王國強，王秋文，樊春光，劉超齊，常 娟，尹清強*，王二柱，盧富山(.南陽農(nóng)業(yè)職業(yè)學院，河南 南陽 7000； .河南農(nóng)業(yè)大學 牧醫(yī)工程學院，河南 鄭州 5000； ．河南德鄰生物制品有限公司，河南 新鄉(xiāng)5000； ．河南省飼料微生物工程技術(shù)研究中心，河南 周口66000)

復合益生菌發(fā)酵豆粕的技術(shù)參數(shù)優(yōu)化

王國強1，王秋文2，樊春光2，劉超齊2，常 娟2，尹清強2*，王二柱3，盧富山4
(1.南陽農(nóng)業(yè)職業(yè)學院，河南 南陽 473000； 2.河南農(nóng)業(yè)大學 牧醫(yī)工程學院，河南 鄭州 450002； 3．河南德鄰生物制品有限公司，河南 新鄉(xiāng)453000； 4．河南省飼料微生物工程技術(shù)研究中心，河南 周口466000)

為了降低豆粕中抗營養(yǎng)因子的含量，從而使其營養(yǎng)價值得到進一步提高，應用復合益生菌發(fā)酵豆粕。利用四因素三水平的正交試驗設計，確定豆粕的最佳發(fā)酵參數(shù)為：異常漢遜酵母菌︰枯草芽孢桿菌︰干酪乳桿菌為2∶2∶1，接種量5%，發(fā)酵時間為48 h。在此條件下，豆粕中的抗原蛋白降解徹底，酸溶蛋白含量提高了73.9%，有益活菌總數(shù)達到8.5×108cfu/g，明顯提高了豆粕的營養(yǎng)價值。

益生菌； 豆粕； 發(fā)酵； 技術(shù)參數(shù)

豆粕是一種優(yōu)質(zhì)的植物蛋白飼料，其氨基酸組分均衡，一直是飼料工業(yè)和養(yǎng)殖業(yè)中重要的蛋白質(zhì)原料。但豆粕中也含有許多種抗營養(yǎng)因子(胰蛋白酶抑制因子、抗原蛋白、不良寡糖等)，對動物生長發(fā)育造成一些負面的影響，尤其對幼齡動物的影響更大[1]。因此，尋找消除豆粕中抗營養(yǎng)因子的方法，是飼料工業(yè)和養(yǎng)殖業(yè)急需解決的問題。

利用微生物發(fā)酵豆粕主要是以豆粕為原料，接種單一或多種微生物，或與一些蛋白酶進行復合，通過微生物的發(fā)酵或蛋白酶的酶解作用，可有效地消除或降低豆粕中的抗營養(yǎng)因子，同時還可把大分子大豆蛋白降解為易被動物消化和吸收的小分子多肽類物質(zhì)和蛋白質(zhì)。在微生物發(fā)酵的過程中，不僅含有大量的益生菌，而且還產(chǎn)生一些維生素、有機酸及未知生長因子等，可以提高飼料的適口性，調(diào)節(jié)動物胃腸道微生物區(qū)系，提高飼料中營養(yǎng)物質(zhì)特別是蛋白質(zhì)的消化和利用率，提高動物生產(chǎn)性能，減少腹瀉等消化道疾病[2-5]。前人的研究結(jié)果表明，利用芽孢桿菌發(fā)酵豆粕飼喂仔豬，可顯著提高其日增質(zhì)量和采食量[6]；豆粕經(jīng)A.usamii發(fā)酵后，其中的植酸磷被完全降解[7]；豆粕經(jīng)米曲霉發(fā)酵后，其中的大分子抗原蛋白和胰蛋白酶抑制因子的含量顯著降低[8]。可見，發(fā)酵豆粕具有較大的潛在價值。為了降低豆粕中的抗營養(yǎng)因子、提高其營養(yǎng)價值，選用枯草芽孢桿菌、干酪乳桿菌和異常漢遜酵母，進行高效復合后對豆粕進行微生物發(fā)酵，以豆粕中抗原蛋白的降解情況、酸溶蛋白含量及活菌數(shù)為判定指標，確定復合微生物發(fā)酵豆粕的最佳配合比例和發(fā)酵時間以及最適接種量，旨在為發(fā)酵豆粕的規(guī)?；a(chǎn)提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 供試菌株

本研究所用的異常漢遜酵母、枯草芽孢桿菌和干酪乳桿菌，購自中國科學院微生物研究所，并由河南農(nóng)業(yè)大學牧醫(yī)工程學院動物營養(yǎng)與飼料生物技術(shù)研究室保存。

1.2 培養(yǎng)基

枯草芽孢桿菌培養(yǎng)選用LB培養(yǎng)基：葡萄糖2%、蛋白胨1.4%、氯化鈉0.48%。

異常漢遜酵母培養(yǎng)采用YPD培養(yǎng)基：酵母浸提物1.5%、蛋白胨2%、葡萄糖1.5%。

培養(yǎng)乳酪桿菌選用MRS培養(yǎng)基：胰蛋白胨1.5%、酵母浸出物1.2%、葡萄糖1.5%、磷酸氫二鉀0.2%、乙酸鈉0.4%、檸檬酸鈉0.25%、硫酸鎂150 mg/L、硫酸錳55 mg/L，吐溫(80)1 mL/L。

發(fā)酵豆粕所用培養(yǎng)基：稱取豆粕(蛋白質(zhì)含量為46%)60 g，加入玉米粉1.5 g和葡萄糖1.5 g，調(diào)整含水量到45%，置于250 mL的三角瓶中，在0.15 MPa高壓條件下，滅菌20 min后備用。

1.3 試驗設計

采用四因素三水平的正交試驗設計，4個因素分別為：枯草芽孢桿菌、異常漢遜酵母、干酪乳桿菌及微生物發(fā)酵時間，分別用A、B、C和D來表示；3種微生物接種量的3個水平分別為：0、1%和2%，發(fā)酵時間所選用的3個水平為：24 h、48 h和72 h。根據(jù)微生物接種量的多少，采用滅菌的蒸餾水調(diào)配，使每個處理組的含水量一致。試驗共設置9個處理組，每組3個重復，采用需氧發(fā)酵和厭氧發(fā)酵相結(jié)合的方式于37 ℃進行培養(yǎng)，每4 h翻動一次，發(fā)酵至24 h后靜置培養(yǎng)。根據(jù)設計的時間取樣，風干后進行粉碎，過250 μm篩，取篩下來的粉末測定其抗原蛋白的含量、酸溶蛋白的含量以及有益活菌數(shù)，以此作為主要的參考指標，確定各菌種的最佳配比、最適接種量和最佳發(fā)酵時間。

1.4 測定指標及方法

1.4.1 抗原蛋白含量 稱樣品1.0 g，將其浸泡于20 mL的提取液中，在30 ℃搖床上(以100 r/min)浸泡1 h，然后4 000 r/min離心20 min，取上清液，利用SDS-PAGE檢測抗原蛋白。其操作流程如下: 將15 μL浸提的豆粕或發(fā)酵豆粕樣品與15 μL樣品緩沖液等量混勻，100 ℃加熱3～5 min，放在冷水中冷卻，1 000 r/min離心2 min，取15 μL點樣，進行電泳。電泳結(jié)束后，小心輕柔地從電泳板上將膠脫下，放入盒中，加入約5倍體積的染色液浸泡，放在平緩搖動的平臺上室溫染色過夜。倒掉染色液，用脫色液沖洗后，將凝膠浸泡于脫色液中，平緩搖動，每3 h換一次脫色液，直至完全脫色。

1.4.2 酸溶蛋白含量 采用QB/T 2653—2004的方法，樣品用15%三氯乙酸處理后，通過離心把沉淀的大分子蛋白除去，收集留在上清液中分子質(zhì)量在10 ku以下的肽類和氨基酸，利用福林(Folin)-酚法，測定上清液中酸溶蛋白含量[9]。

1.4.3 有益活菌總數(shù) 用生理鹽水將樣品稀釋到1×10-7～1×10-8，取100 μL的稀釋液在含有LB培養(yǎng)基的平皿中涂均勻，在37 ℃下培養(yǎng)48 h后計數(shù)。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用SAS 8.1統(tǒng)計軟件對所有數(shù)據(jù)進行顯著性檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 復合微生物發(fā)酵對豆粕中抗原蛋白的降解作用

從圖1可以看出，普通豆粕和未經(jīng)微生物發(fā)酵的豆粕具有多個抗原蛋白條帶，而經(jīng)微生物發(fā)酵后的豆粕大部分抗原蛋白已消失，大分子質(zhì)量蛋白(>20 ku)幾乎全部降解，說明豆粕經(jīng)復合微生物發(fā)酵后，可明顯地降低抗原蛋白的含量，有利于提高豆粕的營養(yǎng)價值。

M為蛋白質(zhì)Marker； 1—2為未經(jīng)發(fā)酵的豆粕；3—10為復合微生物發(fā)酵的豆粕

2.2 復合微生物發(fā)酵對豆粕中酸溶蛋白含量的影響

表1的正交試驗結(jié)果表明，復合益生菌固態(tài)發(fā)酵豆粕的最優(yōu)組合為A3B3C2D2，其最佳復合微生物發(fā)酵的條件如下：枯草芽孢桿菌∶異常漢遜酵母菌∶干酪乳桿菌=2∶2∶1，微生物總接種量為5%，發(fā)酵時間為48 h。在此發(fā)酵條件下，發(fā)酵豆粕中酸溶蛋白含量達到12.0%，高于未發(fā)酵豆粕73.9%。4個因素對酸溶蛋白的影響順序依次為：枯草芽孢桿菌>異常漢遜酵母菌>發(fā)酵時間>干酪乳桿菌。表2的方差分析結(jié)果表明，3種微生物的接種量及發(fā)酵時間等4個因素，皆極顯著地影響發(fā)酵豆粕中酸溶蛋白含量。

表1 正交試驗測得的發(fā)酵豆粕中酸溶蛋白含量

組別試驗因素枯草芽孢桿菌(A)/%異常漢遜酵母(B)/%干酪乳桿菌(C)/%發(fā)酵時間(D)/h酸溶蛋白含量/%1000246．92011488．43022728．34101728．05112249．861204811．27202489．98210729．292212412．0K123．624．827．328．8K229．027．428．429．5K331．131．528．025．4x17．98．39．19．6x29．79．19．59．8x310．410．59．38．5R2．52．20．41．1

表2 發(fā)酵豆粕中酸溶蛋白含量的正交試驗方差分析

變異來源平方和自由度均方FP校正模型62．987．9233．4<0．0001A29．8214．9442．1<0．0001B22．8211．4338．5<0．0001C0．720．39．60．0014D9．724．8143．4<0．0001誤差0．6180總變異63．626

2.3 發(fā)酵豆粕中活菌數(shù)的檢測

表3的正交試驗結(jié)果表明，發(fā)酵豆粕中活菌總數(shù)最高的組合為A3B3C2D3，與酸溶蛋白條件類似，只是發(fā)酵時間有所延長。其最適發(fā)酵條件如下：枯草芽孢桿菌∶異常漢遜酵母菌∶干酪乳桿菌=2∶2∶1，接種量為5%，最佳發(fā)酵時間為72 h。4個因素對活菌總數(shù)的影響順序依次為：枯草芽孢桿菌>發(fā)酵時間>干酪乳桿菌>異常漢遜酵母菌。表4的方差分析結(jié)果表明，3種微生物的接種量及發(fā)酵時間等4個因素，對發(fā)酵豆粕中活菌總數(shù)的影響均達到了極顯著的水平。綜合考慮發(fā)酵因素對發(fā)酵豆粕品質(zhì)的影響，以酸溶蛋白含量為重點研究對象，把活菌數(shù)作為優(yōu)質(zhì)發(fā)酵豆粕的參考指標。

表3 正交試驗測得的發(fā)酵豆粕中的活菌總數(shù)

表4 發(fā)酵豆粕中活菌數(shù)的正交試驗方差分析

變異來源平方和自由度均方FP校正模型190．7823．82327．0<0．0001A55．7227．82716．2<0．0001B33．4216．71631．8<0．0001C42．8221．42089．1<0．0001D58．8229．42870．8<0．0001誤差0．2180總變異190．926

3 討論

本研究挑選在發(fā)酵豆粕中常用的3種微生物，即異常漢遜酵母、枯草芽孢桿菌及干酪乳桿菌作為發(fā)酵菌株，并利用四因素三水平正交試驗進行復合微生物固態(tài)發(fā)酵豆粕研究。以抗原蛋白的降解、酸溶蛋白含量以及益生菌活菌數(shù)量為指標來優(yōu)化豆粕發(fā)酵的技術(shù)參數(shù)。從試驗結(jié)果可以看出，凡是接種了3種菌的試驗組的大分子蛋白(大于20 ku)幾乎全部降解，之前有研究人員指出，大豆蛋白中的大部分抗營養(yǎng)因子的分子質(zhì)量均在35 ku以上[10]，這說明本研究所制備的發(fā)酵豆粕中大部分抗原蛋白已被降解，具有較高的營養(yǎng)價值。從微生物的配比分析看出，當枯草芽孢桿菌∶異常漢遜酵母菌∶干酪乳桿菌為2∶2∶1時，發(fā)酵48 h酸溶蛋白含量明顯提高，且枯草芽孢桿菌對酸溶蛋白含量的提高起主要作用，可能是由于枯草芽孢桿菌可分泌蛋白酶，將大分子蛋白降解為小肽、游離氨基酸，使酸溶蛋白含量升高。綜合以上結(jié)果以及規(guī)模化生產(chǎn)的實際需求，發(fā)酵豆粕的生產(chǎn)工藝參數(shù)以獲得最大的酸溶蛋白和抗原蛋白降解為主要指標[11-16]。

枯草芽孢桿菌在高效清除了豆粕中的抗營養(yǎng)因子的同時，作為益生菌有助于腸道對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收，抑制致病菌的生長；異常漢遜酵母通過發(fā)酵，可提高發(fā)酵產(chǎn)品的風味，增加動物采食量；干酪乳桿菌發(fā)酵可產(chǎn)生乳酸等酸性物質(zhì)，抑制病原菌的生長，同時還產(chǎn)生酸香氣味，有利于改善飼料的風味及適口性。3種微生物協(xié)同作用，消除了豆粕中的抗原蛋白，提高了豆粕中游離氨基酸含量及其消化吸收率，使豆粕的營養(yǎng)價值得到提升，具有非常重要的意義及廣闊的應用前景。

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Study on Technological Index for Soybean Meal Fermentation with Compound Beneficial Microbes

WANG Guoqiang1,WANG Qiuwen2,FAN Chunguang2,LIU Chaoqi2,CHANG Juan2,YIN Qingqiang2*,WANG Erzhu3,LU Fushan4
(1.Nangyang Vocational College of Agriculture,Nanyang 473000，China; 2.College of Animal Science and Veterinary Medicine,Henan Agricultural University,Zhengzhou 450002，China； 3.Henan Delin Biological Product Co. Ltd., Xinxiang453000，China；4.Henan Engineering and Technology Research Center of Feed Microbes,Zhoukou 466000,China)

In order to decrease anti-nutrition factors and increase nutrient values of soybean meal,four-factor and three-level orthogonal design was used to measure the optimal fermenting indexes.The results showed that the optimal ratio of three species of microbes(Hansenulaanomala,BacillussubtilisandLactobacilluscasei) was 2∶2∶1,microbial inoculation quantity was 5%,and fermenting period was 48 h.Under the above conditions,the antigen protein in soybean meal was degraded wholly,acid-soluble protein content was increased by 73.9%,and the total alive microbes reached 8.5×108cfu/g.This fermentation design could significantly increase nutrient value of soybean meal for enlarging its application in feed factory.

beneficial microbes; soybean meal; fermentation; technological index

2016-03-10

河南省科技攻關(guān)計劃(國際科技合作項目)(豫科[2014]138)

王國強(1964-)，男，河南南陽人，副教授，主要從事畜牧學研究。E-mail:wgq621107@sohu.com

*通訊作者：尹清強(1964-)，男，河南南陽人，教授，主要從事動物營養(yǎng)與生物工程研究。E-mail:qqy1964@126.com

S816.34

A

1004-3268(2016)08-0140-04