韋陽道, 易 弋, 梁建榮, 羅福廣, 楊 軍, 黃 杰

(1．廣西科技大學(xué)生物與化學(xué)工程學(xué)院 , 廣西柳州545006 ； 2. 柳州市魚家樂飼料有限公司 ,廣西柳州545002 ； 3. 柳州市漁業(yè)技術(shù)推廣站 , 廣西柳州545006)

匙吻鱘致病性豚鼠氣單胞菌的分離鑒定和致病性研究

韋陽道1, 易 弋1, 梁建榮2, 羅福廣3, 楊 軍3, 黃 杰3

(1．廣西科技大學(xué)生物與化學(xué)工程學(xué)院 , 廣西柳州545006 ； 2. 柳州市魚家樂飼料有限公司 ,廣西柳州545002 ； 3. 柳州市漁業(yè)技術(shù)推廣站 , 廣西柳州545006)

為了確定匙吻鱘發(fā)病的原因， 從患病匙吻鱘的表皮組織中分離病原菌， 對其進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察、 生理生化試驗(yàn)和16S rDNA基因的擴(kuò)增并經(jīng)序列分析構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹， 同時(shí)測定該菌株的致病能力和對藥物的敏感性， 結(jié)果表明，該菌株為豚鼠氣單胞菌(Aeromonascaviae)。 人工感染試驗(yàn)結(jié)果顯示，分離菌株對匙吻鱘具有很強(qiáng)的致病性， 并同時(shí)對禾花鯉和羅非魚也有較強(qiáng)的致病性。 藥物敏感結(jié)果顯示，分離菌株對磺胺二甲嘧啶、多黏菌素B、 氟苯尼考等5種藥物完全耐藥， 對左氧沙星、 鏈霉素、 恩若沙星等10種藥物的敏感性較強(qiáng)。

匙吻鱘 ； 分離 ； 鑒定 ； 豚鼠氣單胞菌 ； 16S rDNA

匙吻鱘別名鴨嘴鱘、匙吻貓魚、匙吻白鱘，隸屬鱘形目匙吻鱘屬，具有肉質(zhì)鮮美，吻部富含膠原蛋白，營養(yǎng)價(jià)值高的特點(diǎn)，是一種特種淡水養(yǎng)殖魚類，隨著生活水平的提高，該魚的養(yǎng)殖規(guī)模逐漸擴(kuò)大[1-2]。但隨著養(yǎng)殖規(guī)模擴(kuò)大和日常管理不完善等諸多原因，細(xì)菌性疾病逐漸在該養(yǎng)殖品種中暴發(fā)，給養(yǎng)殖戶帶來了一定的經(jīng)濟(jì)損失。目前，已報(bào)道的鱘魚致病菌有嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)[3]、海豚鏈球菌(Streptococcusiniae)[4]以及類志賀鄰單胞菌(PlesiomonasShigelloides)[5]等。豚鼠氣單胞菌(A.caviae)屬于氣單胞菌屬，常見于淡水和污水中，是一種對魚、哺乳動(dòng)物都有致病性的病原菌，可以引發(fā)水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物多種疾病，例如出血病[6]、皮膚潰爛[7]、敗血癥[8]、腹水病[9]等。就現(xiàn)有的資料來看，目前尚未有關(guān)該致病菌感染匙吻鱘的報(bào)道，本文首次報(bào)道了豚鼠氣單胞菌侵染匙吻鱘并具有致死的能力。2015年8月廣西柳州市某匙吻鱘養(yǎng)殖場出現(xiàn)暴發(fā)性疾病，病魚表現(xiàn)癥狀為皮膚潰爛、肛門紅腫、肝脾腎腫大。筆者從患病匙吻鱘的表皮組織中分離得到1株致病菌并命名為GXKJDX02。通過形態(tài)學(xué)觀察、16S rDNA序列進(jìn)化樹分析和生理生化試驗(yàn)鑒定為豚鼠氣單胞菌(A.caviae)。本研究通過人工感染試驗(yàn)和藥敏試驗(yàn)旨在為匙吻鱘的細(xì)菌性疾病的防控提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料 患病的匙吻鱘采集于廣西柳州市某匙吻鱘養(yǎng)殖場；感染試驗(yàn)用的健康匙吻鱘、禾花鯉和羅非魚由本地養(yǎng)殖戶提供；腦心浸液肉湯(BHI)培養(yǎng)基、細(xì)菌微量生化鑒定管、革蘭陰性桿菌藥敏試劑盒，均購自杭州天和微生物試劑有限公司；血平板，購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；DNA Marker DL-5 000，購自寶生物工程(大連)有限公司。預(yù)混DNA聚合酶、膠回收試劑盒和質(zhì)粒提取試劑盒，購自天根生化科技(北京)有限公司；引物和測序由廣州英駿生物技術(shù)有限公司完成。

1.2 病原菌的分離與純化 將消毒接種針迅速刺入消毒后的患病匙吻鱘損傷表皮組織和心、肝、脾、腎部分進(jìn)行采樣，接種于血平板，37 ℃恒溫培養(yǎng)12 h 后，挑取單菌落繼續(xù)劃線分離至純化。

1.3 形態(tài)學(xué)觀察 通過純培養(yǎng)，獲得單一的致病性菌株，在血平板上觀察其溶血情況。挑取菌體，經(jīng)革蘭染色后于顯微鏡下觀察菌體形態(tài)。

1.4 16S rDNA序列分析 以27F(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)和1492R(5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’)為引物，純培養(yǎng)后的菌液作為模版，對分離細(xì)菌的16S rDNA進(jìn)行擴(kuò)增。PCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸2 min，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳后進(jìn)行膠回收，送到廣州英駿生物技術(shù)有限公司測序。將測序所得基因序列提交至GenBank數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對。根據(jù)比對結(jié)果，利用MEGA6.0軟件用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.5 生化特性測定 參照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》(東秀珠,2001)和文獻(xiàn)[10]相關(guān)菌株的鑒定內(nèi)容，采用細(xì)菌微量生化鑒定管對分離菌株進(jìn)行生理生化試驗(yàn)。

1.6 藥物敏感試驗(yàn) 使用革蘭陰性菌藥敏試劑盒，按常規(guī)紙片法進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，并按說明書給出的標(biāo)準(zhǔn)判定菌株對藥物的敏感度。1.7 人工感染試驗(yàn) 將分離菌株接種到BHI培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)12 h后，使用0.85%無菌生理鹽水洗滌并制備濃度為1×109CFU/mL的細(xì)胞懸液。選擇用曝氣水飼養(yǎng)5 d的健康的匙吻鱘(約150 g/尾)、禾花鯉(約100 g/尾)和羅非魚(約100 g/尾)，30尾/組，胸鰭注射0.1 mL/尾的菌液。同時(shí)設(shè)立對照組，注射等量的無菌生理鹽水。水溫約27 ℃隔離飼養(yǎng)，觀察發(fā)病癥狀及死亡情況，連續(xù)觀察1周。

2 結(jié)果

2.1 形態(tài)學(xué)觀察 GXKJDX02菌株在血平板上形成透明、圓潤、隆起、黏稠的菌落，呈明顯溶血性，革蘭染色呈陰性，短桿菌。

2.2 16S rDNA序列分析結(jié)果 PCR擴(kuò)增GXKJDX02菌株的16S rDNA基因，電泳結(jié)果顯示，目的基因片段大小約為1 500 bp(見圖1)。

同源序列比對結(jié)果顯示:GXKJDX02菌株的16S rDNA序列與菌株Aeromonas caviae strain N25、Aeromonas caviae strain T84的16S rDNA序列相似度達(dá)100%；進(jìn)化樹分析結(jié)果顯示，GXKJDX02菌株與Aeromonas caviae strain N25、Aeromonas caviae strain T84菌株聚為一類(圖2),初步確定GXKJDX02菌株為豚鼠氣單胞菌(A.caviae)。

圖1 16S rDNA的PCR擴(kuò)增結(jié)果

M：DL-5 000 Marker; 1：16S rDNA的PCR產(chǎn)物

2.3 生理生化特性 經(jīng)過生理生化特性測定，GXKJDX02菌株表現(xiàn)為：側(cè)金盞花醇、鳥氨酸脫羧酶、肌醇等為陰性；精氨酸雙水解酶、葡萄糖產(chǎn)酸、氧化酶等為陽性，除苯丙氨酸、木糖、甲基紅外，各反應(yīng)與《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》生化反應(yīng)結(jié)果一致，因此進(jìn)一步確定GXKJDX02菌株為豚鼠氣單胞菌(A.caviae)，見表1。

2.4 藥物敏感試驗(yàn)結(jié)果 細(xì)菌藥物敏感性結(jié)果見表2,由表2可知，GXKJDX02菌株對青霉素G、多黏菌素B、磺胺二甲嘧啶、氟苯尼考、復(fù)方新諾明表現(xiàn)出較強(qiáng)的耐藥性；對鏈霉素、紅霉素、氧氟沙星等10種藥物具有高度的敏感性；對萬古霉素、新生霉素、頭孢曲松的敏感性介于兩者之間。

表2 GXKJDX02菌株藥敏試驗(yàn)結(jié)果

R: 耐藥； I: 中介； S: 敏感

2.5 人工感染試驗(yàn)結(jié)果 人工感染試驗(yàn)結(jié)果見表3。人工感染一周后，匙吻鱘的死亡率為100%，禾花鯉的死亡率為90%，羅非魚死亡率為100%，對照組無死亡。從死亡的匙吻鱘、禾花鯉和羅非魚體內(nèi)分離純化得到的菌株，經(jīng)16S rDNA鑒定同為豚鼠氣單胞菌(A.caviae)。

表3 人工感染試驗(yàn)

3 討論

從患病的匙吻鱘體內(nèi)分離得到病原菌GXKJDX02，通過形態(tài)學(xué)觀察、16S rDNA的序列分析、生理生化試驗(yàn)最終確定該致病性菌株為豚鼠氣單胞菌(A.caviae)。徐海圣等研究中華絨螯蟹來源的豚鼠氣單胞菌的木糖試驗(yàn)為陰性[10]；吳亞文等研究草魚豚鼠氣單胞菌生化特征顯示，L-阿拉伯糖、甘露醇為陰性[11]；這與本研究的生化特征不符，這可能是菌株間的差異造成的。

由于在水產(chǎn)養(yǎng)殖的過程中廣泛的使用抗菌藥物進(jìn)行防治，以及菌株間生理特征的差異，導(dǎo)致了不同環(huán)境的豚鼠氣單胞菌菌株對藥物的敏感性不同。例如許信剛等研究表明，金魚豚鼠氣單胞菌對四環(huán)素、慶大霉素、青霉素G、卡那霉素等敏感；對頭孢他啶、鏈霉素、利福平等中度敏感；對萬古霉素、頭孢哌酮、紅霉素等有耐藥性[12]；在李梅等的研究中，南美白對蝦豚鼠氣單胞菌對氯霉素、土霉素、頭孢拉定等敏感；對多黏菌素B、氟哌酸、林可霉素等不敏感[13]；王海娟等的研究表明，鱸魚豚鼠氣單胞菌對強(qiáng)力霉素、四環(huán)素、慶大霉素等藥物敏感；對紅霉素、多黏菌素B等藥物中度敏感；但對復(fù)方新諾明、利福平、氨芐西林/舒巴坦等藥物不敏感[14]。本試驗(yàn)研究表明，GXKJDX02菌株對青霉素G、多黏菌素B、磺胺二甲嘧啶等表現(xiàn)出高度耐藥性，對鏈霉素、紅霉素、氧氟沙星等敏感；對萬古霉素、新生霉素、頭孢曲松等中度敏感。與以上研究略有不同，其原因與養(yǎng)殖環(huán)境中使用藥物的種類及使用量有一定關(guān)系。

匙吻鱘作為一種特種的淡水養(yǎng)殖魚類，在已有的報(bào)道中，其致病菌有嗜水氣單胞菌、海豚鏈球菌等。經(jīng)查閱國內(nèi)外的文獻(xiàn)，沒有發(fā)現(xiàn)關(guān)于豚鼠氣單胞菌對其致病的報(bào)道。本文首次報(bào)道了豚鼠氣單胞菌作為匙吻鱘致病菌的案例。在本文人工感染試驗(yàn)中,匙吻鱘飼養(yǎng)1 d，死亡率高達(dá)100%，在死亡后的魚體的心、肝、脾等器官中均分離出了豚鼠氣單胞菌。而在最初的采樣中僅在受傷的表皮中分離得到一株致病菌，其內(nèi)部組織中沒分離到。我們認(rèn)為，這可能是該匙吻鱘皮膚受傷，導(dǎo)致豚鼠氣單胞菌入侵，出現(xiàn)皮膚潰爛，魚體出現(xiàn)病癥，由于發(fā)現(xiàn)及時(shí)，該致病菌未能侵入體內(nèi)組織造成的。通過人工感染試驗(yàn)，我們發(fā)現(xiàn)該菌株對禾花鯉、羅非魚的也有較強(qiáng)的致病能力，試驗(yàn)結(jié)果表明，禾花鯉飼養(yǎng)2 d后，死亡率為90%；羅非魚飼養(yǎng)1 d，死亡率為100%，目前尙沒有關(guān)于豚鼠氣單胞菌感染羅非魚的報(bào)道。因此我們認(rèn)為該菌也是羅非魚潛在致病菌。

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Polyodon spathula Pathogenic Aeromonas caviae isolation and pathogenicity research

WEI Yang-dao1, YI Yi1, LIANG Jian-rong2, LUO Fu-guang3, YANG Jun3, HUANG Jie3

(1.College of Biological and Chemical Engineering , Guangxi University of Science and Technology , Liuzhou 545006 , China ; 2. Liuzhou Yujiale Feed Limited Company ， Liuzhou 545006 , China ; 3. Liuzhou Fishery Technical Extension Station , Liuzhou 545002 , China)

In order to study the pathogen of the diseased paddlefish, we isolated the pathogen from diseased paddlefish in the epidermis. Its morphological characteristics, physiology and biochemistry experiments, 16S rDNA genes, phylogenetic tree and drug susceptibility were studied. The results indicated that the strain is theAeromonascaviae. Artificial infection experiment results showed that the strain had strong pathogenicity. At the same time, it had high pathogenicity to the procypris merus and tilapia. The results of drug sensitivity test showed that the isolated strain was resistant to 5 medicines, including sulfamethazine, polymyxin B, and florfenicol. However, it had a strong sensitive to 10 kinds of medicines inclduing levofloxacin, Streptomycin, and Enrofloxacin.

paddlefish; isolation; identification; Aeromonas caviae; 16S rDNA

HUANG Jie

2016-04-28

現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系專項(xiàng)資金項(xiàng)目(CARS-49)；柳州市科學(xué)與技術(shù)開發(fā)計(jì)劃課題(2013E020602)

韋陽道(1989-)，男，碩士生，研究方向?yàn)槲⑸锓肿由飳W(xué)，E-mail：wyangdao@outlook.com

黃杰，E-mail：7877480@qq.com

S943

A

0529-6005(2016)12-0089-03