靳曉慧，王瑞寧，徐衛(wèi)松，耿靜微，何瀟湘，鄭蘭蘭，張 建，魏戰(zhàn)勇*(.河南農(nóng)業(yè)大學 牧醫(yī)工程學院，河南 鄭州 45000； .河南省動物性食品安全重點實驗室，河南 鄭州 455000； .河南省信陽市平橋區(qū)動物衛(wèi)生監(jiān)督所，河南 信陽 46400)

水溶性酵母葡聚糖對豬細小病毒滅活疫苗免疫效果的影響

靳曉慧1，2，王瑞寧1，徐衛(wèi)松1，耿靜微1，何瀟湘1，鄭蘭蘭2，張 建3，魏戰(zhàn)勇1，2*
(1.河南農(nóng)業(yè)大學 牧醫(yī)工程學院，河南 鄭州 450002； 2.河南省動物性食品安全重點實驗室，河南 鄭州 455000； 3.河南省信陽市平橋區(qū)動物衛(wèi)生監(jiān)督所，河南 信陽 464100)

為研究水溶性酵母葡聚糖作為免疫佐劑對豬細小病毒(PPV)滅活疫苗免疫效果的影響，將水溶性酵母葡聚糖與PPV滅活疫苗聯(lián)合免疫小鼠，采用ELISA方法檢測免疫后不同時間小鼠血清中的抗體水平及IL-4、IL-6、IFN-γ的分泌水平，應(yīng)用流式細胞儀檢測免疫小鼠CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+T淋巴細胞百分比值的動態(tài)變化。結(jié)果顯示，與疫苗單獨免疫組相比，酵母葡聚糖對抗體水平無明顯影響，CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+細胞數(shù)量增加，且均能不同程度誘導IL-4、IL-6、IFN-γ分泌。表明，水溶性酵母葡聚糖聯(lián)合PPV滅活疫苗能夠有效增強機體的免疫功能，水溶性酵母葡聚糖可以作為PPV的免疫佐劑。

豬細小病毒； 滅活疫苗； 水溶性酵母葡聚糖； T淋巴細胞亞群； 細胞免疫； 體液免疫

豬細小病毒病是由豬細小病毒(porcine parvovirus, PPV)感染引起的一種豬的繁殖障礙病，主要引起初產(chǎn)母豬不孕、流產(chǎn)、死產(chǎn)、產(chǎn)木乃伊胎及弱胎等[1-2]。近年來， PPV病的廣泛流行給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失[3]。對該病目前尚無有效的治療方法，臨床上主要使用PPV疫苗進行免疫預防。PPV弱毒苗免疫效果較好，但其本身存在散毒的危險。PPV滅活疫苗作為預防PPV的常用疫苗,安全性較高，但由于其主要引起體液免疫應(yīng)答，引起的細胞免疫應(yīng)答水平較低甚至沒有，從而導致免疫保護率不高，且其易導致機體長期處于持續(xù)性感染狀態(tài)。因此，如何提高疫苗刺激的保護性抗體水平和細胞免疫應(yīng)答效應(yīng)是防制PPV感染的關(guān)鍵。

佐劑的選擇對滅活疫苗免疫效果起著至關(guān)重要的作用[4-7]。酵母葡聚糖是存在于酵母細胞壁中的一種多糖，對細菌有很明顯的抑制作用，同時具有抗癌、抗病毒的功能，可以增強哺乳動物的免疫力，具有降低血脂、促進傷口愈合等功能，是一種良好的生物效應(yīng)調(diào)節(jié)劑。酵母葡聚糖被廣泛應(yīng)用到動物飼料、食品添加劑等各個領(lǐng)域[8-10]。目前，酵母葡聚糖作為免疫增強劑在水產(chǎn)養(yǎng)殖中使用最廣泛[11]，然而，在畜禽養(yǎng)殖業(yè)中，有關(guān)葡聚糖的應(yīng)用報道較少。李軍等[12]在斷奶仔豬日糧中添加適量的啤酒酵母葡聚糖發(fā)現(xiàn)，啤酒酵母葡聚糖可以提高斷奶仔豬的生產(chǎn)性能以及細胞免疫功能。但有關(guān)酵母葡聚糖作為免疫佐劑在畜禽疾病防制方面的研究尚未見報道。為此，本研究采用水溶性酵母葡聚糖聯(lián)合PPV油乳劑滅活疫苗免疫小鼠，分析水溶性酵母葡聚糖對PPV滅活疫苗免疫效果的影響，以期為豬PPV滅活疫苗新型佐劑的開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 疫苗

豬PPV油乳劑滅活疫苗購于中牧實業(yè)股份有限公司(批號1009006-2)；自制豬PPV油乳劑滅活疫苗。

1.2 供試動物

60只體質(zhì)量20 g左右的Balb/C小鼠，購自鄭州大學醫(yī)學院實驗動物中心。

1.3 主要試劑

豬細小病毒抗體檢測ELISA試劑盒購自BioXL公司；酵母細胞壁粗提物，購于安琪酵母股份有限公司；辣根過氧化物酶(HRP)標記的羊抗小鼠IgG，購于北京鼎國生物技術(shù)發(fā)展公司；小鼠IL-4 、IL-6及IFN-γ ELISA檢測試劑盒，購自武漢華美生物工程有限公司；大鼠抗小鼠CD3+、CD4+和CD8+分子單克隆抗體以及FITC、PE標記的兔抗大鼠IgG，購自北京邦定泰克生物技術(shù)有限公司；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.4 水溶性酵母葡聚糖的制備

取干燥的酵母細胞壁粗提物20 g，懸浮于120 mL 6% NaOH溶液中, 60 ℃條件下劇烈攪拌4 h,冷卻至室溫后3 000 r/min離心15 min，棄上清液后，用80 mL 3%NaOH溶液重新懸浮,加熱至90 ℃并不斷攪拌2 h，3 000 r/min離心15 min, 棄上清液，加入50 mL 4%HCl充分攪拌,室溫下靜置2 h。3 000 r/min離心15 min,棄上清液,用蒸餾水充分洗滌3次,再用50 mL 95%乙醇于75 ℃攪拌3 h,脫水2次，37 ℃干燥12 h,得到淡黃色的酵母堿不溶性葡聚糖粉末。將其放入水解管中，加入27 mL 2.7 mol/L的H2SO4后封管，置于100 ℃的水浴中水解3 h。水解液轉(zhuǎn)入100 mL容量瓶中，定容備用。將經(jīng)酸處理后的樣品溶液稀釋到質(zhì)量濃度為0.04 mg/mL后，取1.0 mL加入蒽酮試劑，按照硫酸-蒽酮法測定含量[13]。

酵母堿不溶性葡聚糖按1∶10(m/v)添加90%甲酸,85 ℃降解1 h,加熱,除去甲酸,調(diào)節(jié)pH值至11,過濾,將過濾濃縮液的pH值調(diào)節(jié)至中性,加熱到70 ℃處理30 min, 真空冷凍干燥即獲得水溶性酵母葡聚糖,最后將其用pH值8.0的磷酸緩沖液配制成8 mg/mL的水溶性酵母葡聚糖供試液，備用[14]。

1.5 試驗設(shè)計

60只Balb/C小鼠隨機分為6組，每組10只，雌雄各半，豬PPV抗體檢測ELISA試劑盒檢測PPV抗體均為陰性。皮下分點注射，隔周進行二免，每組免疫劑量與首次免疫劑量相同。免疫后不同時間每組分別隨機抽取3只小鼠進行摘眼球采血并分離血清。具體分組及免疫方案見表1。

表1 試驗分組及免疫情況

1.6 抗體水平的測定

免疫0、1、2、3、4、5、6周后，對分離到的血清在56 ℃水浴滅活30 min。按照PPV ELISA診斷試劑盒(試劑盒中酶標羊抗豬IgG更換為辣根過氧化物酶標記羊抗小鼠IgG)使用說明書操作，應(yīng)用間接ELISA方法檢測小鼠血清中PPV的抗體水平。

1.7 小鼠T淋巴細胞亞群的測定

免疫0、1、2、3、4周后，對采集的血液使用檸檬酸鈉抗凝，取抗凝血0.2 mL, 加2 mL 紅細胞裂解液, 充分混勻，室溫作用10 min, 2 000 r/min離心5 min, 棄上清液, 加5 mL PBS洗滌, 2 000 r/min 離心10 min,重復2次。將每份血清樣品分裝2管，一管加入鼠抗CD3-FITC、CD4-PE單克隆抗體各10 μL，另一管加入鼠抗CD3-FITC、CD8-PE單克隆抗體各10 μL，每管取細胞懸液500 μL，4 ℃冰箱中避光反應(yīng)1 h，再加PBS 緩沖液1 mL，混勻，2 000 r/min離心5 min，棄上清，將管底細胞用1 mL PBS 懸浮，用FACsort 流式細胞儀檢測，每個樣本計數(shù)3 000個細胞，結(jié)果用Mod Fit LT軟件分析[15]。

1.8 細胞因子IL-4、IL-6 和IFN-γ含量的測定

按照ELISA檢測試劑盒使用說明書，檢測小鼠免疫7、14、21、28 d后血清中IL-4、IL-6和IFN-γ的含量。以標準品的質(zhì)量濃度為橫坐標、OD值為縱坐標，繪制標準曲線。根據(jù)樣品的OD值計算小鼠血清中IL-4、IL-6和IFN-γ的含量。

1.9 數(shù)據(jù)處理

用SPSS 11.5及Excel 2000將所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計處理，計算其平均值,試驗數(shù)據(jù)以平均值± 標準差表示,并用SPSS 11.5軟件進行Duncan’s多重分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 水溶性酵母葡聚糖對PPV抗體水平的影響

用ELISA方法對每周收集的血清進行抗體水平的檢測，得到抗體水平消長曲線(圖1)。統(tǒng)計分析結(jié)果表明，從第2周開始，除了水溶性酵母葡聚糖組，自制疫苗組、自制疫苗+水溶性葡聚糖組、商品疫苗組、商品疫苗+水溶性葡聚糖組抗體水平均顯著高于生理鹽水組，自制疫苗免疫組與商品疫苗免疫組差異不顯著，水溶性酵母葡聚糖聯(lián)合PPV滅活疫苗組的抗體效價與相應(yīng)的滅活疫苗單獨免疫組差異均不顯著。整體上，水溶性酵母葡聚糖聯(lián)合PPV滅活疫苗組的抗體水平高于相應(yīng)的滅活疫苗單獨免疫組。

圖1 小鼠血清抗體水平的檢測結(jié)果

2.2 水溶性酵母葡聚糖對外周血中T淋巴細胞亞群的影響

2.2.1 CD3+T淋巴細胞 各組CD3+T淋巴細胞百分率均比生理鹽水組高(圖2)。自制疫苗免疫組與商品疫苗免疫組差異不顯著，水溶性酵母葡聚糖聯(lián)合PPV滅活疫苗免疫組均比相應(yīng)的滅活疫苗組的CD3+百分率高，但差異不顯著。

圖2 免疫小鼠后外周血CD3+細胞百分率

2.2.2 CD3+CD4+T淋巴細胞 各組的CD3+CD4+T淋巴細胞百分率均高于生理鹽水組，各疫苗免疫組CD3+CD4+T淋巴細胞百分率均高于水溶性酵母葡聚糖組(圖3)。在免疫后14 d自制疫苗免疫組顯著高于商品疫苗免疫組，在免疫后21 d水溶性酵母葡聚糖聯(lián)合PPV滅活疫苗免疫組趨于下降，但仍高于相應(yīng)的滅活疫苗免疫組。整體上，水溶性酵母葡聚糖聯(lián)合PPV滅活疫苗免疫組均比相應(yīng)的滅活疫苗組的CD3+CD4+T淋巴細胞百分率高，但差異不顯著。

2.2.3 CD3+CD8+T淋巴細胞 在免疫后14～28 d，除水溶性酵母葡聚糖單獨免疫組外，各試驗組的CD3+CD8+T淋巴細胞百分率均顯著高于生理鹽水組(圖4)。商品疫苗免疫組CD3+CD8+T淋巴細胞顯著高于自制疫苗免疫組。在免疫后21 d，水溶性酵母葡聚糖聯(lián)合PPV滅活疫苗免疫組顯著高于相應(yīng)的滅活疫苗組。

圖3 免疫小鼠后外周血CD3+CD4+細胞百分率

圖4 免疫小鼠后外周血CD3+CD8+細胞百分率

2.3 水溶性酵母葡聚糖對細胞因子的影響

2.3.1 IL-4 從圖5可以看出，免疫小鼠后，各組的IL-4水平呈上升趨勢。免疫后7～28 d，水溶性酵母葡聚糖聯(lián)合PPV滅活疫苗組的IL-4水平顯著高于相應(yīng)的疫苗組，各試驗組的IL-4水平均極顯著高于生理鹽水組。

2.3.2 IL-6 由圖6可知，免疫小鼠后，各個試驗組的IL-6水平均顯著高于生理鹽水組。免疫后14～28 d時，水溶性酵母葡聚糖聯(lián)合PPV滅活疫苗組的IL-6水平顯著高于相應(yīng)的PPV滅活疫苗組。

2.3.3 IFN-γ 由圖7可知，水溶性酵母葡聚糖聯(lián)合自制疫苗組與自制疫苗單獨免疫組的IFN-γ水平均在免疫后14 d達到峰值，且水溶性酵母葡聚糖聯(lián)合滅活疫苗組的IFN-γ水平均顯著高于相應(yīng)的滅活疫苗組。免疫后7～28 d，除水溶性酵母葡聚糖組外，其余試驗組的IFN-γ水平均極顯著高于生理鹽水組(圖7)。

圖5 免疫后小鼠血清中IL-4水平

圖6 免疫后小鼠血清中IL-6水平

圖7 免疫后小鼠血清中IFN-γ水平

3 討論

本研究結(jié)果表明，整體上，水溶性酵母葡聚糖組的抗體水平高于相應(yīng)的滅活疫苗單獨免疫組，但差異不顯著。水溶性酵母葡聚糖作為免疫佐劑有利于抗體產(chǎn)生。

CD3是T細胞膜上的重要分化抗原，CD3+是成熟T細胞的特征性標志，CD3+分子的主要功能是傳遞T細胞活化信號，代表了機體的細胞免疫水平[16]。CD4+和CD8+分子是T淋巴細胞的2個重要表面標志，其中CD4+T淋巴細胞的作用是輔助和誘導增強免疫應(yīng)答，其主要功能是分泌細胞因子，如IFN-γ、IL-2、TNF和淋巴毒素(LT)等[17-18]，CD8+T淋巴細胞主要是抑制、介導細胞毒性殺傷作用[19-21]。本試驗利用流式細胞儀檢測小鼠免疫后CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+T淋巴細胞百分率的變化，評價水溶性酵母葡聚糖聯(lián)合PPV滅活疫苗組的細胞免疫水平。結(jié)果顯示，水溶性酵母葡聚糖組的CD3+CD4+、CD3+CD8+T淋巴細胞百分率均比相應(yīng)的滅活疫苗單獨免疫組高，表明水溶性酵母葡聚糖佐劑可增強小鼠的細胞免疫應(yīng)答。

Th1和Th2效應(yīng)細胞是由CD3+CD4+T淋巴細胞亞群激活后增殖分化得到的，通過分泌不同的細胞因子介導各自的免疫功能[22]。IL-4、IL-6是Th2型細胞產(chǎn)生的具有抗病毒作用的細胞因子，在免疫調(diào)節(jié)中具有非常重要的作用；IL-4還可以調(diào)節(jié)Th1型細胞分化，間接介導細胞免疫[23-24]。IFN-γ是由Th1細胞分泌的，不僅具有抗病毒作用，而且具有較強的免疫調(diào)節(jié)作用。本試驗結(jié)果表明，水溶性酵母葡聚糖能刺激淋巴細胞分泌IL-4、IL-6，能促進小鼠外周血淋巴細胞誘生IFN-γ，這可能是水溶性酵母葡聚糖增強免疫的分子機制之一。IFN-γ、IL-4、IL-6作為重要的Thl、Th2型免疫相關(guān)因子，相互制約、彼此調(diào)節(jié)，維持著機體正常的細胞免疫和體液免疫功能。

目前，PPV感染尚無有效的治療藥物，有效預防PPV病的主要手段是使用PPV疫苗進行免疫預防，但各種PPV疫苗均不能100%預防該病。本研究結(jié)果表明，水溶性酵母葡聚糖能夠增強PPV滅活疫苗的免疫應(yīng)答，為水溶性酵母葡聚糖作為免疫增強劑的應(yīng)用提供了理論依據(jù)。

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Influence of Water-soluble Yeast Glucan on Immune Effects of Porcine Parvovirus Inactivated Vaccines

JIN Xiaohui1,2，WANG Ruining1,XU Weisong1,GENG Jingwei1,HE Xiaoxiang1,ZHENG Lanlan2,ZHANG Jian3,WEI Zhanyong1,2*
(1.College of Animal Science and Veterinary Medicine,Henan Agricultural University,Zhengzhou 450002,China；2.Key Laboratory for Animal-derived Food Safety of Henan Province,Zhengzhou 455000,China；3.Animal Health Supervision Institute of Pingqiao Distrit,Xinyang 464100,China)

In order to research the effect of water-soluble yeast glucan as immune adjuvant on immune effects of PPV inactivated vaccines,the mice were injected with PPV inactivated vaccine with the water-soluble yeast glucan,blood samples were taken weekly after vaccination.The antibody titers and sera secreting IL-6,IL-4, IFN-γand CD3+,CD3+CD4+,CD3+CD8+T lymphocytes percentage were measured by ELISA and FCA.Compared with the vaccine immunization group alone,yeast glucan could enhance the number of CD3+,CD3+CD4+,CD3+CD8+T-lymphocytes subpopulations,as well as IL-6, IL-4 and IFN-γ secretion of serum.However,there was unexpectedly little difference on antibody titers.It demonstrated that water-soluble yeast glucan injected with PPV inactivated vaccines could effectively enhance the body’s immune function,and water-soluble yeast glucan could serve as PPV immune adjuvant.

porcine parvovirus; inactivated vaccine; water-soluble yeast glucan; T-lymphocyte subsets; cellular immunity； humoral immunity

2016-01-10

河南省科技開放合作項目(142106000042)；河南省重大科技攻關(guān)項目(132102110034)

靳曉慧(1991-)，女，河南開封人，在讀碩士研究生，研究方向：動物分子病毒學、分子免疫學。 E-mail：1114780675@qq.com

*通訊作者：魏戰(zhàn)勇(1975-)，男，河南安陽人，教授，博士，主要從事動物分子病毒學、分子免疫學研究。 E-mail:weizhanyong@henau.edu.com

S852.4

A

1004-3268(2016)08-0125-06