黃小潔，楊承槐，劉丹，陳曉春，侯力丹，李啟紅，李慧姣，李俊平

(中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081)

SYBR GreenⅠ實(shí)時(shí)熒光PCR法檢測(cè)禽活疫苗中禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥病毒

黃小潔，楊承槐，劉丹，陳曉春，侯力丹，李啟紅，李慧姣*，李俊平*

(中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081)

為快速、準(zhǔn)確檢測(cè)禽活疫苗中的禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥病毒(REV)，根據(jù)REV p30基因上的一段保守序列，利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)合成了1對(duì)特異性引物，建立了基于SYBR Green I 模式的實(shí)時(shí)熒光PCR 方法，并以常規(guī)PCR產(chǎn)物為標(biāo)準(zhǔn)品繪制了標(biāo)準(zhǔn)曲線，對(duì)方法的特異性、敏感性、重復(fù)性、與經(jīng)典方法的符合率進(jìn)行了評(píng)價(jià)。結(jié)果表明：擴(kuò)增產(chǎn)物片段大小為222 bp，與預(yù)期片段大小相符，測(cè)序結(jié)果證實(shí)為REV靶序列；標(biāo)準(zhǔn)曲線具有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為1.0，擴(kuò)增效率為94.2%，溶解溫度Tm=(86.0±0.50)℃，無(wú)引物二聚體；該方法只從REV陽(yáng)性樣本檢出擴(kuò)增信號(hào)，其他病原無(wú)擴(kuò)增信號(hào)，特異性好；最低可檢測(cè)26.97拷貝數(shù)的陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品，比常規(guī)PCR敏感1000倍；組內(nèi)變異系數(shù)、組間變異系數(shù)分別為0.79%～5.36%，1.61%～5.25%。運(yùn)用建立的實(shí)時(shí)熒光PCR方法對(duì)17批禽用活疫苗進(jìn)行檢測(cè)，并與間接免疫熒光法(IFA)進(jìn)行同步比較試驗(yàn)，結(jié)果兩者符合率為100%。且實(shí)時(shí)熒光PCR法更快捷、更方便，結(jié)果判定更為直觀可用于疫苗中REV污染情況的監(jiān)測(cè)。

網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥病毒；實(shí)時(shí)熒光PCR；禽活疫苗

禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥(RE)是指由反轉(zhuǎn)錄病毒科網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥病毒(REV)引起的禽類(lèi)以急性網(wǎng)狀細(xì)胞腫瘤、生長(zhǎng)抑制綜合癥、淋巴組織和其他組織的慢性腫瘤形成為特征的一群病理綜合癥。REV屬正反轉(zhuǎn)錄病毒科，γ反轉(zhuǎn)錄病毒屬，為單股、正鏈、線性RNA。REVS基因組RNA是由兩個(gè)30～40S的RNA亞單位的60～70復(fù)合體組成[1]，分離株存在3個(gè)明顯的亞型，網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增殖病病毒 T株(REV-T 株)、脾壞死病毒(SNV)和鴨傳染性貧血病毒(DIAV)、雞合胞體病毒(CSV)[2]，不同毒株具有相同的抗原性。

普遍認(rèn)為疫苗中污染REV是引起該病傳播和流行的主要原因，而且國(guó)內(nèi)外均有因REV污染疫苗引起嚴(yán)重?fù)p失的案例和報(bào)道[3-6]。因此，為了保證病毒性生物制品安全有效，對(duì)禽源活疫苗進(jìn)行REV污染檢測(cè)是確保疫苗產(chǎn)品質(zhì)量，防止REV傳播的有效手段。本實(shí)驗(yàn)參考2010年版《中華人民共和國(guó)獸藥典》[7]對(duì)禽源生物制品外源病毒檢驗(yàn)的各項(xiàng)檢驗(yàn)要求，建立了SYBR GreenⅠ實(shí)時(shí)熒光PCR法以檢測(cè)禽活疫苗中禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥病毒。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病毒 REV MD-2株、傳染性法氏囊病毒(IBD)、傳染性支氣管炎病毒(IB)、禽呼腸孤病毒(ARV)、新城疫病毒(NDV)、禽白血病(ALV)病毒均由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 SPF雞胚 9日齡SPF雞胚購(gòu)自北京梅里亞維通實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司

1.1.3 主要試劑 高純度質(zhì)粒小提中量試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、蛋白酶K溶液、Top10感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)于天根生化科技有限公司；OMEGA總RNA提取試劑盒，購(gòu)于OMEGA公司；pMD18-T載體、Ex Taq DNA聚合酶、dNTPs、Maker Ⅴ、T4 DNA連接酶；SYBR?Premix Ex TaqTM試劑盒、PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒均購(gòu)自大連寶生物(Takara)工程有限公司；瓊脂糖購(gòu)自Invitrogen公司；無(wú)水乙醇、苯酚、氯仿、異戊醇均購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)。

1.1.4 其他材料 抗REV特異性血清由中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所生產(chǎn)；FITC標(biāo)記的兔抗雞Ig G購(gòu)自Sigma公司；SPF雞胚購(gòu)自梅里亞維通實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。

1.1.5 禽活疫苗樣品 雞痘活疫苗6批(鵪鶉化弱毒株)；雞新城疫、傳染性支氣管炎二聯(lián)活疫苗2批；雞傳染性法氏囊病活疫苗2批；雞新城疫中等毒力活疫苗(I系)3批；傳染性喉氣管炎活疫苗1批；小鵝瘟活疫苗(GD)株1批；鴨瘟活疫苗1批；雞馬立克氏病火雞皰疹病毒活疫苗1批。

2 方法

2.1 制作雞胚成纖維細(xì)胞 參照《中華人民共和國(guó)獸藥典》[7]附錄方法制作。

2.2 REV SYBY GreenⅠ實(shí)時(shí)熒光PCR 的建立

2.2.1 病毒增殖 REV MD-2株接種雞胚成纖維細(xì)胞，放于5%CO2、37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng), 每隔3 d傳代一次，連傳2代，-80 ℃保存。2.2.2 引物設(shè)計(jì) 在p30基因上選取一段保守序列，用Primer Version 5.00軟件設(shè)計(jì)引物，由華大基因(中國(guó)北京)合成，擴(kuò)增目的基因片段長(zhǎng)度為222 bp。引物序列如下：上游引物：5’-CGAGCGAGAAATAGAAGC-3’；下游引物：5’ -GTCCGATAAGCCTGATAGA-3’。

2.2.3 標(biāo)準(zhǔn)品的制備

2.2.3.1 前病毒DNA提取 用酚-氯仿法[8]提取REV的前病毒DNA。2.2.3.2 PCR擴(kuò)增 在25 uL體系中進(jìn)行：反應(yīng)管中依次加入ddH2O 16.3 μL，10×Buffer 2.5 μL，dNTP 2 μL，上游引物1 μL，下游引物1 μL，ExTaq酶0.2 μL，病毒DNA 2 μL。反應(yīng)在94 ℃預(yù)變性2 min，然后按以下參數(shù)(變性：94 ℃ 30 s；退火：55 ℃ 30 s；延伸：72 ℃ 30 s)進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，循環(huán)結(jié)束后72 ℃延伸10 min，同時(shí)以ddH2O為陰性對(duì)照。

2.2.3.3 標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒制備 將鑒定正確的PCR 產(chǎn)物采用普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒進(jìn)行純化回收，回收產(chǎn)物與pMD-18T載體進(jìn)行連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌(Top10)，通過(guò)克隆、篩選，選擇出陽(yáng)性菌液，送測(cè)序，測(cè)序正確的的菌液用質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒做為標(biāo)準(zhǔn)品。

2.2.3.4 反應(yīng)條件和反應(yīng)體系 參照試劑盒說(shuō)明采用SYBR Green I 染料法，按照Takara 試劑盒說(shuō)明推薦的反應(yīng)體系，以最小的Ct 值和最高的熒光值(ΔRn)及熔解曲線不出現(xiàn)非特異性峰、最大程度提高擴(kuò)增效率為標(biāo)準(zhǔn)，25 uL反應(yīng)體系的條件為：95 ℃ 30 s ；95 ℃ 5 s；55 ℃ 30 s；72 ℃ 30 s ，共40個(gè)循環(huán)，最后進(jìn)行溶解曲線分析。反應(yīng)體系見(jiàn)表1。

表1 SYBR Green I 實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)體系

2.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 分別以經(jīng)過(guò)回收純化的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒作為標(biāo)準(zhǔn)品，用BECKMAN紫外分光光度計(jì)測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的D260 nm、D280 nm值及在260 nm條件下的核酸濃度，并計(jì)算D260 nm與D280nm的比值。根據(jù)濃度與拷貝數(shù)之間的換算關(guān)系:拷貝數(shù)=濃度×阿伏加德羅常數(shù)/(一個(gè)堿基對(duì)的平均分子質(zhì)量×總長(zhǎng)度)，阿伏加德羅常數(shù)為6.02×1023，計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)品的拷貝數(shù)。用雙蒸水將標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行10倍連續(xù)稀釋?zhuān)⑦x取7個(gè)稀釋梯度的標(biāo)準(zhǔn)品，進(jìn)行SYBR Green I實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)，構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.2.5 特異性試驗(yàn) 使用OMEGA 公司總RNA提取試劑盒提取REV、IBD、IB、ND、ARV 、ALV的RNA，按照PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒說(shuō)明操作將上述RNA合成cDNA，應(yīng)用已建立的SYBR GreenⅠ實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法進(jìn)行檢測(cè)，驗(yàn)證方法的特異性。

2.2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 選取3批10倍連續(xù)稀釋的6個(gè)稀釋梯度的標(biāo)準(zhǔn)品作為模板，應(yīng)用已建立的SYBR GreenⅠ實(shí)時(shí)熒光PCR方法進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)同一批次，6個(gè)稀釋梯度的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行3次批內(nèi)重復(fù)；不同批次，相同稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行3次批間重復(fù)，得出Ct值并計(jì)算Ct值的變異系數(shù)CV。

2.2.7 敏感性試驗(yàn) 取7個(gè)稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)品，應(yīng)用已建立的SYBR GreenⅠ實(shí)時(shí)熒光PCR方法在BIO-RAD IQTM5實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增，以出現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)擴(kuò)增曲線的最高稀釋倍數(shù)的模板Ct值來(lái)推算其最小檢出量。

2.3 普通PCR敏感性試驗(yàn) 用2.1.2建立的常規(guī)PCR方法對(duì)2.1.7中7個(gè)稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行檢測(cè)，并與SYBR Green I 實(shí)時(shí)PCR 檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比較。

2.4 熒光定量PCR法與間接免疫熒光方法(IFA)最低病毒檢出量比較 將REV MD-2株進(jìn)行10倍連續(xù)稀釋?zhuān)?.01 TCID50、0.1 TCID50、1 TCID50、10 TCID50四個(gè)梯度病毒含量的病毒接種CEF細(xì)胞，放入5%CO2、37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)1～5 d，每天收集上清，分別運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光PCR法和間接免疫熒光法IFA方法[7]進(jìn)行檢測(cè)，確定兩種方法對(duì)病毒的最低檢出量。

2.5 臨床初步應(yīng)用 分別運(yùn)用建立的SYBR GreenⅠ實(shí)時(shí)熒光PCR方法和IFA法，對(duì)17批禽活疫苗樣品進(jìn)行檢測(cè)，比較兩種方法檢測(cè)結(jié)果的符合率。

3 結(jié)果

3.1 病毒PCR擴(kuò)增結(jié)果 采用設(shè)計(jì)的引物對(duì)提取的DNA進(jìn)行常規(guī)PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物用1.2%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，出現(xiàn)222 bp的特異性擴(kuò)增條帶，與預(yù)計(jì)的目的片段大小一致。

M：Marker V；1：REV MD-2株；2：去離子水圖1 MD-2株P(guān)CR擴(kuò)增結(jié)果

3.2 熒光定量PCR引物的驗(yàn)證 以標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)，對(duì)反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行的熔點(diǎn)曲線分析表明，熒光定量PCR產(chǎn)物的Tm=(86.0±0.50)℃，無(wú)引物二聚體，只出現(xiàn)了一個(gè)特異性的吸收峰(圖2)，該引物反應(yīng)性能良好。

3.3 SYBR Green I 實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增曲線和標(biāo)準(zhǔn)曲線 用BECKMAN紫外分光光度計(jì)測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的D260nm/D280nm值為1.99，濃度為65.65 μg/mL，根據(jù)濃度與拷貝數(shù)的換算關(guān)系，標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的拷貝數(shù)為2.697×1011copies /μL。3.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的構(gòu)建 選取2.697×109～2.697×103copies/μL共7個(gè)稀釋梯度的標(biāo)準(zhǔn)品作為模板進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)，生成擴(kuò)增曲線(圖3)。對(duì)擴(kuò)增曲線進(jìn)行處理繪制出熒光定量反應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖4)，標(biāo)準(zhǔn)曲線公式為y=-3.768x-4.541，其斜率為-3.768，截距為-4.541，相關(guān)系數(shù)為1.0，反應(yīng)擴(kuò)增效率為94.2%。

1-7：2.697×109～2.697×103 copies/μL標(biāo)準(zhǔn)品圖3 熒光定量PCR擴(kuò)增曲線

FAM E= 94.2% Squared=1.000 Slope=-3.768 y-Intercept=-4.541圖4 熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線

3.3.2 特異性試驗(yàn)結(jié)果 應(yīng)用已建立的熒光定量PCR方法，對(duì)REV與IBD、IB、ARV、NDV、ALV一起作為模板進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)，結(jié)果表明，只有REV出現(xiàn)了明顯的擴(kuò)增曲線，其余樣品均沒(méi)有出現(xiàn)擴(kuò)增曲線(圖5)，表明檢測(cè)方法的特異性良好。

1：REV 2：IBD 3：IB 4：ARV 5：NDV 6：ALV圖5 熒光定量PCR特異性試驗(yàn)結(jié)果

3.3.3 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果 選取2.697×107～2.697×102copies/μL共6個(gè)稀釋梯度的標(biāo)準(zhǔn)品為模板進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)，對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品分別做3次批內(nèi)、批間重復(fù)，獲得擴(kuò)增曲線(圖6和圖7)。PCR擴(kuò)增結(jié)束后獲得樣品Ct值，組內(nèi)變異系數(shù)為0.79%～5.36%；組間變異系數(shù)為1.61%～5.25%，符合重復(fù)性實(shí)驗(yàn)要求。

圖6 批內(nèi)重復(fù)試驗(yàn)結(jié)果

圖7 批間重復(fù)試驗(yàn)結(jié)果

3.3.4 敏感性試驗(yàn)結(jié)果 將標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行10倍連續(xù)稀釋?zhuān)?.697×106～2.697×100copies/μL 7個(gè)稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)品做為模板，在實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果顯示，該方法最低可檢出2.697×101copies/μL的標(biāo)準(zhǔn)品(圖8)。3.4 常規(guī)PCR敏感性試驗(yàn)結(jié)果 常規(guī)PCR對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品的最低檢出量為2.697×104copies/μL(圖9)，熒光定量PCR的敏感性是常規(guī)PCR的1000倍。

1-7：2.697×106～2.697×100 copies/μL標(biāo)準(zhǔn)品圖8 熒光定量PCR敏感性試驗(yàn)結(jié)果

1-7：2.697×106～2.697×100copies/μL；8：去離子水；M：Marker V圖9 常規(guī)PCR敏感性試驗(yàn)結(jié)果

3.5 實(shí)時(shí)熒光PCR法和IFA方法最低病毒檢出量結(jié)果 實(shí)時(shí)熒光PCR方法最低能在0.1 TCID50的REV感染CEF細(xì)胞后2 d檢出，而IFA方法只能在1 TCID50的REV感染CEF后3 d檢出(表1)。

表1 實(shí)時(shí)熒光PCR和IFA法最低病毒檢出量結(jié)果

-表示陰性；+表示陽(yáng)性

3.6 IFA方法檢測(cè)疫苗中的REV結(jié)果 有1批疫苗(雞馬立克氏病火雞皰疹病毒活疫苗)出現(xiàn)特異性綠色熒光，其余16批被檢樣品接種孔均未出現(xiàn)特異性綠色熒光(圖10)。

A.陽(yáng)性樣品檢測(cè)結(jié)果; B.陰性樣品檢測(cè)結(jié)果圖10 疫苗樣品IFA檢測(cè)結(jié)果

3.7 實(shí)時(shí)熒光PCR法檢測(cè)結(jié)果及與IFA方法的檢測(cè)結(jié)果比較 圖11顯示，1批雞馬立克氏病火雞皰疹病毒活疫苗樣品經(jīng)實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)出現(xiàn)擴(kuò)增曲線，拷貝數(shù)為9.5×106copies/μL，其余16批疫苗樣品均未出現(xiàn)擴(kuò)增曲線，與IFA方法檢測(cè)結(jié)果一致，符合率達(dá)到100%。

1～6：2.697×109～2.697×104copies/μL模板； 7：REV陽(yáng)性血清； 8：雞馬立克氏病火雞皰疹病毒活疫苗樣品； 9：其他樣品圖11 疫苗樣品熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果

4 討論

根據(jù)2010年版《中華人民共和國(guó)獸藥典》中外源病毒檢驗(yàn)要求，我國(guó)疫苗外源病毒檢驗(yàn)主要有雞胚檢查法、細(xì)胞檢查法和雞檢查法等三種方法。一般情況下，只需采用雞胚檢查法和細(xì)胞檢查法進(jìn)行外源病毒檢驗(yàn)，如檢驗(yàn)無(wú)結(jié)果或結(jié)果可疑時(shí)，才使用雞檢查法[9]。本實(shí)驗(yàn)室成功建立了REV IFA檢測(cè)方法，已被《中國(guó)獸藥典》收錄，完善了我國(guó)禽活疫苗檢驗(yàn)方法，為疫苗質(zhì)量監(jiān)管提供有力的技術(shù)手段。然而，此方法需要對(duì)疫苗樣品進(jìn)行中和處理(不同種類(lèi)疫苗處理方法不同)，接種CEF傳代，再進(jìn)行IFA檢測(cè)，耗時(shí)比較長(zhǎng)，需要約兩周左右的時(shí)間。并且操作過(guò)程中，容易出現(xiàn)因洗滌不徹底而存在非特異熒光，影響結(jié)果判定。近年來(lái)，實(shí)時(shí)熒光定量PCR法因其特異性好、靈敏度高、快速簡(jiǎn)便、高精度、高通量、易于標(biāo)準(zhǔn)化等優(yōu)點(diǎn)，廣泛被運(yùn)用于病原檢測(cè)研究中。國(guó)內(nèi)有采用REV LTR片段設(shè)計(jì)引物，建立基于 SYBR Green I 模式的實(shí)時(shí)熒光 PCR 方法(Real-time PCR SYB)[10]的報(bào)道，其敏感性是普通PCR的1000倍。

本研究從p30基因上選取一段片段為222 bp保守片段設(shè)計(jì)引物，片段長(zhǎng)度適中，符合熒光定量片段擴(kuò)增的要求。引物特異性好，重復(fù)實(shí)驗(yàn)變異系數(shù)低，敏感性高，與LTR片段相似，敏感性是普通PCR的1000倍，避免了常規(guī)PCR敏感性不高及凝膠成像儀分辨率低等原因造成結(jié)果假陰性的問(wèn)題。與經(jīng)典的IFA方法比較，實(shí)時(shí)熒光PCR方法最低能在0.01 TCID50的REV感染CEF細(xì)胞后的3 d檢出，而IFA方法只能在1 TCID50的REV感染CEF后的3 d檢出，由此可見(jiàn)，實(shí)時(shí)熒光PCR方法敏感性高于IFA法。IFA方法不僅耗時(shí)長(zhǎng)，且步驟繁瑣，檢驗(yàn)結(jié)果容易受到細(xì)胞培養(yǎng)、熒光染色等多種因素的影響。實(shí)時(shí)熒光PCR法不需要對(duì)樣品進(jìn)行任何處理，直接從樣本中提取RNA，體外反轉(zhuǎn)錄成cDNA即可檢測(cè)，可在2 h 內(nèi)對(duì)樣品做出定性和定量的檢測(cè)和鑒定，整個(gè)操作過(guò)程一天內(nèi)可完成，結(jié)果可疑當(dāng)天便可重檢。本試驗(yàn)運(yùn)用建立的實(shí)時(shí)熒光PCR方法對(duì)疫苗樣品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果與IFA方法的檢測(cè)結(jié)果完全符合。

綜上所述，實(shí)時(shí)熒光PCR法操作簡(jiǎn)單、快捷，敏感性高，結(jié)果可定量，用于活疫苗REV外源病毒檢測(cè)結(jié)果與經(jīng)典方法結(jié)果完全符合，說(shuō)明運(yùn)用該方法對(duì)活疫苗進(jìn)行REV外源病毒檢可行性強(qiáng)。本次實(shí)驗(yàn)樣品數(shù)據(jù)比較少，我們將在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中增加樣品檢測(cè)量，積累更為豐富的檢測(cè)數(shù)據(jù)。

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(編輯：李文平)

Detection of Avian Reticuloendotheliosis Virus of Avian Live Vaccine by SYBR Green Real-time PCR

HUANG Xiao-jie，YANG Cheng-huai，LIU Dan,CHEN Xiao-chun，HOU Li-dan，LI Qi-hong，LI Hui-jiao*，LI Jun-ping*

(ChinaInstituteofVeterinaryDrugControl,Beijing100081,China)

In order to detect avian reticuloendotheliosis virus(REV) of avian live vaccine quickly and accurately，a pair of specific primer was designed and synthesized using Primer Premier 5.0 according to conservative sequence of REV p30 gene in this study. The real-time PCR method based on the SYBR Green I pattern(Real-time PCR)was developed.The standard curve was constructed by using the product of conventional PCR,the specificity, sensitivity, reproducibility and the coincidence rate to IFA were evaluated. The result showed that the length of the PCR product was 222 bp as expected and the amplified sequence was approved to be identical with the REV target sequence. The standard curve had a good linear relationship, the correlation coefficient was 1.0 and the amplification efficiency was 94.2%. Melting peak appeared at (86.8±0.5)℃ without primer-dimer. This method only detected amplified signals from REV positive sample,so it was identified to have good specificity. The standard curve covered a linear range of 2.697×109～2.697×103copies. The minimum copy of the positive sample detected was 26.97, 1000 times more sensitive than the conventional PCR. The coefficient of variations (CVs) of intra assay and inter assay were in the range of 4.80%～5.72% and 0.75%～3.87%, respectively. The real-time PCR was used to detect 17 batches of avian live vaccine, comparing with indirecting immunofluorescence(IFA).The results showed that the coincidence rate of these two methods was 100%. This real time PCR method has been proven to be a useful tool for the detection of REV in avian live vaccine because it was more rapid,more convenient and more intuitive.

REV；real-time PCR；avian live vaccine

黃小潔，從事實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理工作。

李慧姣，E-mail: lihuijiao@ivdc.org.cn;李俊平, E-mail: lijunping@ivdc.org.cn

2015-05-28

A

1002-1280 (2016) 07-0007-07

S855.3