恒溫?fù)u床上，35 ℃ 125 r/min振蕩24 h，過(guò)濾，濾液過(guò)0.22 μm濾膜后注入HPLC檢測(cè)金絲桃素的含量，計(jì)算每種樹(shù)脂的靜態(tài)解吸附率。

S靜=(C2V2/ Q總)×100%….(2) 其中 S靜為靜態(tài)解吸附率%；C2為洗脫液中金絲桃素質(zhì)量濃度(μg/mL);V2洗脫液體積(mL); Q總—為靜態(tài)吸附總量(μg)

1.3.5 動(dòng)態(tài)吸附量及解吸率考察 根據(jù)文獻(xiàn)方法[18]，將預(yù)處理后用濾紙擦干的三種樹(shù)脂濕法裝柱(∮2.5 cm×30 cm)，用金絲桃素浸膏溶液(1.0 g金絲桃素浸膏溶于10 mL 70%乙醇溶液中)緩慢上樣，另加1 cm樹(shù)脂保護(hù)(在層析柱上端鋪上兩層圓形小濾紙片防止樹(shù)脂被沖散)，靜置120 min后，將樣品液以1 mL/min的速率流出，過(guò)0.22 μm濾膜后注入HPLC檢測(cè)金絲桃素含量，按公式(1)計(jì)算每種樹(shù)脂動(dòng)態(tài)吸附量。

依次用30%、40%、50%、60%、70%、80%、95% 不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液進(jìn)行洗脫，流速控制在2 mL/min至洗脫液無(wú)色后，將各洗脫液過(guò)0.22 μm濾膜后分別注入HPLC檢測(cè)金絲桃素含量，計(jì)算動(dòng)態(tài)解吸附率。

S動(dòng)=(∑ C×V/Q總)×100%….(3) 其中S動(dòng)為動(dòng)態(tài)解吸附率%，C為每個(gè)體積分?jǐn)?shù)乙醇洗脫液中含有金絲桃素的質(zhì)量濃度(μg/mL);V每個(gè)洗脫液體積(mL);Q總為動(dòng)態(tài)吸附總量(μg)

1.3.6 純化條件 將預(yù)處理后的HZ-801樹(shù)脂裝入中壓層析柱中(∮2.5 cm×45 cm)，利用中壓分離系統(tǒng)，以70%乙醇溶液做為洗脫劑，分別取0.075、0.1125、0.15 g/mL金絲桃素粗提液以3.0、5.0、7.0 mL/min速度進(jìn)樣，以15.0、20.0、25.0 mL/min的速度洗脫來(lái)優(yōu)化進(jìn)樣質(zhì)量濃度、進(jìn)樣速度、洗脫速度等條件，按590 nm處吸光度值A(chǔ)收集流分，出現(xiàn)泄漏點(diǎn)時(shí)停止(泄漏點(diǎn)即A值為原液A值的十分之一時(shí))。在確定好的進(jìn)樣濃度、進(jìn)樣速度、洗脫速度下，按照梯度洗脫方法設(shè)置洗脫液比例，從而確定最佳洗脫梯度。1.3.7 色譜條件 根據(jù)文獻(xiàn)方法[19]，Symmetry-C18 (4.6 mm×250 mm，5 μm)色譜柱；流動(dòng)相為甲醇-6.0 mmol/L磷酸氫二鈉(用磷酸調(diào)pH至6.5)(87.5∶12.5, v/v)。柱溫：30℃；流速：1.0 mL/min；進(jìn)樣量20 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)：590 nm。

2 結(jié)果與分析

2.1 靜態(tài)吸附 用HPLC測(cè)得金絲桃素浸膏溶液中金絲桃素的濃度為19.2457 μg/mL，每份樹(shù)脂中金絲桃素的質(zhì)量為481.1425 μg。

表2 靜態(tài)吸附量及解吸附率(n=5)

表3 靜態(tài)吸附量的方差分析

*P<0.001，差異顯著

表2的數(shù)據(jù)表明：HZ-801樹(shù)脂對(duì)金絲桃素的吸附能力最高為45.11 μg/g，X-5樹(shù)脂對(duì)金絲桃素的吸附能力最低為25.60 μg/g。大孔吸附樹(shù)脂的吸附量與樹(shù)脂的極性、空間結(jié)構(gòu)(孔徑、比表面積、孔容等)及被吸附物質(zhì)的性質(zhì)、分子大小、結(jié)構(gòu)等有著重要的關(guān)系[13]。將弱極性D101、AB-8樹(shù)脂歸為第一族，HZ系列三種樹(shù)脂歸為第二族，X-5為第三族，用Matlab7.1軟件進(jìn)行方差分析，族分析結(jié)果見(jiàn)表3。P<0.001，差異顯著。故選用HZ-801、HZ-806、HZ-818三種樹(shù)脂進(jìn)行動(dòng)態(tài)吸附試驗(yàn)。

2.2 動(dòng)態(tài)吸附 由圖1可知：50%～95%體積分?jǐn)?shù)的乙醇洗脫液中均含有金絲桃素，將金絲桃素峰面積代入1.3.3下的標(biāo)準(zhǔn)曲線后得到濃度并由此計(jì)算各洗脫液的解吸附率，三種樹(shù)脂在不同體積分?jǐn)?shù)乙醇洗脫液下的動(dòng)態(tài)吸附量及解吸附率見(jiàn)表4。

圖1 金絲桃素標(biāo)準(zhǔn)品及不同體積分?jǐn)?shù)乙醇洗脫液的高效液相色譜圖

動(dòng)態(tài)吸附總量/μg解吸附率/%總解吸附率/%洗脫液50%60%70%80%95%HZ-818686．499．3110．0332．6514．4813．6080．07HZ-806884．149．0110．2335．3420．4115．4790．46HZ-8011105．537．7914．9471．144．95-98．82

-為未檢出金絲桃素

表4的數(shù)據(jù)表明：三種樹(shù)脂對(duì)金絲桃素均有較好的動(dòng)態(tài)吸附能力，其中HZ-801樹(shù)脂吸附能力較強(qiáng)，其解吸附率也較高為98.82%。故確定HZ-801為分離金絲桃素最佳的樹(shù)脂。同時(shí)，HZ-801樹(shù)脂在95%體積分?jǐn)?shù)的乙醇洗脫液中未檢出金絲桃素，說(shuō)明該樹(shù)脂選擇性好，為分離金絲桃素最佳填料并由此確定70%乙醇溶液為最佳洗脫劑。

2.3 分離純化條件

2.3.1 進(jìn)樣液質(zhì)量濃度優(yōu)化 圖2表明0.15 g/mL的進(jìn)樣液質(zhì)量濃度過(guò)大致使金絲桃素在層析柱中來(lái)不及吸附就被洗脫液帶出，進(jìn)樣8 min，3個(gè)BV就出現(xiàn)泄漏點(diǎn)；0.075 g/mL的進(jìn)樣液質(zhì)量濃度過(guò)小致使金絲桃素洗脫困難，進(jìn)樣22 min，接近9個(gè)BV消耗440 mL 洗脫液后才出現(xiàn)泄漏點(diǎn)，浪費(fèi)試劑；0.1125 g/mL的進(jìn)樣液濃度進(jìn)樣14 min ，6BV出現(xiàn)泄漏點(diǎn)，而且吸光度值比較均勻，故選用該濃度為最佳進(jìn)樣液質(zhì)量濃度。

圖2 進(jìn)樣液質(zhì)量濃度對(duì)分離效果的影響

2.3.2 進(jìn)樣速度 如圖3所示，3.0 mL/min的進(jìn)樣速度能使樣品中金絲桃素很好的吸附在填料上，造成洗脫困難，22 min,9個(gè)BV出現(xiàn)泄漏點(diǎn)；7.0 mL/min的進(jìn)樣速度太快，使樣品中金絲桃素沒(méi)及時(shí)吸附在填料上，就被洗脫液帶出，7 min,3個(gè)BV出現(xiàn)泄漏值；5.0 mL/min的進(jìn)樣速度能使樣品中金絲桃素很好的吸附在填料上，12 min,5個(gè)BV出現(xiàn)泄漏值,洗脫也比較容易。故選5.0 mL/min的進(jìn)樣速度為最佳進(jìn)樣速度。

圖3 進(jìn)樣速度對(duì)分離效果的影響

2.3.3 洗脫速度 圖4可知，洗脫速度對(duì)分離有較大的影響，速度過(guò)快，金絲桃素從層析柱上過(guò)早下來(lái)，25 mL/min的洗脫速度使金絲桃素只在層析柱中保留9 min,4BV就出現(xiàn)泄漏點(diǎn)，15 mL/min的洗脫速度使洗脫液的解吸附能力減小，25 min，11個(gè)BV還沒(méi)出現(xiàn)泄漏點(diǎn)。故選擇20 mL/min洗脫速度為最佳洗脫速度。

圖4 洗脫速度對(duì)分離效果的影響

2.3.4 梯度洗脫條件的優(yōu)化 以HZ-801樹(shù)脂為

填料，在進(jìn)樣液質(zhì)量濃度0.1125 g/40 mL、進(jìn)樣速度5.0 mL/min、洗脫速度20 mL/min、70%體積分?jǐn)?shù)乙醇為洗脫劑條件下，得到的分離產(chǎn)物經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮后干燥得固體1.57 g，測(cè)得其金絲桃素的含量為53.22%，為了進(jìn)一步提高純度，將洗脫液乙醇與水設(shè)置成按照不同比例混合的梯度洗脫，見(jiàn)表5。將此條件下的70%體積分?jǐn)?shù)乙醇洗脫液經(jīng)過(guò)濃縮、真空干燥后得固體1.05 g，含量提高至79.11%。

表5 梯度洗脫程序

圖5 梯度洗脫的高效液相色譜圖

驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果表明，三次純化的結(jié)果分別是75.151%、78.314%、79.824%，RSD為2.38%，說(shuō)明該方法準(zhǔn)確有效，可以用來(lái)純化金絲桃素，能夠?yàn)榻鸾z桃素的工業(yè)化實(shí)施提供理論數(shù)據(jù)。

3 討論與小結(jié)

靜態(tài)吸附的試驗(yàn)結(jié)果表明，HZ-801、HZ-806、HZ-818三種樹(shù)脂均對(duì)金絲桃素有較好的吸附能力，方差分析表明HZ系列樹(shù)脂與其他三種樹(shù)脂之間存在著顯著差異(P<0.001)。動(dòng)態(tài)吸附的試驗(yàn)結(jié)果表明,HZ-801樹(shù)脂的動(dòng)態(tài)吸附總量為1105.53 μg，解吸附率為98.82%，為最佳填料，70%體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液為最佳洗脫劑。在中壓分離系統(tǒng)上確定出0.1125 g/mL進(jìn)樣液質(zhì)量濃度、5.0 mL/min的進(jìn)樣速度及20 mL/min洗脫速度為最佳優(yōu)化工藝，在此工藝下，用70%體積分?jǐn)?shù)乙醇進(jìn)行洗脫時(shí)金絲桃素的含量為53.22%，是原提取液含量3.71%的14倍[17]，說(shuō)明70%體積分?jǐn)?shù)的乙醇洗脫液不僅將金絲桃素洗脫下來(lái)也帶出了較多的雜質(zhì)。將洗脫劑設(shè)置為梯度洗脫后，水、40%、95%體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液分別能將更多極性較大或較小的雜質(zhì)帶出，純化率提高了25.89%，達(dá)到79.11%。測(cè)定實(shí)際的純化率為77.763%，RSD為2.38%，說(shuō)明HZ-801大孔吸附樹(shù)脂可以很好的分離金絲桃素，優(yōu)化后的工藝能有效的純化金絲桃素，其結(jié)果與王海燕研究結(jié)果一致[16]，也符合康毅華等[20]用HZ-818大孔樹(shù)脂較好富集山楂總黃酮的研究結(jié)果，說(shuō)明HZ系列大孔吸附樹(shù)脂主要由于范德華力或氫鍵的作用對(duì)多酚物質(zhì)具有較好的吸附性。應(yīng)在此基礎(chǔ)上對(duì)金絲桃素的純化進(jìn)行小試、中試，為金絲桃素分離純化的工業(yè)化發(fā)展提供技術(shù)支持。與以往文獻(xiàn)報(bào)道一致的是梯度洗脫已經(jīng)成為金絲桃素純化較好的洗脫方法[15]，通過(guò)梯度洗脫，將洗脫液按照不同比例混合使其極性發(fā)生變化可以起到較好的除雜、純化作用。另有文獻(xiàn)指出硅膠[14]、聚酰胺更有利于金絲桃素的純化，有待進(jìn)一步研究。

但需要注意的是本試驗(yàn)中金絲桃素的分離純化均是在弱光條件下完成，今后課題組會(huì)進(jìn)一步研究氧、pH值、光等對(duì)金絲桃素分離純化的影響，并以此為突破口，期待金絲桃素的純度能有更大的提高，進(jìn)一步改進(jìn)工藝便于工業(yè)化生產(chǎn)的進(jìn)行。

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(編輯：陳希)

Separation and Purification of Hypericin inHypericumperforatumL. by Macroporous Adsorption Resins

XUE Xiao-li1，3,FEI Yang2,ZHANG Xin-hui1，3,SONG Hai-yan1，3,ZHANG Ke-qin1，3*

(1.JilinProvinceKeyLaboratoriesinuniversitiesforUsingandProtectingofAnimalandPlantResourcesinChangBaimountain,JilinJilin, 132101,China; 2.TraditionalChinesemedicineCollegeofJilinAgriculturalScienceandTechnologyUnivercity,JilinJilin, 132101,China;3.ExperimentCenterofJilinAgriculturalScienceandTechnologyUnivercity,JilinJilin,132101,China)

To investigate the performance of hypericin in 6 macroporous adsorption resin by separating and purificatingHyperforinperforatumL. in crude extrects.The static adsorption and the dynamic adsorption are used in investigation of macroporous adsorption resin and the MV separation system is used in studying the condition of separation and Purification. The results showed that HZ-801 was the best separation filler for its high absorption rate and high elution rate. The optimum conditions for separation and purification: the concentration of sample extracts is 0.1125 g/ mL, the injection rate is 5.0 mL/min, the elution rate is 20 mL/min, ethanol gradient is 0%～95% and the purity of hypericin is 79.11%. Macroporous adsorption resin HZ-801 can be better separated and purified hypericin and the optimized process has better practical and reference value .

macroporous resins; purification; hypericin;HypericumperforatumL.

吉林省科技計(jì)劃重點(diǎn)項(xiàng)目( 20140204055yy)

薛曉麗，副教授，從事天然產(chǎn)物中有效成分的分離與分析研究。

張克勤。E-mail:Keqinzhang@hotmail.com

2016-05-19

A

1002-1280 (2016) 07-0020-06

S853.74