王濤 羅強 張世榮 龍乾發(fā)

·論著·

骨髓間充質(zhì)干細胞移植對大鼠癲癇海馬神經(jīng)炎癥的抑制作用研究

王濤 羅強 張世榮 龍乾發(fā)

目的 探討骨髓間充質(zhì)干細胞（BMSCs）移植對大鼠癲癇海馬神經(jīng)炎癥的抑制作用。方法 體外分離純化SD大鼠BMSCs，BMSCs處理的無血清αMEM和單純無血清αMEM分別設(shè)為實驗組和對照組，而后應(yīng)用ELISA檢測BMSCs培養(yǎng)基中抗炎細胞因子單核細胞趨化蛋白-1（MCP-1）和腫瘤壞死因子-α-刺激基因-6（TSG-6）的表達。匹羅卡品腹腔注射誘導(dǎo)大鼠癲癇模型，側(cè)腦室注射5×106個BMSCs和同體積生理鹽水分別設(shè)為實驗組和對照組，未經(jīng)處理的SD大鼠設(shè)為正常對照，4 d后免疫組織化學(xué)檢測各組海馬小膠質(zhì)細胞或活化的小膠質(zhì)細胞表達變化。單因素方差分析檢測各組數(shù)據(jù)差異，組間數(shù)據(jù)比較采用獨立 t檢驗。結(jié)果 BMSCs條件培養(yǎng)基中MCP-1（61.8 ±15.64）pg/ml和TSG-6（1.3±0.12）ng/ml的表達較對照組明顯上升（P ＜ 0.01）。匹羅卡品誘導(dǎo)癲癇模型后，小膠質(zhì)細胞胞體和突起所占面積百分比（39.2％± 7.68％）較正常對照組（11.7％±3.47％）明顯增多（P ＜ 0.01），且ED1染色發(fā)現(xiàn)小膠質(zhì)細胞明顯活化。BMSCs移植4 d后，小膠質(zhì)細胞和活化的小膠質(zhì)細胞表達較癲癇對照組明顯下降（P ＜0.01）。結(jié)論 BMSCs具有旁分泌抗炎細胞因子的潛能，其移植對大鼠癲癇海馬神經(jīng)炎癥具有明顯抑制作用。

腦炎； 骨髓； 間質(zhì)干細胞； 旁分泌； 癲癇

癲癇是大腦神經(jīng)元突發(fā)性異常放電引起的慢性神經(jīng)功能障礙綜合征，危害世界約5 000萬人口的生命健康，其中我國約900萬人受影響，因此癲癇已成為我國乃至全球范圍內(nèi)最常見的神經(jīng)系統(tǒng)疾病之一[1]。隨著醫(yī)學(xué)科學(xué)的發(fā)展，抗癲癇藥物、手術(shù)、神經(jīng)刺激等使60％～ 70％的癲癇患者病情得以控制，但仍有約1/3的患者對藥物不敏感或手術(shù)等治療作用有限[2]。骨髓間充質(zhì)干細胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）源于發(fā)育早期中胚層和外胚層，因其具有多向分化潛能、低免疫原性、旁分泌功能等生物學(xué)特性，已成為目前研究最為廣泛的干細胞之一，且被發(fā)現(xiàn)在癲癇中具有重要的治療潛能[3]。前期研究證實BMSCs移植對癲癇海馬中間神經(jīng)元損傷具有明顯保護作用，但移植細胞在海馬中的分化替代作用并不明顯[4-5]，越來越多的證據(jù)表明BMSCs治療疾病的基礎(chǔ)主要源于其旁分泌作用特別是免疫調(diào)節(jié)功能[6]。盡管癲癇的病理機制不清，可能包括神經(jīng)炎癥、線粒體損傷、氧化應(yīng)激、血腦屏障受損等，其中以小膠質(zhì)細胞活化為代表的神經(jīng)炎癥被認為是癲癇海馬中間神經(jīng)元損傷的重要原因[7-8]。但國內(nèi)外關(guān)于BMSCs移植對癲癇海馬神經(jīng)炎癥的治療作用未見報道，因此本研究假設(shè)BMSCs移植對癲癇模型海馬神經(jīng)炎癥具有抑制作用。

材料和方法

一、材料

1.實驗動物：35只4 ～ 6周雄性SD大鼠購于西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部實驗動物中心，動物飼養(yǎng)及操作均遵循實驗動物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。

2. BMSCs準(zhǔn)備：BMSCs準(zhǔn)備參照參考文獻[9]報道的方法。主要方法如下：4只SD大鼠充分麻醉后，無菌條件下取股骨和脛骨骨髓，加入等體積的Histopaques-1077（美國Sigma-Aldrich公司）分離液，400×g離心25 min收集交界面單核細胞，阿爾法最小基本培養(yǎng)基（α-Minimum Essential Medium, αMEM）+10％FBS培養(yǎng)（37℃，5％ CO2）7～10 d，細胞融合達70％～ 80％傳代，以此類推。BMSCs表面抗原CD105、CD90、CD73、CD34和 CD11b（相應(yīng)抗體購于北京博奧森公司，使用濃度1∶100）檢測應(yīng)用流式細胞術(shù)；成骨（美國Gibco公司，A1007201）、成軟骨（美國Gibco公司，A1007101）或成脂肪（美國Gibco公司，A1007001）分化試劑盒用于檢測BMSCs的多能分化潛能。第3代BMSCs應(yīng)用于細胞移植。

3. ELISA檢測：第3代BMSCs用無血清αMEM培養(yǎng)48 h，收集培養(yǎng)基，而后用0.22 μm小濾器（millipore）過濾待檢，同時未經(jīng)細胞培養(yǎng)的αMEM為陰性對照。根據(jù)單核細胞趨化蛋白-1（monocyte chemotactic protein 1，MCP-1）（ERMCP1，美國Thermo公司）和腫瘤壞死因子-α-刺激基因-6（tumor necrosis factor-α-stimulated gene 6，TSG-6）（MBS705965，美國Biocompare公司）ELISA試劑盒說明分別加入樣品、酶結(jié)合物和底物，37℃孵育2 h后洗滌顯色，酶標(biāo)比色儀（美國Thermo公司）比色分析。

二、方法

1. 大鼠癲癇模型建立及BMSCs移植：匹羅卡品誘導(dǎo)癲癇模型建立如參考文獻[4]所報道，25只SD大鼠分別腹腔注射127 mg/kg的氯化鋰（美國Sigma-Aldrich公司），18 h后，1 mg/kg的甲基東莨菪堿皮下注射以降低毛果蕓香堿的外周膽堿能作用，30 min后，腹腔注射40 mg/kg的匹羅卡品誘發(fā)癲癇，癲癇4 ～ 5級發(fā)作（抽搐不能站立或摔倒）后2 h，予以10 mg/kg地西泮皮下注射終止。30 min后癲癇大鼠分別接受10 μl生理鹽水稀釋的BMSCs（2次，共計5×106BMSCs）（實驗組，n = 9）和10 μl生理鹽水（2次，共計20 μl）（對照組，n = 8）側(cè)腦室注射（中線旁開1.5 mm前囟后1 mm，進針深度距硬膜4.5 mm），癲癇造模死亡率32％（8/25）。剩余6只未經(jīng)處理的SD大鼠設(shè)為正常對照。

2. 免疫組織化學(xué)：各組SD大鼠接受細胞或生理鹽水處理4 d（基于該時間點為炎癥高峰期）后死亡率為12％（3/25），而后實驗組（n = 8）、對照組（n = 6）和正常對照（n = 6）分別斷頭取腦組織，4％多聚甲醛固定并石蠟包埋，橫向石蠟切片（厚度30 μm），組織切片染色選擇前囟后2.64 mm ～ 5.40 mm海馬顯著部位[9]，二甲苯脫蠟和酒精水化后，檸檬酸高溫高壓修復(fù)抗原。3％過氧化氫處理20 min后，0.1％ Triton-X 100和10％的馬血清封閉30 min，而后添加山羊抗Iba1（CD68）（Catalog # ab5076，Abcam）或小鼠抗ED-1（Catalog # MACA341R，Bio-Rad Laboratories）孵育24 h（4℃）。過氧化物酶反應(yīng)應(yīng)用相應(yīng)二抗（均購于Vector）室溫孵育1 h和ABC試劑（Vector）處理后，DAB或vector SG（Cat#SK-4700，Vector）顯色，脫水透明處理后封片觀察。免疫熒光反應(yīng)應(yīng)用驢抗山羊CY3（Cat#118790，Jackson）或驢抗小鼠CY2（Cat#55046，Jackson）孵育2 h，DAPI封片照相。陰性對照用PBS替代一抗。Image-Pro plus 6.0軟件分析各陽性細胞所占面積百分比，每組取8或6只大鼠，每只隨機選取5個海馬切片（×20）。

三、統(tǒng)計學(xué)分析方法

采用SPSS 16.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)分析，細胞因子濃度和陽性細胞所占面積百分比表達采用± s表示，使用單因素方差分析合并Bonferroni和 LSD檢驗，組間數(shù)據(jù)比較采用獨立 t檢測。以P ＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

圖1 抗炎細胞因子分泌和小膠質(zhì)細胞表達

一、BMSCs培養(yǎng)鑒定

骨髓單核細胞經(jīng)貼壁培養(yǎng)7 ～ 10 d即可達70％～ 80％融合，傳第2代后細胞基本純化，多呈紡錘形或梭形，第3代細胞經(jīng)流式細胞術(shù)檢測顯示CD105（98.8％），CD73（96.5％）和CD90（97.2％）強表達，CD34（0.24％）和CD11b（0.92％）基本不表達。同時多能誘導(dǎo)顯示細胞具有成骨、成軟骨和成脂肪分化特性。

二、BMSCs旁分泌結(jié)果

ELISA結(jié)果顯示，相比陰性對照，αMEM經(jīng)BMSCs培養(yǎng)48 h后，所含抗炎性細胞因子MCP-1（61.80±15.64 pg/ml，圖1a）和TSG-6（1331.00± 116.53 ng/ml，圖1b）濃度明顯升高（*P ＜ 0.05；**P ＜0.001，圖1a，b），尤其是TSG-6增高的濃度顯著。

三、BMSCs抑制小膠質(zhì)細胞活化

免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，SD大鼠經(jīng)匹羅卡品腹腔注射誘導(dǎo)癲癇后，經(jīng)小膠質(zhì)細胞特異性抗體Iba1染色發(fā)現(xiàn)（圖2b，e），細胞胞體明顯增大，突起增多，陽性細胞所占面積百分比（39.2％±7.68％）明顯多于正常對照（11.7％±3.47％）（圖2a，d）（P ＜0.01，圖1c）。同時活化的小膠質(zhì)細胞特異性抗體ED1染色結(jié)果顯示，正常對照組中ED1（圖3a，d）表達不明顯，癲癇海馬ED1明顯增多（圖3b，e）（P ＜0.01，圖1d）。BMSCs移植后，癲癇海馬Iba1（圖2c，f）和ED1（圖2c，f）的表達均出現(xiàn)明顯下降（P ＜ 0.01，與癲癇對照比較；圖1c，d）。同時免疫熒光染色結(jié)果顯示（圖4），癲癇對照組ED1（圖4b）完全與Iba1陽性細胞（圖4a）共定位（圖4c），且較多表達于海馬CA1區(qū)。BMSCs移植后，Iba1陽性細胞（圖4d）除胞體明顯收縮外，只見較少ED1（圖4e）與Iba1共存（圖4f）。

圖2 倒置顯微鏡下觀察BMSCs經(jīng)Iba1免疫組化后細胞形態(tài)

圖3 倒置顯微鏡下觀察BMSCs經(jīng)ED1免疫組化后細胞形態(tài)

圖4 熒光顯微鏡下觀察Iba1和ED1細胞形態(tài) （免疫熒光染色×40）

討 論

癲癇海馬小膠質(zhì)細胞活化可釋放炎性細胞因子如白介素-1/6、腫瘤壞死因子受體-α或細胞毒性物質(zhì)如一氧化氮、活性氧等[8]，這些物質(zhì)一方面可通過阻斷N-甲基-D-天冬氨酸受體（N-methyl-D-aspartate receptor，NMDAR）介導(dǎo)的谷氨酸鹽重吸收功能產(chǎn)生谷氨酸毒性[8]，另一方面可與海馬神經(jīng)細胞表面受體如Toll樣受體等結(jié)合激活NMDAR引發(fā)Ca2+內(nèi)流導(dǎo)致神經(jīng)元過度興奮，因此越來越多的研究支持海馬炎癥是癲癇形成的重要原因[9-10]。Iba1和ED1分別為小膠質(zhì)細胞和活化的小膠質(zhì)細胞特異性抗體，且都在神經(jīng)炎癥中具有重要表達意義[11]。結(jié)合本研究ED1和Iba1在癲癇模型的表達變化，再次證實海馬炎癥是癲癇形成的重要病理過程。

間充質(zhì)干細胞在再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中占有重要地位，特別是其旁分泌相關(guān)的免疫調(diào)節(jié)功能。盡管研究表明BMSCs具有分泌MCP-1、TSG-6、前列腺素E2、轉(zhuǎn)化生長因子-β等旁分泌功能[6]，但是不同來源、代數(shù)、生長條件的BMSCs生物學(xué)特性各異[12]。因此本實驗為證實BMSCs的旁分泌潛能，同時基于MCP-1可增強調(diào)節(jié)性T細胞活性[13]，TSG-6能促進白介素-10和誘生型一氧化氮合酶表達抑制免疫反應(yīng)[14]等，挑選MCP-1和TSG-6作為抗炎檢測因素，實驗通過條件培養(yǎng)基ELISA檢測證實大鼠BMSCs培養(yǎng)可顯著提高抗炎性細胞因子MCP-1和TSG-6的表達，尤其是TSG-6的高表達提示其潛在的旁分泌-免疫調(diào)節(jié)功能。進而通過體內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)BMSCs移植后，Iba1和ED1陽性細胞在癲癇海馬的表達效率明顯下降，特別是ED1作為活化的小膠質(zhì)細胞抗體，通常也為神經(jīng)炎癥的標(biāo)記物[8]，因此結(jié)果表明BMSCs明顯抑制以小膠質(zhì)細胞活化為代表的癲癇海馬神經(jīng)炎癥。此外國內(nèi)外研究顯示，BMSCs移植后在癲癇海馬內(nèi)不發(fā)揮細胞分化替代作用[3-5]，結(jié)合本實驗中BMSCs條件培養(yǎng)基中抗炎細胞因子的表達變化，綜合提示BMSCs的旁分泌作用可能是細胞發(fā)揮抗癲癇海馬神經(jīng)炎癥的主要原因。但MCP-1或TSG-6是否為BMSCs抗癲癇海馬神經(jīng)炎癥的確定因素還待進一步探明，如利用siRNA降解BMSCs中的MCP-1或TSG-6觀察其治療潛能，將在后續(xù)試驗中繼續(xù)驗證?？傊?，本研究證實BMSCs具有旁分泌抗炎細胞因子的特性和抑制癲癇海馬神經(jīng)炎癥的功能。

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Bone marrow mesenchymal stem cells inhibite rat epilepsy-induced hippocampal neuroinflammation

Wang Tao, Luo Qiang, Zhang Shirong, Long Qianfa. Department of Neurosurgery, Xi'an Central Hospital, School of Medicine, Xi’an Jiao Tong University, Xi'an 710003, China

Long Qianfa, Email: lonva@live.cn

Objective To explore the inhibitory effects of transplanted bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) on neuroinflammation in a rat model of epilepsy. Methods BMSCs were isolated from SD rats. The concentrations of anti-inflammatory cytokines such as monocyte chemotactic protein 1 (MCP-1) and tumor necrosis factor-α-stimulated gene 6 (TSG-6) in BMSCs conditioned medium were measured using ELISA. Epileptic model was induced by intraperitoneal injection of Pilocarpine, the experimental group and control group received tralateroventricular injection of 5×106BMSCs and same volume of saline respectively. 4 days later, immunohistochemistry was employed to detect the expression of microglia and activated microglia in hippocampus of different groups. One way ANOVA was used to test the variance of the data and the differences between groups were compared using Student's t-test. Results Both MCP-1 (61.8±15.64）pg/ml and TSG-6 (1.3±0.12）ng/ml in BMSCs conditioned medium were remarkably higher than the control medium (P ＜ 0.01). After SD rats were induced by pilocarpine for 4 days,the area fractions of soma and processes of hippocampal microglia （39.2％±7.68％）increased signigicantly in comparison to the normal control （11.7％±3.47％）(P ＜ 0.01), and the activatation of ed microglia was confirmed by ED1 staining as well. Nevertheless, after BMSCstransplantation, microglia and activated microglia significantly decreased (P ＜ 0.01) in comparison to the epileptic model. Conclusion BMSCs transplantation is capable of inhibiting the epilepsyinduced hippocampal neuroinflammation.

Encephalitis； Bone marrow；Mesenchymal stem cells ； Paracrine；Epilepsy

2016-07-05）

（本文編輯：李少婷）

10.3877/cma.j.issn.2095-1221.2016.06.003

陜西省科學(xué)技術(shù)研究發(fā)展計劃項目（2014KJXX-29）

710003 西安市中心醫(yī)院神經(jīng)外科

龍乾發(fā)，Email：lonva@live.cn

王濤，羅強，張世榮，等. 骨髓間充質(zhì)干細胞移植對大鼠癲癇海馬神經(jīng)炎癥的抑制作用研究[J/CD].中華細胞與干細胞雜志∶電子版, 2016, 6(6)∶339-344.