趙 楊，米建華，李洪連，文才藝，汪 敏*

(1．河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院，河南 鄭州 450002； 2．鄭州紫荊山公園，河南 鄭州 450003)

河南省紫荊黃萎病菌的分離和鑒定

趙 楊1，米建華2，李洪連1，文才藝1，汪 敏1*

(1．河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院，河南 鄭州 450002； 2．鄭州紫荊山公園，河南 鄭州 450003)

為明確河南省鄭州市紫荊山公園紫荊植株枯死的病因，采集具有典型黃萎病癥狀的紫荊植株，采用組織分離法分離出2株病原菌Vcg1和Vcg4，并進(jìn)行鑒定。該病原菌在PDA培養(yǎng)基中菌落菌絲灰白色，分生孢子梗輪生，后期產(chǎn)生微菌核。PCR擴增菌株Vcg1和Vcg4 rDNA-ITS區(qū)段并測序，序列比對結(jié)果表明其與大麗輪枝菌(V.dahliaeKleb.)同源性最高。通過分生孢子懸浮液傷根接種法測定目標(biāo)菌株在紫荊幼苗上的致病性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該病原菌能引起紫荊發(fā)病，維管束變褐色，嚴(yán)重的導(dǎo)致紫荊植株死亡。以上結(jié)果表明引起鄭州市紫荊山公園紫荊枯死的病原菌為大麗輪枝菌。

紫荊； 黃萎病； 大麗輪枝菌； rDNA-ITS序列； 序列比對

紫荊(Cercischinensis)是原產(chǎn)于我國的豆科紫荊屬叢生或單生灌木[1]，具有較高的觀賞價值和藥用價值等[2-3]。紫荊花顏色艷麗，葉片顏色隨季節(jié)變化，春季黃綠色，夏季碧綠色，至秋季成明黃色，常用于城市、學(xué)校、公園、庭院的綠化[4]。紫荊的皮、根和花朵均可入藥，從紫荊花中提取的天然色素既經(jīng)濟安全又符合現(xiàn)代健康標(biāo)準(zhǔn)[5]。紫荊根系發(fā)達(dá)，能夠通過吸收污染土壤中的重金屬元素來改善土壤環(huán)境[6]。

紫荊病害主要包括角斑病、灰霉病、黃萎病等[7-8]。黃萎病是紫荊重要病害之一，受到黃萎病菌侵染的紫荊葉片葉尖葉緣出現(xiàn)黃色病斑或整片葉褪綠干枯，后期葉片干枯萎蔫，嚴(yán)重影響其觀賞價值、綠化價值和藥用價值。許多國外學(xué)者研究表明，引起紫荊黃萎病的病原菌為大麗輪枝菌(V.dahliaeKleb.)和黑白輪枝菌(V.albo-atrum)[9-10]。而國內(nèi)對紫荊黃萎病害的報道較少。1987年，王立新等首次從紫荊上分離出大麗輪枝菌[11]。2013年陸文靜等從陜西楊凌采集紫荊病株，分離出了大麗輪枝菌，并對紫荊黃萎病病原學(xué)進(jìn)行了研究[12]。

2008年開始，河南省鄭州市紫荊山公園的紫荊出現(xiàn)葉片邊緣枯黃、開花減少現(xiàn)象，病害逐漸蔓延擴展，到2013年嚴(yán)重發(fā)生，發(fā)病率高達(dá)40%，發(fā)病植株維管束變褐壞死，嚴(yán)重的導(dǎo)致植株死亡。為明確紫荊枯死的原因，擬通過常規(guī)組織分離法從發(fā)病紫荊植株上分離病原菌，通過形態(tài)學(xué)觀察和分子生物學(xué)方法進(jìn)行鑒定，并測定病原菌致病性，以明確其病原，為該病害的防治奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

具有典型黃萎病癥狀的紫荊植株，于2015年6月16日在鄭州市紫荊山公園采集得到；紫荊1年生幼苗，用于病原菌的致病性測定。

1.2 方法

1.2.1 病原菌的分離與培養(yǎng) 采用常規(guī)組織分離法進(jìn)行病原菌的分離。將具有典型黃萎病癥狀的紫荊枝條截取5 cm左右，分別在70%的乙醇和5%的次氯酸鈉溶液中浸泡2 min進(jìn)行表面消毒，消毒后切成小片放置于PDA培養(yǎng)基中。長出菌落后進(jìn)行純化，并單孢分離，-70 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 病原菌的形態(tài)特征觀察 將純化過的菌株在PDA培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，14 d后觀察菌落的形態(tài)。挑取菌絲，在顯微鏡(Nikon E100)下觀察菌株的菌絲、分生孢子及產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)的形態(tài)和大小。根據(jù)菌株的表型特征參照文獻(xiàn)[13]對其進(jìn)行種屬的初步鑒定。

1.2.3 病原菌的分子生物學(xué)鑒定 病原菌活化后，將菌絲接種到PDB液體培養(yǎng)基中，放置于搖床上進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為溫度25 ℃、轉(zhuǎn)速150 r/min。5 d后用4層紗布過濾，滅菌的吸水紙吸干水分收集菌絲。將菌絲加液氮充分研磨后，采用CTAB法提取真菌的總DNA[14]。利用紫外分光光度計(ND-2000)測量DNA溶液質(zhì)量濃度，并稀釋到10 ng/μL備用。

采用通用引物ITS1和ITS4進(jìn)行PCR，擴增待測菌株的ITS序列。擴增引物序列為ITS1：5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGC-3′，ITS4：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′。擴增體系為25 μL，其中基因組DNA 1 μL，上、下游引物各1 μL，PremixTaq12 μL，ddH2O 10 μL。PCR反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，35個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳后，通過EB染色在紫外燈下成像進(jìn)行檢測，之后送交生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測序。將所得序列提交到GenBank中，并利用BLAST進(jìn)行序列的同源性比對，獲取的同源序列采用MEGA 5.1構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，以明確病原菌的分類地位。

1.2.4 病原菌致病性測定 首先采用谷素靜等[15]的方法制備黃萎病菌分生孢子。將-70 ℃下保存的菌株活化后，轉(zhuǎn)接到PDA平板上25 ℃條件下生長10 d，加入2 mL無菌水，用滅菌棉簽涂擦菌落表面，將洗下的孢子懸浮液均勻涂抹于PDA培養(yǎng)基表面，25 ℃暗培養(yǎng)7 d，用無菌水洗下孢子，使用4層紗布將菌絲過濾，血球計數(shù)板測定孢子濃度，用無菌水調(diào)節(jié)孢子懸浮液濃度至1.0×107個/mL，備用。

采用傷根接種法測定所分離菌株的致病性[16]。將紫荊幼苗根部土壤小心扒開，用滅菌刀片在紫荊幼苗根部輕輕劃動進(jìn)行傷根。將配制好的孢子懸浮液滴到紫荊幼苗根部的傷口處，每株約50 mL。每個菌株接種4棵紫荊幼苗，并設(shè)置清水對照。接種后將紫荊置于人工氣候箱中25 ℃、光照16 h、黑暗8 h條件下進(jìn)行培養(yǎng)，觀察并記錄發(fā)病情況，30 d后統(tǒng)計。對接種后發(fā)病的植株，根據(jù)柯赫氏法則進(jìn)一步進(jìn)行病原菌的分離和鑒定。

2 結(jié)果與分析

2.1 紫荊黃萎病癥狀特征及病原菌的分離

紫荊山公園發(fā)病的紫荊植株典型癥狀有黃枯型和青枯型2種。黃枯型癥狀：植株發(fā)病初期葉片邊緣變黃，逐漸擴展為壞死焦枯，嚴(yán)重情況下整個葉片變黃枯死；青枯型癥狀：植株葉片出現(xiàn)灰綠色干枯，葉片皺縮萎蔫干枯但不褪綠，發(fā)病后期葉片整體卷曲干脆。紫荊山公園發(fā)病的紫荊植株以黃枯型癥狀為主。隨著病害的擴散，植株出現(xiàn)“半邊瘋”的癥狀，枝條整枝或植株一側(cè)發(fā)病嚴(yán)重，嚴(yán)重者整株枯萎死亡。橫切發(fā)病紫荊植株枝條，觀察發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)發(fā)病紫荊植株的維管束有褐色病變(圖1)。

A.健康紫荊植株；B.枯死紫荊植株；C.黃枯型發(fā)病紫荊；D.青枯型發(fā)病紫荊；E.發(fā)病紫荊維管束；F.健康紫荊維管束

采用組織分離法對具有典型黃萎病癥狀的紫荊植株進(jìn)行病原菌的分離，從2株發(fā)病紫荊植株上分離純化出2株真菌菌株 Vcg1和Vcg4，而健康植株則未能分離出相應(yīng)的菌株。

2.2 病原菌的形態(tài)學(xué)特征

將分離到的2個菌株在PDA培養(yǎng)基上25 ℃培養(yǎng)14 d后，觀察其菌落形態(tài)。2個菌株生長較為緩慢，整體菌落呈規(guī)則圓形，初期菌絲灰白色，后期菌落會產(chǎn)生黑色微菌核，邊緣整齊，菌絲致密(圖2)。在顯微鏡下觀察，菌株分生孢子梗典型輪生，每層輪枝具有3～4個分枝，分生孢子長卵圓形，單胞無色(圖3)。

A.正面；B.背面

A、B比例尺分別為50、20 μm

2.3 病原菌的分子生物學(xué)鑒定結(jié)果

采用通用引物ITS1/ITS4對菌株Vcg1和Vcg4的rDNA-ITS序列進(jìn)行擴增，PCR產(chǎn)物通過1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，得到500 bp左右的條帶。PCR產(chǎn)物測序后提交至GenBank，得到的登錄號分別為KU360077和KU360078。BLAST比對分析結(jié)果顯示，菌株Vcg1和Vcg4均與登錄號為KM013462.1(V.dahliaeKleb.)和KC156640.1(V.dahliaeKleb.)的菌株同源性高達(dá)100%。

利用軟件MEGA 5.1通過非加權(quán)組平均法(UPGMA法)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖4)，可以發(fā)現(xiàn)，Vcg1和Vcg4與大麗輪枝菌的遺傳距離最近，與從棉花(KC156637)、茄子(AB353347)、黃櫨(AB370339)和紫荊(AB735536)上分離出的大麗輪枝菌聚在同一分支。

圖4 Vcg1和Vcg4基于rDNA-ITS序列分析的系統(tǒng)發(fā)育樹

通過形態(tài)學(xué)特征觀察和rDNA-ITS序列分析，明確從發(fā)病紫荊植株上分離出的病原菌菌株Vcg1和Vcg4均為大麗輪枝菌。

2.4 病原菌致病性測定結(jié)果

將菌株Vcg1、Vcg4的孢子懸浮液接種到紫荊幼苗上，7 d后紫荊幼苗開始發(fā)病，葉緣有黃色病斑出現(xiàn)。接種30 d后，所有接種紫荊幼苗均發(fā)病，嚴(yán)重的植株枯死，葉片卷曲萎黃，維管束出現(xiàn)褐色壞死。植株發(fā)病癥狀和自然條件下發(fā)病現(xiàn)象一致，而清水對照紫荊幼苗生長狀況良好，未表現(xiàn)任何癥狀(圖5)。

A.Vcg1接種發(fā)病情況；B.Vcg4接種發(fā)病情況；C.清水對照

采用組織分離法對感病植株莖稈進(jìn)行病原菌分離，2～3 d發(fā)病植株莖稈長出白色菌落，且菌落形態(tài)特征與從自然發(fā)病紫荊植株上分離出的病原菌形態(tài)特征相同(圖6)。

A.正面；B.背面

3 結(jié)論與討論

本研究對鄭州市紫荊山公園發(fā)生黃萎病害的紫荊進(jìn)行組織分離，得到2個真菌菌株。通過形態(tài)學(xué)特征觀察和rDNA-ITS序列分析，將這2個菌株鑒定為大麗輪枝菌(V.dahliaeKleb.)。進(jìn)一步通過柯赫氏法則進(jìn)行致病性測定，證明分離到的真菌為引起紫荊黃萎病的病原菌，且致病力較強，30 d左右可導(dǎo)致紫荊幼苗枯死。該結(jié)果與陸文靜等[12]從陜西楊凌紫荊上分離到的病原菌相同。鑒于鄭州市紫荊黃萎病危害嚴(yán)重，有必要加強該病害的綜合防治技術(shù)研究。

本研究僅從紫荊上分離到大麗輪枝菌，而國外學(xué)者認(rèn)為紫荊黃萎病的病原菌包括大麗輪枝菌和黑白輪枝菌[9-10]。黑白輪枝菌在較高溫度條件下不能致病(25 ℃以上)，但在較低溫度條件(20～24 ℃)下可以引起寄主的黃萎病害[17]。我國氣候條件復(fù)雜，紫荊分布范圍廣，河南省紫荊黃萎病菌是否存在黑白輪枝菌還有待于繼續(xù)收集病害樣本進(jìn)行研究。此外，我國目前僅在陜西楊凌和河南鄭州明確了紫荊黃萎病的發(fā)生與危害，有必要進(jìn)一步調(diào)查取樣，明確紫荊黃萎病在我國的發(fā)生、分布與危害情況。

本研究通過傷根接種法進(jìn)行紫荊黃萎病菌的致病性測定，接種后7 d紫荊即開始發(fā)病，且發(fā)病迅速，30 d后植株嚴(yán)重發(fā)病，發(fā)病率達(dá)到100%。該方法可用來測定大麗輪枝菌對紫荊的致病性。

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Isolation and Identification ofVerticilliumdahliaeon Chinese Redbud in Henan

ZHAO Yang1,MI Jianhua2,LI Honglian1,WEN Caiyi1,WANG Min1*

(1.College of Plant Protection,Henan Agricultural University,Zhengzhou 450002,China; 2.Zhengzhou Chinese Redbud Mountain Park,Zhengzhou 450003,China)

The leaves of Chinese redbud in Zhengzhou Chinese Redbud Mountain Park turned yellow,and the vascular turned brown,with seriously disease plants dead.In order to determine the cause of death, Chinese redbud with theVerticilliumwilt symptom was collected and two isolates of Vcg1 and Vcg4 were isolated from infected Chinese redbud stems.The colonies of isolates on PDA showed gray white first, later formed microsclerotia,and the conidiophores were verticillate.The rDNA-ITS of Vcg1 and Vcg4 was amplified by PCR and sequenced.The sequence blast resulted in the highest sequence homology withV.dahliaeKleb..The pathogenicity of isolates was tested by dipping Chinese redbud seedlings roots in conidial suspensions.The pathogens could infect Chinese redbud,and made the vascular bundle brown,seriously causing plant wilted and dead.The results showed that the pathogen causing Chinese redbud wilt in Zhengzhou Chinese Redbud Mountain Park wasV.dahliaeKleb..

Chinese redbud;Verticilliumwilt;Verticilliumdahliae; rDNA-ITS; blast

2016-04-21

農(nóng)業(yè)部公益性行業(yè)科技專項(201503109)；河南省教育廳科學(xué)技術(shù)研究重點項目(14A210025)；河南省棉花產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項資金(S2013-07-G04)

趙 楊(1989-)，男，河南安陽人，在讀碩士研究生，研究方向：植物病原真菌生物學(xué)。 E-mail:158338274512@163.com

*通訊作者：汪 敏(1974-)，男，河南新縣人，副教授，博士，主要從事植物真菌病害研究。 E-mail:wangm05@sina.com

S436.8

A

1004-3268(2016)10-0089-04