王健勝，侯桂玲，程立平，謝永鳳

(1.平頂山學(xué)院，河南 平頂山 467000； 2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 草原研究所，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010010)

國(guó)內(nèi)外苜蓿種質(zhì)起始密碼子遺傳多樣性分析

王健勝1，侯桂玲1，程立平1，謝永鳳2

(1.平頂山學(xué)院，河南 平頂山 467000； 2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 草原研究所，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010010)

為了對(duì)新引進(jìn)的苜蓿種質(zhì)親緣關(guān)系進(jìn)行鑒定，采用起始密碼子多態(tài)性(SCoT)標(biāo)記對(duì)19份國(guó)內(nèi)外苜蓿種質(zhì)的分子遺傳多樣性進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，14個(gè)SCoT引物在供試苜蓿材料中共獲得有效擴(kuò)增條帶78個(gè)，其中多態(tài)性條帶72個(gè)，多態(tài)性條帶百分比為92.31%；SCoT引物的有效等位基因數(shù)、Nei’s基因多樣性指數(shù)、Shannon’s信息指數(shù)和多態(tài)性信息含量平均分別為1.53、0.31、0.46和0.31；供試苜蓿材料間的遺傳相似系數(shù)介于0.385～0.846，平均為0.657，表明供試苜蓿材料遺傳多樣性較豐富；聚類分析和主成分分析均表明，供試材料可被劃分為2大類，第1類群包括的苜蓿種質(zhì)數(shù)達(dá)到16個(gè)，占到所有供試苜蓿種質(zhì)總數(shù)的84.21%，第2類群包含的苜蓿種質(zhì)數(shù)只有3個(gè)。綜合分析表明，新引進(jìn)的19份苜蓿種質(zhì)具有較豐富的遺傳多樣性，其在未來(lái)苜蓿育種中具有較好的應(yīng)用前景。

苜蓿； 遺傳多樣性； SCoT分析

苜蓿(MedicagosativaL.)為重要的多年生豆科牧草，是世界上種植面積最廣的牧草之一，其不僅具有產(chǎn)量高、品質(zhì)好、營(yíng)養(yǎng)豐富、適口性好等特點(diǎn)，還具有耐旱、耐寒、抗鹽堿等較強(qiáng)的抗逆性[1-3]。苜蓿在我國(guó)主要分布于西北、華北和東北地區(qū)，其在區(qū)域生態(tài)治理、畜牧業(yè)發(fā)展和種植業(yè)結(jié)構(gòu)調(diào)整中發(fā)揮著重要的作用[4-6]。苜蓿種質(zhì)是苜蓿育種的重要基礎(chǔ)，遺傳多樣性研究可以有效發(fā)現(xiàn)優(yōu)異苜蓿種質(zhì)，進(jìn)而為苜蓿優(yōu)良品種的選育提供重要材料。因此，開(kāi)展苜蓿種質(zhì)資源遺傳多樣性研究對(duì)苜蓿育種至關(guān)重要。然而，我國(guó)苜蓿種質(zhì)資源研究目前仍主要集中于引種[7-8]及主要農(nóng)藝性狀[9-13]分析，有關(guān)苜蓿種質(zhì)遺傳多樣性方面的研究較少。

在苜蓿種質(zhì)遺傳多樣性研究中，分子標(biāo)記作為一種重要的研究手段得到了一定的應(yīng)用，目前，包括AFLP[14]、SSR[15-16]、ISSR[17-18]、RAPD[19-21]等多種類型分子標(biāo)記均被應(yīng)用于苜蓿種質(zhì)遺傳多樣性研究中。起始密碼子多態(tài)性(SCoT)作為近年來(lái)新開(kāi)發(fā)的一種分子標(biāo)記，其在苜蓿遺傳多樣性研究中的應(yīng)用鮮有報(bào)道。SCoT標(biāo)記的原理是根據(jù)植物基因組中ATG翻譯起始位點(diǎn)側(cè)翼保守序列來(lái)設(shè)計(jì)引物，進(jìn)而擴(kuò)增產(chǎn)生偏向候選功能基因區(qū)顯性多態(tài)性標(biāo)記，具有引物通用、重復(fù)性好、穩(wěn)定性高、多態(tài)性豐富等優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于花生[22]、草莓[23]、甘蔗[24]、鴨茅[25]等多種植物的相關(guān)遺傳研究中。另外，與其他傳統(tǒng)分子標(biāo)記相比，SCoT是一種能產(chǎn)生與功能性狀遺傳連鎖的標(biāo)記，可以對(duì)研究目標(biāo)性狀進(jìn)行有效地跟蹤，因此其在相關(guān)重要功能基因研究及分子標(biāo)記輔助育種中得到了一定的應(yīng)用。鑒于此，采用SCoT分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)19個(gè)國(guó)內(nèi)外苜蓿種質(zhì)的遺傳多樣性進(jìn)行較為系統(tǒng)的分析，以揭示不同苜蓿種質(zhì)間親緣關(guān)系，旨在為苜蓿育種及苜蓿種質(zhì)的保護(hù)、合理利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

供試苜蓿材料共有19份，其中國(guó)內(nèi)種質(zhì)14份，國(guó)外種質(zhì)5份，具體信息見(jiàn)表1。

1.2 主要試劑

三羥甲基氨基甲烷(Tris)、乙二胺四乙酸(EDTA)、Tris飽和酚、十二烷基磺酸鈉(SDS)、氯化鈉、氫氧化鈉、硼酸、Taq聚合酶等均購(gòu)自北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.3 DNA提取

每份材料隨機(jī)選取10～15個(gè)單株幼嫩葉片等量混合，采用改良的SDS法[26]混合提取基因組總DNA，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定濃度后，備用。

1.4 SCoT標(biāo)記檢測(cè)

PCR反應(yīng)總體積為20 μL，包括1.5 μL基因組DNA(40 ng)，1.5 μL引物(15 mmol/L)(表2)，2 μL 10×PCR緩沖液(含Mg2+)，1.5 μL底物dNTPs(2.5 mmol/L)，0.5 μLTaq聚合酶(2 U/μL)和13 μL ddH2O。

表1 供試材料基本信息

SCoT-PCR 擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性3 min；35個(gè)循環(huán)(94 ℃變性1 min，引物Tm值復(fù)性1 min，72 ℃延伸2 min)；72 ℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物用1.8%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)，并在紫外凝膠成像系統(tǒng)上拍照保存。

表2 部分用于苜蓿SCoT分析的引物序列及退火溫度

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及分析

以0、1、9統(tǒng)計(jì)SCoT擴(kuò)增帶型，在相同遷移率位置上，有帶記為“1”，無(wú)帶記為“0”，缺失記為“9”，并建立分子數(shù)據(jù)矩陣。利用NTSYS-pc 2.10軟件通過(guò)非加權(quán)平均法(UPMGA)計(jì)算苜蓿種質(zhì)間的遺傳相似系數(shù)，并在此基礎(chǔ)上進(jìn)行聚類分析及主成分分析。采用POPGEN 32軟件估算SCoT標(biāo)記的主要遺傳多樣性參數(shù)，包括引物擴(kuò)增總條帶數(shù)(TNB)、多態(tài)性條帶數(shù)(NPB)、多態(tài)性條帶百分比(PPB)、有效等位基因數(shù)(Ne)、Nei’s基因多樣性指數(shù)(H)、Shannon’s信息指數(shù)(I)和多態(tài)性信息含量(PIC)。

2 結(jié)果與分析

2.1 苜蓿種質(zhì)SCoT多態(tài)性分析

從65個(gè)SCoT基礎(chǔ)引物中篩選出14個(gè)在苜蓿中多態(tài)性豐富、穩(wěn)定性好、帶型清楚的引物，引物篩選率為21.54%。從表3可以看出，SCoT引物在苜蓿基因組中擴(kuò)增差異較大，共獲得有效擴(kuò)增條帶78個(gè)，其中多態(tài)性條帶72個(gè)，多態(tài)性條帶百分比為92.31%,單個(gè)SCoT引物擴(kuò)增總條帶數(shù)為2～9個(gè)，平均為5.57，多態(tài)性條帶數(shù)介于2～9個(gè)，平均為5.14，多態(tài)性條帶百分比為60%～100%，平均為92.24%。不同標(biāo)記的遺傳參數(shù)差異較大。有效等位基因數(shù)介于1.17～1.78個(gè)，平均為1.53個(gè)；Nei’s基因多樣性指數(shù)最小為0.12，最大為0.43，平均為0.31；Shannon’s信息指數(shù)的分布在0.21～0.63，平均為0.46。多態(tài)性信息含量是衡量分子標(biāo)記有效性的重要指標(biāo)，從表3可以看出，不同SCoT標(biāo)記的多態(tài)性信息含量差異較大，其分布范圍在0.09～0.48，平均為0.31。

表3 苜蓿SCoT標(biāo)記遺傳多樣性參數(shù)

2.2 不同苜蓿種質(zhì)親緣關(guān)系分析

從表4可以看出，不同苜蓿種質(zhì)間遺傳相似系數(shù)差異較大。苜蓿種質(zhì)08443與00399間的遺傳相似系數(shù)最小，只有0.385，表明這2個(gè)苜蓿種質(zhì)間的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)，而種質(zhì)08462與08464間的遺傳相似系數(shù)最大，達(dá)到了0.846，這說(shuō)明與其他苜蓿種質(zhì)相比，這2個(gè)苜蓿種質(zhì)間的親緣關(guān)系相對(duì)最近。所有苜蓿種質(zhì)平均遺傳相似系數(shù)為0.657，表明供試苜蓿種質(zhì)整體遺傳差異較大，利用其進(jìn)行遺傳育種相關(guān)研究效果較好。

表4 苜蓿種質(zhì)遺傳相似系數(shù)

2.3 不同苜蓿種質(zhì)聚類分析

基于苜蓿種質(zhì)間遺傳相似系數(shù)對(duì)19份苜蓿種質(zhì)進(jìn)行了聚類分析(圖1)。由圖1可知，在遺傳系數(shù)0.584處，19份苜蓿種質(zhì)被劃分為2大類，第1類群包括的苜蓿種質(zhì)數(shù)最多，達(dá)到16個(gè)，其中國(guó)內(nèi)苜蓿種質(zhì)12個(gè)，國(guó)外苜蓿種質(zhì)4個(gè)；第2類群包含的苜蓿種質(zhì)數(shù)只有3個(gè)，分別是游客、08440和08443。根據(jù)第1類群中苜蓿種質(zhì)的親緣關(guān)系，該類群在遺傳相似系數(shù)0.64處進(jìn)一步又可劃分為3個(gè)亞群，第1亞群共包括10個(gè)苜蓿種質(zhì)，其中3個(gè)國(guó)外種質(zhì)，7個(gè)國(guó)內(nèi)種質(zhì)；第2亞群共包括4個(gè)種質(zhì)，分別是00385、00038、00399和三得利；第3亞群有2個(gè)苜蓿種質(zhì)，即05234和04832。

2.4 苜蓿種質(zhì)主成分分析

在主成分分析中，前3個(gè)主成分能解釋的總遺傳變異為41.39%。從圖2可以看出，19份苜蓿種質(zhì)分布較為分散，其中游客、08440和08443具有較近的物理距離而被劃分為同一類群，其余16份苜蓿種質(zhì)被劃為另一類群。該結(jié)果與聚類分析結(jié)果基本一致?？梢?jiàn)，主成分分析結(jié)果也在一定程度上印證了聚類分析結(jié)果的準(zhǔn)確性。

圖1 基于SCoT標(biāo)記的苜蓿種質(zhì)聚類分析

圖2 基于SCoT標(biāo)記的苜蓿種質(zhì)主成分分析

3 討論

3.1 SCoT在苜蓿遺傳多樣性研究中檢測(cè)效率分析

本研究利用14個(gè)SCoT引物對(duì)19份國(guó)內(nèi)外苜蓿種質(zhì)進(jìn)行了檢測(cè)分析，共獲得有效擴(kuò)增條帶78個(gè)，其中多態(tài)性條帶72個(gè)，多態(tài)性條帶百分比為92.24%。在引物多態(tài)性條帶百分比方面，其他類型分子標(biāo)記與SCoT標(biāo)記存在顯著差異。陳立強(qiáng)等[9]利用15對(duì)SSR引物在42份紫花苜蓿品種中檢測(cè)獲得了231個(gè)擴(kuò)增條帶，多態(tài)性條帶百分比為71.55%；閆娟等[27]利用9個(gè)EST-SSR標(biāo)記在17個(gè)天藍(lán)苜蓿野生居群中檢測(cè)，獲得多態(tài)性條帶百分比為71.9%；王赫等[28]用33個(gè)RAPD引物在10份苜蓿材料中擴(kuò)增獲得353個(gè)條帶，其中多態(tài)性條帶263個(gè)，多態(tài)性條帶百分比為74.5%。由此可以看出，與SSR、RAPD等分子標(biāo)記相比，雖然單個(gè)SCoT標(biāo)記在苜蓿中的有效擴(kuò)增位點(diǎn)較少，但其多態(tài)性條帶百分比顯著提高，而多態(tài)性條帶百分比對(duì)苜蓿遺傳多樣性分析而言甚為關(guān)鍵。為了更好了解SCoT標(biāo)記在苜蓿多樣性檢測(cè)中的有效性，本研究也對(duì)SCoT標(biāo)記的重要參數(shù)進(jìn)行了分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，有效等位基因數(shù)平均為1.53；Nei’s基因多樣性指數(shù)平均為0.31；Shannon’s信息指數(shù)平均為0.46，多態(tài)性信息含量平均為0.31，與前人對(duì)RAPD[20]、SSR[15]、ISSR[17]等不同類型分子標(biāo)記遺傳多樣性參數(shù)分析結(jié)果相比，SCoT標(biāo)記在揭示苜蓿種質(zhì)遺傳多樣性方面效果均較好。

3.2 苜蓿種質(zhì)遺傳多樣性及親緣關(guān)系分析

苜蓿種質(zhì)遺傳多樣性水平及其親緣關(guān)系狀況不僅決定著苜蓿種質(zhì)利用前景，同時(shí)也為不同種質(zhì)的科學(xué)有效利用提供一定依據(jù)。本研究利用SCoT標(biāo)記對(duì)國(guó)內(nèi)外19份苜蓿種質(zhì)檢測(cè)分析表明，供試苜蓿種質(zhì)的遺傳多樣性水平較高，其遺傳相似系數(shù)平均為0.657。遺傳相似系數(shù)的大小也在一定程度上能夠反映苜蓿間親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近，從供試苜蓿種質(zhì)平均遺傳相似系數(shù)可以看出，絕大部分苜蓿種質(zhì)的親緣關(guān)系均較遠(yuǎn)，其中，種質(zhì)08443與00399間的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)，表明這些種質(zhì)在未來(lái)苜蓿育種中將具有較好的利用前景。另外，在苜蓿育種的親本選配中，除了考慮被選擇苜蓿種質(zhì)的親緣關(guān)系外，苜蓿種質(zhì)農(nóng)藝性狀表現(xiàn)的優(yōu)劣也是非常重要的考察因素。因此，要實(shí)現(xiàn)供試苜蓿種質(zhì)的有效利用，下一步還需要對(duì)親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的種質(zhì)進(jìn)行田間農(nóng)藝性狀的綜合考察。本研究也根據(jù)苜蓿種質(zhì)的遺傳相似系數(shù)對(duì)供試苜蓿材料進(jìn)行了聚類分析和主成分分析，這些研究結(jié)果都將為不同苜蓿種質(zhì)的科學(xué)利用提供有效依據(jù)。

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Genetic Diversity Analysis of Domestic and Foreign Alfalfa Germplasm with SCoT Molecular Markers

WANG Jiansheng1,HOU Guiling1,CHENG Liping1,XIE Yongfeng2

(1.Pingdingshan University,Pingdingshan 467000,China; 2.Grassland Institute,Chinese Academy of Agricultural Science,Hohhot 010010,China)

In order to identify the genetic relationship of the new introduced alfalfa germplasm and apply it to alfalfa breeding,the genetic diversity of 19 domestic and foreign alfalfa germplasm was analyzed using SCoT markers in this study.A total of 78 effective loci were obtained for all alfalfa germplasms using 14 SCoT primers,of which 72 loci were polymorphic,and the percentage of polymorphism loci was 92.31%.The mean value of effective number of alleles(Ne),Nei’s gene diversity(H),Shannon’s information index(I) and polymorphism information content(PIC) was 1.53,0.31,0.46 and 0.31,respectively.The genetic similarity coefficient of all alfalfa germplasm ranged from 0.385 to 0.846,and the mean of genetic similarity coefficient was 0.657,which suggested that the studied alfalfa germplasms have the plenty genetic diversity.The results of cluster analysis and principal component analysis showed that all alfalfa germplasm could be divided into two groups.The first group was constituted by 16 alfalfa germplasms,which account for 84.21% of the total alfalfa germplasms.The second group contained three alfalfa germplasms only.The comprehensive analysis showed that the new introduced 19 alfalfa germplasm have the plenty diversity and it have the better value in alfalfa breeding in the future.

alfalfa; genetic diversity; SCoT analysis

2016-04-10

河南省科技攻關(guān)項(xiàng)目(KJT142102110171)；平頂山市科技計(jì)劃項(xiàng)目(2014086)

王健勝(1978-)，男，陜西禮泉人，講師，博士，主要從事作物遺傳育種研究。E-mail:wjsheng1998@163.com

S541

A

1004-3268(2016)10-0040-05