王洪斌， 王 海，成 明， 李士虎(.江蘇省海洋資源開發(fā)研究院，江蘇 連云港 005； .連云港市榮盛生物科技有限公司，江蘇 連云港 54)

海水中蠟狀芽孢桿菌的分離鑒定及其對水環(huán)境中氮磷的糾正效應

王洪斌1， 王 海1，成 明2， 李士虎1
(1.江蘇省海洋資源開發(fā)研究院，江蘇 連云港 222005； 2.連云港市榮盛生物科技有限公司，江蘇 連云港 222524)

為開發(fā)具有改善養(yǎng)殖水體富營養(yǎng)化作用的有益菌，從江蘇連云港灘涂海水池塘分離到1個菌株，命名為HYHB-4，對其進行形態(tài)學特征及生理生化特性鑒定，并分析其16S rRNA 序列，結果表明，分離菌株為蠟狀芽孢桿菌(Bacilluscereus)。研究了分離菌株對蝦蟹混養(yǎng)圍塘水環(huán)境中氮磷的糾正效應，結果顯示，HYHB-4菌株中度嗜鹽、嗜冷，最佳生長溫度為25 ℃，超過35 ℃停止生長；在3%～5%Nacl中生長得率最高；菌株HYHB-4 對蝦蟹混養(yǎng)圍塘水環(huán)境中的氮磷具有顯著的利用轉化和降解作用，其中亞硝態(tài)氮(NO2-N)下降幅度最大，施用HYHB-4制劑5 d后，氨態(tài)氮(NH4-N)、硝態(tài)氮(NO3-N)、NO2-N質量濃度比起始水平分別下降77.19%、52.95%、85.27%；總磷(TP)和磷酸鹽(PO4-P)比起始水平分別下降84.40%、84.67%。綜上，分離的蠟狀芽孢桿菌HYHB菌株-4對蝦蟹混養(yǎng)圍塘水環(huán)境中的氮磷具有糾正效應。

養(yǎng)殖水體； 蠟狀芽孢桿菌； 分離鑒定； 氮； 磷； 糾正效應

魚蝦貝養(yǎng)殖過程中造成的自身污染日益成為重要的生態(tài)與環(huán)境問題，養(yǎng)殖池塘的污染使水體氨氮及其他無機氮、無機磷酸鹽濃度增高[1]。養(yǎng)殖水體中的生態(tài)平衡失調，一些條件致病菌轉化為有毒害的病原菌，導致水生動物病害的暴發(fā)[2]。因而，保持水體微生態(tài)系統(tǒng)平衡，是水生動物健康養(yǎng)殖中最值得關注的方面。

微生物在水產養(yǎng)殖生態(tài)系統(tǒng)的調控方面發(fā)揮著巨大作用，既是生產者又是消費者、分解者和儲存者[3]。微生物具有豐富的淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶等，可以降解養(yǎng)殖生態(tài)環(huán)境中的有機污染物；由于微生物具有生長快、繁殖旺等特點，其可抑制養(yǎng)殖生態(tài)環(huán)境中微藻的生長；微生物在生長繁殖過程中產生大量的次生代謝物，影響水生病原菌和有害藻類生長[4-6]。因此，利用微生物高效分解有機污染物,保持水生態(tài)系統(tǒng)平衡，且避免水生動物病害暴發(fā)，是急需解決的問題。水生環(huán)境中存在大量有益微生物，可對水域中污染物進行分解和轉化，對水體污染有修復作用[7]。目前，關于如何提高養(yǎng)殖生態(tài)環(huán)境中降解有機物細菌的數量、種類以及養(yǎng)殖池中細菌降解有機物的性能等方面的報道較少。為此，本研究從未使用微生物制劑且生態(tài)環(huán)境健康的海水池塘中分離得到1株蠟狀芽孢桿菌(Bacilluscereus)，并將其發(fā)酵形成制劑產品，施用于蝦蟹混養(yǎng)池塘，研究其對養(yǎng)殖圍塘的氮[氨態(tài)氮(NH4-N)、硝態(tài)氮(NO3-N)、亞硝態(tài)氮(NO2-N) ]、磷[總磷(TP)、磷酸鹽(PO4-P)]糾正效應，旨在開發(fā)養(yǎng)殖水體中的益生菌，減少海域養(yǎng)殖業(yè)污染，改善水體富營養(yǎng)化，為海水養(yǎng)殖的可持續(xù)發(fā)展及應對生態(tài)風險奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 材料

從江蘇連云港灘涂海水圍塘采集海水作為菌株分離源。

富集培養(yǎng)基(2216E 培養(yǎng)基)、菌株培養(yǎng)用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、馴化進程耐鹽馴化培養(yǎng)基、固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基，均按常規(guī)方法配制。

PCR 試劑為TaKaRa 公司產品，其他藥品和試劑均為國產分析純。

1.2 方法

1.2.1 菌株的分離篩選 用富集培養(yǎng)基富集得到海水樣品菌株，然后利用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基進行菌株分離馴化培養(yǎng)。將馴化后的的菌液稀釋涂布于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基平板上，25 ℃培養(yǎng)48 h，待菌落特征充分顯現后，挑取菌落，記錄菌落數[8]。將平板上長出的菌落逐個劃線純化，篩選得到1株菌株，命名為HYHB-4。

1.2.2 HYHB-4菌株生物學特性測定 對HYHB-4菌株進行形態(tài)學觀察，檢測生長溫度、耐鹽性(根據馴化進程NaCl含量依次為1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%，pH值為7.0)、生長曲線及常規(guī)生理生化特性[8]。

1.2.3 HYHB-4菌株分子生物學鑒定 采用CTAB法提取分離菌株基因組DNA，以基因組DNA為模板，采用16S rRNA的通用引物進行PCR擴增，預期擴增長度為1 133 bp。上游引物：5′-GAGAGTTTGATCCTGGCT-3′，下游引物：5′-CGGCTACCTTGTTACGAC-3′，引物由上海桑尼生物科技有限公司合成。反應條件：95 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，51 ℃復性40 s，72 ℃延伸100 s，30個循環(huán)；72 ℃終止延伸10 min。

PCR產物送上海桑尼生物科技有限公司測序，序列提交GenBank，用MEGA 5.0軟件對16S rRNA進行序列分析及同源性比較，并采用鄰接法 (neighbor-joining,NJ)構建系統(tǒng)進化樹[9]。

1.2.4 HYHB-4菌株制劑固態(tài)發(fā)酵 將HYHB-4菌株交由連云港市榮盛生物科技有限公司，通過固態(tài)發(fā)酵生產形成粉劑微生物制品。發(fā)酵工藝如下：將固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基滅菌冷卻至25 ℃，接種菌株，25 ℃淺盤無菌培養(yǎng)72 h，出料(粉碎、沸騰干燥)，測定菌數及水分。

1.2.5 HYHB-4菌株制劑水環(huán)境中氮磷的糾正效應 試驗點選擇位于連云港大板橋的灘涂梭子蟹和日本囊對蝦混養(yǎng)池塘，面積1.3 hm2，按300 g/hm2施用，相鄰的養(yǎng)殖池塘為對照(不使用任何微生物制劑)。

用WDC-PC水質分析儀測定海水的溫度、鹽度、pH值、溶解氧、電導率。

用WDC-PC水質分析儀測定水樣中NH4-N、NO3-N、NO2-N及TP、PO4-P質量濃度，定時連續(xù)測定5 d。

2 結果與分析

2.1 HYHB-4菌株的生物學特性

形態(tài)學觀察結果顯示，HYHB-4菌株菌落邊緣粗糙，乳白色，半透明，顯微觀察為桿菌，染色結果顯示其具芽孢，穿刺培養(yǎng)結果顯示其具鞭毛，生長適宜溫度為15～35 ℃，最適溫度為25 ℃，超過35 ℃即不能生長，是1株嗜冷菌；生長延遲期較長，培養(yǎng)6 h 后進入對數期，16 h 后進入衰亡期。使用耐鹽馴化培養(yǎng)基培養(yǎng)72 h，結果顯示，HYHB-4 菌株在NaCl含量為1%～9%時均能生長，特別是3%～5%生長得率最高，是1株典型的中度嗜鹽菌。

由表1可以看出，HYHB-4 菌株吲哚試驗、接觸酶試驗、明膠液化試驗、MR試驗均呈陽性，能發(fā)酵葡萄糖，可以利用檸檬酸鹽，VP試驗呈陰性，不能利用淀粉、乳糖。綜上，初步確定HYHB-4菌株為蠟狀芽孢桿菌。

表1 HYHB-4 菌株的生理生化試驗結果

吲哚接觸酶明膠液化MRVP葡萄糖淀粉乳糖檸檬酸鹽++++-+--+

注:+ 表示陽性或有反應； - 表示陰性。

2.2 HYHB-4 菌株16S rRNA序列分析結果

測序結果顯示，16S rRNA PCR擴增片段全長1 133 bp序列，與預期大小一致。將該序列與GenBank數據庫中的序列進行比對，并構建進化樹，進一步確定HYHB-4菌株為蠟狀芽孢桿菌(圖1)。

圖1 HYHB-4 菌株基于16S rRNA序列的系統(tǒng)進化樹

2.3 HYHB-4菌株對水環(huán)境中氮磷的糾正效應

2.3.1 水質參數 試驗期間，試驗組與對照組水質參數差別不明顯，水體中溫度16～20.5 ℃、鹽度29～31、溶解氧37～40 mg/L、pH值7.8～8.2。

2.3.2 氮營養(yǎng)鹽質量濃度 經測定，制備的蠟狀芽孢菌制劑菌含量為1.78×1010cfu/g。對照組NH4-N、NO3-N、NO2-N質量濃度在試驗期間無明顯變化。試驗組NH4-N、NO3-N、NO2-N質量濃度隨著施用蠟狀芽孢菌制劑時間延長持續(xù)下降(圖2)。施用蠟狀芽孢菌制劑前，NH4-N、NO3-N、NO2-N質量濃度分別為465.56、450.55、61.77 μg/L；施用蠟狀芽孢菌制劑5 d后，NH4-N、NO3-N、NO2-N質量濃度分別為106.20、212.00、9.10 μg/L，與施用前相比，NH4-N、NO3-N、NO2-N質量濃度分別下降77.19%、52.95%、85.27%?？梢姡┯孟灎钛挎呔苿λh(huán)境中的氮具有明顯的糾正效應，NO2-N下降幅度最大，其原因不僅在于蠟狀芽孢桿菌對其消耗，也可能存在環(huán)境中硝化細菌對其作用的現象。

圖2 氮營養(yǎng)鹽質量濃度

2.3.3 磷營養(yǎng)鹽質量濃度 測定結果(圖3)顯示，試驗期間，對照組TP和PO4-P質量濃度無明顯變化。在施用蠟狀芽孢菌制劑5 d后，水環(huán)境中TP和PO4-P質量濃度均明顯下降。施用蠟狀芽孢菌制劑前，水環(huán)境中TP和PO4-P質量濃度分別為20.90、20.55 μg/L，施用蠟狀芽孢菌制劑第1天下降趨勢不明顯，從第2天開始，下降幅度逐漸加大，第5天時水環(huán)境中TP和PO4-P質量濃度分別為3.26、3.15 μg/L，比施用蠟狀芽孢菌制劑前分別下降84.40%、84.67%。由此可見，施用蠟狀芽孢菌制劑對磷營養(yǎng)鹽的利用及降解能力非常強。

圖3 磷營養(yǎng)鹽質量濃度

3 結論與討論

對比試驗前后池塘海水氮、磷含量，參照國家水質標準可以看出，池塘海水的氮含量已經大大超標，屬于劣五類水質，總磷含量接近二類水質標準。施用本研究制備的蠟狀芽孢菌制劑5 d后，氮、磷含量指標均達到二類水質標準，說明本研究分離篩選的蠟狀芽孢桿菌HYHB-4 菌株對蝦蟹養(yǎng)殖池塘的海水氮磷具有較強的糾正作用，對封閉式海水池塘的營養(yǎng)鹽利用及降解作用十分明顯，降低海水養(yǎng)殖氮磷排放的污染水平。

蝦蟹混養(yǎng)池塘環(huán)境，由于生產過程的餌料投喂量大，餌料殘余、水生動植物的代謝活動，導致池塘水質難以控制，營養(yǎng)鹽含量豐富，可以滿足微生物生長的營養(yǎng)需要，由于池塘養(yǎng)殖水環(huán)境屬于封閉水體，水體溫度較高，微生物生長迅速。本研究分離的HYHB-4菌株來自海水，環(huán)境適應能力強。本研究結果表明， HYHB-4 菌株對蝦蟹圍塘環(huán)境中的氮、磷具有強烈的利用和降解作用，有利于減少海水圍塘氮磷的排放，改善圍塘底質。此外，由于微生物生長迅速，影響了浮游藻類對營養(yǎng)鹽的吸收，導致浮游藻類生長緩慢，在一定程度上可改善圍塘水質，從而可有效減少圍塘換水次數，增加了養(yǎng)殖動物的生長時間及病害發(fā)生，減低環(huán)境富營養(yǎng)化的壓力，形成良好的生態(tài)環(huán)境。

前人研究表明[10-11]，蠟狀芽孢桿菌對氮的利用能力很強，本研究結果也表明，分離菌株HYHB-4具有較強的利用及降解氮、磷的作用。環(huán)境事件的發(fā)生應該是多因素協(xié)調作用的結果，單一的蠟狀芽孢桿菌HYHB-4菌株對水環(huán)境中氮磷的糾正效應還受其他各種因素的影響。本研究試驗設計沒有涉及其他環(huán)境因子，推廣應用HYHB-4制劑前，應進行深入細致研究，以調控水產養(yǎng)殖生產中的水質，實現養(yǎng)殖污染的零排甚至負排，有利于水產經濟動物的生態(tài)養(yǎng)殖和健康養(yǎng)殖。

[1] 蔡燕紅，項有堂.象山港海水養(yǎng)殖功能區(qū)環(huán)境質量評價[J].海洋通報,2002,21(4):92-95.

[2] 牟海津，李藥，包振民.中國對蝦養(yǎng)成期病害的細菌分析[J].海洋學報(中文版)，1999，21(l):139-145.

[3] 鄭天凌，王海黎，洪華生.微生物在碳的海洋生物地球化學循環(huán)中的作用[J].生態(tài)學雜志，1994，13(4):47-50.

[4] 曲克明，李勃生.對蝦養(yǎng)殖生態(tài)環(huán)境的研究現狀和展望[J].海洋水產研究，2000，21(3):67-71.

[5] 蘇永全,蔡新一,王軍,等.蝦池和海區(qū)細菌數量變動與蝦病發(fā)生關系[J].廈門水產學院學報,1994,16(2):4043.

[6] 鄭天凌,蔡立哲.蛙弧菌在蝦池生態(tài)系中的作用研究[J].海洋科學,1992,2(l):70-72.

[7] Odum H T，Wilson R F.Further studies on reaeration and metabolism of Texas bays，1958—1960[J].Publ Inst Mar Sci Univ Tex,1962,8:23-55.

[8] 杜連祥,路福平.微生物實驗技術[M].北京:高等教育出版社,2006.

[9] 徐滌,秦松,龐國興.青島和大連海區(qū)海帶(Laminariajaponica)外生細菌的16S rRNA基因序列分析[J].高技術通訊,2004,14(2):81-86.

[10] 楊希,劉德立,鄧靈福,等.蠟狀芽孢桿菌好氧反硝化特性研究[J].環(huán)境科學研究,2008,21(3):155-159.

[11] 王磊,周琪,張伯生,等.1,3-二氯苯降解細菌BacilluscereusPF-11 的遺傳選育及其降解特性研究[J].環(huán)境科學學報,2002,22(2):231-235.

Isolation and Identification ofBacilluscereusin Seawater and Its Corrective Effect on Nitrogen and Phosphorus in Water Environment

WANG Hongbin1,WANG Hai1,CHENG Ming2,LI Shihu1
(1.Jiangsu Marine Resources Develepment Research Insititute,Lianyungang 222005,China; 2.Lianyungang Rongsheng Biotechnology Co.,Ltd.,Lianyungang 222524,China)

In order to isolate and identificate probiotic which can inprove the eutrophication effects of aquaculture water,one strain was isolated from the seawater pond of Lianyungang in Jiangsu province,the strain was named by HYHB-4.From morphological characteristics and physiological and biochemical characteristics,combined with the 16S rRNA sequence analysis,the strain preliminarily identified asBacilluscereus.The corrective effect of nitrogen and phosphorus of the strain to the water environment in shrimp and crab polyculture pond were investigated.The results showed that the strain HYHB-4 moderate halophilic and psychrophilic,the optimum growth temperature was 25 ℃,and it would stop growing exceeding 35 ℃.The growth was highest in 3%—5% salinity.The strain HYHB-4 had significant transformation and degradation function to the nitrogen and phosphoru of water environment in shrimp and crab polyculture pond.The NO2-N had the largest decline.After using five days,the concentrate of NH4-N,NO3-N,NO2-N respectively decreased by 77.19%,52.95%,85.27% than the starting level.The TP and PO4-P respectively decreased by 84.40%,84.67% than the starting level.The experiment confirmed that the strain HYHB-4 had a significant corrective effect on the nitrogen and phosphoru of water environment in shrimp and crab polyculture pond.

aquaculture water;Bacilluscereus; isolation and identification; nitrogen; phosphorus; corrective effect

2015-10-12

江蘇省科技廳農業(yè)支撐項目(BE2014336)；連云港市農業(yè)科技成果示范計劃項目(SF1216)

王洪斌(1966-)，男，江蘇連云港人，教授，主要從事微生物生物技術方面的研究。 E-mail：lygwhbly@126.com

S949

A

1004-3268(2016)04-0134-04