陳黃曌，劉延波，余海尤，鄧曉旭，王永芬

（河南牧業(yè)經(jīng)濟學院生物工程學院，鄭州 450046）

研究基因沉默途徑的幾種篩選系統(tǒng)概述

陳黃曌，劉延波，余海尤，鄧曉旭，王永芬

（河南牧業(yè)經(jīng)濟學院生物工程學院，鄭州 450046）

在真核生物中，基因表達的表觀遺傳控制，在應對病毒入侵、轉座子易位和轉基因片段插入過程中，發(fā)揮著重要作用。在植物中，轉基因和內源基因的沉默，主要通過轉錄基因沉默（transcriptional gene silencing，TGS）或者轉錄后基因沉默途徑（posttranscriptional gene silencing，PTGS）。TGS通常是由轉入基因的多拷貝或由轉基因片段插入到了染色體的特定區(qū)域引起的，受內源基因啟動子啟動的轉基因表達，可能會導致轉基因及該內源基因的沉默，該過程可能通過RNAs介導完成。擬南芥屬雙子葉開花植物，花期較短，且已經(jīng)完成全基因組測序及注釋工作。目前，作為一種模式研究植物，植物表觀遺傳學研究者利用擬南芥，通過遺傳篩選結合蛋白和分子生物學方法，研究DNA甲基化、組蛋白修飾和基因表達調控的表觀遺傳分子機制，通過構建不同的篩選系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)，參與到RdDM（RNA-directed DNA methylation）及其它途徑中的新基因，并借助轉錄組學和蛋白組學研究工具，具體闡明該新發(fā)現(xiàn)基因，在整個甲基化調控中的作用機理。文章以甲基化調控為研究對象，對當前具有代表性的篩選系統(tǒng)做概括介紹。

DNA甲基化 基因沉默 RdDM 篩選系統(tǒng)

與原核生物不同，真核生物的遺傳信息儲存，在以組蛋白八聚體包裹著DNA組成的核小體中，并以染色質形式存在。因此，基因的表達調控就不可避免地受到DNA和組蛋白表觀遺傳修飾的影響，尤以DNA甲基化修飾最為常見［1］。DNA甲基化是指，在胞嘧啶堿基端添加一個甲基基團。在哺乳動物中，DNA甲基化專一性的發(fā)生在對稱的CG背景下，占到了整個基因組比例的70%～80%；在植物中，DNA甲基化發(fā)生在以下的序列背景：對稱的CG、CHG和不對稱的CHH（H = A T or C）。其中，CG和CHG序列背景下的甲基化，主要是由MET1 和CMT3兩個基因編碼蛋白維持的，而CHH序列背景下的DNA甲基化則由DRM2基因編碼蛋白從頭合成來維持的，與哺乳動物不同，植物中DNA甲基化，主要發(fā)生在轉座子和其它DNA重復序列原件［2］。

植物中DNA甲基化的從頭合成，最初被發(fā)現(xiàn)是由小RNA介導的［3］，目前已被命名為RdDM（RNA指導下的DNA甲基化）途徑，PolIV和PolV（DNA依賴的RNA聚合酶）是植物所編碼特有的兩個聚合酶，也是RdDM所必需的［4］。在RdDM途徑中，由PolIV轉錄產生的單鏈RNA，經(jīng)RDR2（RNA依賴的RNA聚合酶）基因編碼蛋白被合成雙鏈，之后，由DCL3基因編碼蛋白被加工為24 nt siRNA，并以單鏈形式被轉載到AGO4蛋白上，形成AGO-siRNA復合體。同時，由PolV在靶位點轉錄產生的非蛋白編碼基因轉錄本作為支架［5］。研究表明，KTF1基因編碼蛋白可以結合由PolV轉錄產生的scaffolds，并招募AGO4蛋白形成AGO-siRNA復合體，并與IDN2蛋白和DDR復合體形成更大的RdDM效應子蛋白復合體，之后，該效應子蛋白復合體，通過一種未知的機制招募到DNA甲基轉移酶和組蛋白甲基轉移酶到基因組特定位點，從而實現(xiàn)對靶位點的甲基化沉默［6］。

1 RD29Apro：LUC 篩選系統(tǒng)

RD29A是植物逆境脅迫應答基因，啟動子區(qū)域含有ABA、干旱、鹽和冷脅迫應答元件［7］。朱健康實驗室將RD29A啟動子與LUC基因連接，構建成為RD29Apro：LUC表達系統(tǒng)轉入到野生型擬南芥C24中，轉基因的擬南芥因此獲得2個甚至以上RD29A啟動子的拷貝數(shù)。經(jīng)過多代篩選后，獲得RD29A-LUC轉基因穩(wěn)定表達的株系，對該株系進行EMS誘變處理后，在M2代中，經(jīng)過鹽處理后篩選異常發(fā)光的突變體［8］，經(jīng)過篩選發(fā)現(xiàn)其中一個突變體，在經(jīng)過鹽脅迫處理后，失去發(fā)光能力。以此，將該突變體命名為ros1。通過圖位克隆，對該位點進行精細定位，并進行克隆測序，結果顯示，該ROS1基因編碼具有Ⅲ型核酸內切酶功能域核蛋白，和參與DNA損傷修復的HhH-GPD超家族蛋白，具有顯著的相似性。關于其功能的描述有兩種假說：一種認為ROS1蛋白可能參與阻止由smRNAs引發(fā)的DNA甲基化反應；另一種學說則認為ROS1蛋白直接作用DNA的去甲基化反應，從而抑制特定DNA序列的過度甲基化水平［9］。該實驗結果得出的結論與后一種假說一致，在ros1突變體中，由于ROS1蛋白去甲基化功能的缺失，整個基因組甲基化水平處于較高的狀態(tài)，因此，轉基因被沉默，報告基因不會發(fā)出熒光。在此基礎上，以該ros1突變體為背景，實驗室又構建出一種篩選系統(tǒng)，即RD29Apro：LUC/ros1篩選系統(tǒng)。

2 SDCpro：GFP篩選系統(tǒng)

研究表明，SDC（Suppressor of drm2cmt3）基因在擬南芥多個組織中的表達，受到DRM2和 CMT3的表達抑制，因此，SDC的表達沉默在drm2cmt3雙突變體中，而非各自單突變體中能夠得到釋放，SDC基因啟動子區(qū)域含有7個串聯(lián)重復區(qū)域，可招募結合DNA甲基化蛋白，進而引起該基因的沉默。通過分子操作實驗，將SDC啟動子和綠色熒光蛋白GFP連接構建融合表達篩選系統(tǒng)，將含有該SDCpro：GFP的融合載體，通過農桿菌侵染轉入野生型擬南芥中，由于SDC啟動子區(qū)域串聯(lián)重復序列的存在，轉基因擬南芥中GFP基因的表達因此被沉默，通過EMS突變處理后，從中篩選出GFP基因表達沉默被釋放的突變體。Steven E. Jacobsen實驗室通過該種方法，成功尋找到參與到甲基化沉默途徑的新基因AtMORC6［10］。研究表明，基因編碼蛋白含有一保守的腺苷三磷酸酶結構域［11］，可能參與了染色質超級結構的重塑化過程，其作用機理可能是通過與RdDM途徑中的DMS3蛋白相互作用，參與到RdDM過程，實現(xiàn)對轉錄抑制的調控，也有的研究直接將AtMORC6/DMS11列為RdDM作用機制中的一個新成員基因。AtMORC6基因的發(fā)現(xiàn)證明，SDCpro：GFP篩選系統(tǒng)，可以成功的用于篩選參與甲基化調控途徑的新成員基因，且SDC作為RdDM途徑直接作用的靶位點［12］，受甲基化影響而沉默，使得該篩選系統(tǒng)更具有針對性。該系統(tǒng)的創(chuàng)新之處，就在于利用植物了內源基因，啟動子區(qū)域特有的重復序列結構，作為研究途徑的靶位點兩大優(yōu)勢，特異性地篩選新功能基因。

3 d35S：LUC-AP2篩選系統(tǒng)

LUC（LUCIFERASE）常作為報告基因被轉入作為水稻和煙草中，通過與底物反應發(fā)出熒光，借此研究轉基因表達。陳雪梅實驗室將兩個35S啟動子串聯(lián)排列，分別啟動LUC和NPTⅡ（抗性篩選標記）基因表達，構建雙元35S啟動子融合熒光素酶表達系統(tǒng)構建篩選系統(tǒng)，并與LUC基因末端融合一段AP2序列。該AP2序列包含miR172 結合位點，形成d35S：LUC-AP2和d35S：NPTⅡ結構。該系統(tǒng)同時篩選分別參與RdDM和miRNAs介導的轉錄后基因沉默途徑的新基因，為消除轉錄后基因沉默造成的影響，該表達系統(tǒng)通過農桿菌被轉入到rdr6突變體中［13-14］，分離得到LUC信號中等強度水平的株系，將其命名為LUCH（LUC repressed by CHH methylation），通過EMS誘變處理后，從中篩選熒光信號高和低強度的突變體，并通過該系統(tǒng)篩選得到已知的參與DNA甲基化修飾的MOM1和ROS1等基因。除此之外，該系統(tǒng)同時篩選得到一新基因AMP1。該基因編碼產物為一膜整合蛋白，與內質網(wǎng)和AGO1相關聯(lián)，AGO1是與膜相關的主要miRNAs效應子蛋白［15］，表明該蛋白主要參與擬南芥miRNAs介導的翻譯抑制過程［14］，miRNAs主要通過作用于target mRNAs實現(xiàn)翻譯的抑制調控。但，該發(fā)生過程的亞細胞定位一直沒有被闡明，通過對AMP1亞細胞定位的鑒定和miRNAs作用的target mRNAs的分布研究，證實了miRNA介導的翻譯抑制過程發(fā)生在內質網(wǎng)上。

目前，文獻已報道的篩選系統(tǒng)，遠不止于以上3種，調控植物甲基化的方式也不止于RdDM、

DDM1等。從就目前已經(jīng)報道的篩選系統(tǒng)所得到的結果可看出，某些基因，如典型的RdDM途徑蛋白AGO4及不依賴于RdDM途徑的MOM1蛋白，在不同的篩選系統(tǒng)中，幾乎都可以被重復篩到，表明基因沉默的機理本身十分復雜，不同的沉默途徑之間并不是嚴格獨立的，相互之間可能存在著功能上的部分重疊，甚至是相互作用。隨著研究的深入，多數(shù)篩選系統(tǒng)對新基因的發(fā)掘趨于飽和，使新基因的發(fā)掘越來越有限。未來的研究，可能要通過構建更加具有針對性的篩選系統(tǒng)，對介導甲基化沉默的不同通路之間的相互作用，進行深入探究，進一步揭示表觀遺傳學的分子機理。

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